抗原抗体反应实验

抗原抗体反应实验

antigen-antibodyreaction

抗原抗体反应

概念基本原理特点影响因素应用范围一、概念抗原和抗体的特异性结合反应体内产生保护效应造成病理损伤体外多种表现形式:凝集,沉淀,补体结合,中和等.二.基本原理抗原和抗体分子结构及立体构型的互补

抗原-抗体结合力疏水作用,氢键,范德华引力,静电吸引作用TheconceptofAg-AbinteractionThecombiningsiteofanantibodyislocatedintheFabportionofthemoleculeandisconstructedfromthehypervariableregionsoftheheavyandlightchains.X-RaycrystallographystudiesofantigensandantibodiesinteractingshowsthattheantigenicdeterminantnestlesinacleftformedbythecombiningsiteoftheantibodyasillustratedinFigure.Thus,ourconceptofAg-Abreactionsisoneofakey(i.e.theAg)whichfitsintoalock(i.e.theAb).4typesofnoncovalentforces三.特点特异性和交叉反应可逆性一定条件下（低pH、高浓度盐、冻融等）→抗原-抗体可被解离最适比例

反应体系中抗原/抗体最适比例→决定反应结果的关键因素四.影响因素(一)反应物自身因素1.抗体*来源:不同动物免疫血清具反应差异。*特异性与亲和力：难以两全其美。*浓度：必须滴定抗体。2.抗原*理化性质、表位多寡和种类(二)环境条件1.电解质不可缺少2.酸碱度pH6-83.温度15-40c4.时间规定时间五.应用范围用已知抗原检测未知抗体用已知抗体检测未知抗原大分子物质药物、激素和炎性介质等各种半抗原物质

抗原抗体反应的基本类型

1.Precipitation---2.Agglutination---3.Radioimmunoassay4.Enzyme-linkedImmunosorbentAssay5.Immunofluorescence6.WesternBlotting7.FlowCytometryandFluorescence8.ImmunoelectronMicroscopy本次实验涉及的抗原抗体反应1.沉淀反应（Precipitation）---

可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生结合而出现的沉淀现象。

2.凝集反应（Agglutination）---

颗粒性抗原与相应抗体结合后所呈现的肉眼可见的凝集现象。沉淀反应分类:液相沉淀：以无机盐缓冲液为介质。琼脂扩散：以凝胶为介质。

-radialimmunodiffusion（单相扩散）

-doubleimmunodiffusion（双相扩散）凝胶免疫电泳：在直流电场中进行的凝胶扩散。

-rocketimmunoelectrophoresis（火箭电泳）沉淀反应特点:液相沉淀：Ag、Ab自由接触，需时短。琼脂扩散：Ag、Ab在固相化的凝胶中扩散，比液相慢，但Ag／Ab复合物不易散开，位置稳定，适合染色分析，可长期保存结果。凝胶免疫电泳：

在电场下扩散和反应速度加快，节省时间。电场规定了扩散方向，使反应集中，灵敏度提高。免疫沉淀反应(precipitation)

原理可溶性抗原+抗体白色沉淀内容单向定量免疫电泳(火箭电泳)琼脂糖双向免疫扩散单向定量免疫电泳(火箭电泳)

把抗原放在含有抗体的凝胶内电泳，其沉淀弧形似火箭。当定量的抗原在含有适量抗体的琼脂中泳动时，走在前面的抗原遇到琼脂中的抗体时，达到适当比例时形成大的不溶性复合物而发生沉淀，不再移动；未与抗体结合的抗原以及较小的可溶性复合物可穿过此沉淀继续向前迁移，形成新的沉淀，但沉淀带越来越窄，直至全部抗原与抗体结合形成火箭峰样沉淀。抗原含量越高，火箭峰越长。

单向定量免疫电泳(火箭电泳)

将抗体混入琼脂内;将待测样品（抗原）加入琼脂一端的加样孔中，进行电泳;抗原在电泳时与抗体反应，比例合适时形成锥形沉淀峰（形如火箭）,峰高与抗原含量成正比;以标准抗原的浓度为横坐标，峰高为纵坐标，绘制标准曲线，即可根据峰高从标准曲线中得出待测样品中的抗原含量。

