人源抗狂犬病毒特免血浆筛查方法的建立

人源抗狂犬病毒特免血浆筛查方法的建立【摘要】

目的

用ELISA法对人源抗狂犬病毒抗体血浆进行筛查。办法

采用国内几家狂犬病毒IgG抗体诊断试剂盒〔ELISA法〕，结合小鼠中和试验测定法，对经0、3、7、14、28日程序免疫的供浆员之血样进行抗狂犬病毒抗体效价检测。结果

与小鼠脑内中和法比拟，使用不同厂家ELISA试剂盒，检测结果存在一定差别，其中C、D厂家试剂盒检测结果比拟接近，线性关系较好〔分别为：r＝0.997；r＝0.996〕，可以替代小鼠脑内中和法作为采浆站血浆初筛的办法。结论

经过反复筛选与比拟，为大规模筛查抗狂犬病毒特免血浆提供了技术条件。【关键词】抗狂犬病毒抗体；狂犬病疫苗；ELISA；检测；中和试验

Establishmentofmethodtoscreeninghumananti-rabiesviruspositiveplasma

【Abstract】Objective

ThepositivehumanplasmacontainingantibodyagainstrabiesviruswasscreenedwithELISAkit.Methods

TheIgGantibodydiagnostickits(ELISAmethod)obtainingfromseveralmanufacturesinourcountrywereadoptedtoscreentheantirabiesviruspositiveplasmacombiningwiththemiceneutralizationtest.Thelevelofantibodyagainstrabiesviruswasdeterminedinbloodsamplesofdonorsthatwereimmunizedwithrabiesvaccineondays0,3,7,14and28inschedule.Results

ItshowedthattestresultsofELISAkitproducedinmanufactureCandDissimilar,theirlinearcorrelationisbetter(rc=0.997,ra=0.996respectively).Conclusion

ThemiceneutralizationtestcanbereplacedbyELISAkitmethods.

【Keywords】antibodyagainstrabiesvirus；rabiesvaccine；ELISA；neutralizationtest；screening

狂犬病是一种严重危害人类生命的人畜共患疾病，主要通过带狂犬病毒的动物传播给人类，发病后致死率为100％。据卫生部2022年10月颁布的数字说明，病死率仍居我国法定传染病的第2位，据调查，近年来狂犬病发病呈回升趋势，目前尚无治疗狂犬病的有效药物。虽然狂犬病抗血清对预防狂犬病起着重要作用，但其来源因系异源性蛋白而副反馈较大，使用中易发生变态反馈和血清病，其发生率为15％～45％［1］，而且对某些疫苗的抗体反馈有抑制作用［2］，使用人源狂犬病免疫球蛋白〔HRIG〕那么克服了上述缺点，与异源抗体相比，具有在血液中维持时间较长、爱护效果好的优点，这使得HRIG的需求量越来越大［3］，为此，我们于2022年末开始进行人源抗狂犬病抗体血浆的筛查工作，目的是早日开发出平安有效的HRIG制品。但由于办法学的限制，?中华人民共和国药典2022年版三部〔附录ⅪJ〕》规定的小鼠效力中和试验〔NIH〕［4］办法难于做大规模的检测。为寻找适合的办法，笔者曾建立了间接ELISA法测定狂犬病毒抗体的办法，并进一步证实了该办法与小鼠中和法有良好的相关性，但现有ELISA法在实际应用中有灵敏度不高、且存在漏检的问题。为解决上述问题，笔者结合小鼠中和法对国内4个ELISA厂家的狂犬病毒抗体ELISA诊断试剂盒进行筛选和比拟，获得了较称心的结果。

1材料与办法

1.1

材料

1.1.1

狂犬病毒抗原

狂犬病毒北京固定毒AG株适应地鼠肾细胞传代培养的病毒悬液经灭活初步纯化后的疫苗原液，由兰州生物制品研究所疫苗四室提供。

1.1.2

ELISA检测试剂

ELISA定量检测人抗狂犬病抗体诊断试剂〔批号分别为：20220703、20220301、20220302、20220801〕分别由兰州生物制品研究所、宁波天润生物药业有限公司、武汉生物制品研究所、珠海海泰生物制药有限公司提供〕，抗狂犬病参考血清由中国药品生物制品检定所惠赠。

1.1.3

人用狂犬病疫苗和工作对照品

人用浓缩狂犬病疫苗〔≥2.5IU/瓶〕，批号20220401、20220403、20221101。工作对照品〔HRIG〕批号9008。以上制品均由兰州生物制品研究所生产。

1.1.4

实验样本

狂犬病毒抗体阳性血浆20份〔SNT效价≥10IU/ml〕，阴性血浆100份，均由兰州生物制品研究所血液制剂室提供。

1.2

办法

首先对供浆者进行0、3、7、14、28日程序狂犬疫苗注射，于最后一针1个月后采集血样，用ELISA试剂盒检测其相对效价，将此血样与规范品进行系列稀释，分别与狂犬病毒悬液结合，小鼠脑内注射，在规定的时间内，察看小鼠存活和死亡情况，测定出供试品效价，之后再用小鼠中和法试验SNT效价进行比拟。将中和法测得SNT效价结果≥10IU/ml的样品，再用其他三家ELISA［4］试剂盒进行检测。最终筛选出与小鼠中和法试验结果相接近的试剂盒作为大规模筛查狂犬病抗体阳性血浆初筛试剂盒，设计出能满足单采浆站特异性免疫血浆筛选的需要和可靠的收浆计划