*实验流程抗体+琼脂琼脂板打孔数个(孔与板缘距离1cm)

加入样品(由低浓度到高浓度)电泳1:21:41:81:161:3250ul稀释液50ul血清50ul50ul倍比稀释：12341－5管分别加入50l稀释液加入50l原液于第1管，这样第1管被稀释为1：2No.C1:11:21:41:81:16从1管吸出50l，加入2管，2管的浓度为1管的一半（1：2）倍比稀释打孔templateagaroseslide将胶版置于模板上，用打孔器在琼脂板的一端垂直，间隔均匀地打一排小孔，用针头小心，完整地挑出孔中琼脂加样每孔小心加入10l

样品

1－5孔加入1:32,1:16,1:8,1:4,1:2的标准品

剩下一孔加入待测样品。1:32,1:16,1:8,1:4,1:2,sample电泳+将琼脂板放入电泳槽电泳:80v,

2－3h.-实验步骤1.取熔化并冷却至50°c的1%琼脂糖凝胶，加入anti-IgG抗体，混匀后浇至玻璃板上。2.凝固后，如下图打孔。3.第1-5孔加入10l经倍比稀释的标准血清样品------1:32，1:16，1:8，1:4，1:2。第6孔加入待测血清。4.将琼脂板放入电泳槽，用滤纸与电泳槽搭桥连接，样品孔一端接负极。电泳80v，2~3h。（-）（+）实验步骤5.取出琼脂板，在0.5%考马斯亮蓝中染色，6%醋酸脱色。6.从加样孔的圆心到峰尖量取各孔样品沉淀峰的高度。以抗原浓度为横坐标,峰高为纵坐标绘制标准曲线。根据标准曲线，计算待测样品中抗原的含量。Rocketeletrophoresis琼脂糖双向免疫扩散实验原理：

将Ag与Ab两种溶液置于琼脂糖凝胶的不同位置，使两者都在凝胶中自由扩散，抗原与抗体相遇并在比例合适处形成可见的乳白色沉淀线。沉淀线的数目、位置、形状等，与抗原或抗体的纯度、浓度、扩散速度等有关。琼脂糖双向免疫扩散

*实验流程：铺制琼脂糖凝胶板

打孔(梅花型)中心孔内加入抗IgG血清,其余加入待检血清，37c，24h。

DoubleImmunodifusion实验步骤

将已溶化的1%生理盐水琼脂糖3~4ml倾注在玻片上制成厚薄均匀的凝胶板。待凝固后，打梅花孔（如下图）。在中心孔内用加样器加入10lanti-IgG血清（抗体）。在第1~5孔内分别加入10l经系列倍比稀释---1：32，1：16，1：8,1：4，1：2的待测血清样品（抗原），在第6孔内加入生理盐水对照。243165实验步骤

5.将凝胶板放湿盒中，37c,24h后观察结果，以出现明显沉淀线的最大稀释的抗体孔为终点孔，终点孔中抗体的稀释倍数（最高稀释度）即为该待测血清IgG的效价。243165凝集反应(agglutination)

*原理颗粒性抗原（细菌、红细胞等）与相应抗体结合→肉眼可见的凝集物*方法直接凝集、间接凝集、间接凝集抑制试验直接凝集试验-血型鉴定实验原理：

血型抗原－红细胞表面的同种异型抗原以人类红细胞表面A、B抗原不同：A、B、AB、O血型同一人血清中不含与本人血型抗原相应的抗体：

表型 血型抗原 血型抗体 A型 A 抗BB型 B 抗AAB型 AB －O型 H 抗A抗B

由抗A单抗及抗B单抗可以通过凝集现象鉴定人ABO血型。 凝集现象 血型 抗A单抗 抗B单抗 + - ?

- + ?- - ? + + ?

实验步骤玻片法：

采集志愿者静脉血2ml,注入盛有肝素的无菌小瓶中，轻轻摇匀，使血液抗凝。取清洁载玻片，用记号笔划分A、B两半。于A侧中央加抗A试剂（蓝色），B侧加抗B试剂（黄色）各一滴。用滴管取受检者全血加入至玻片中的抗A、B试剂，摇动玻片使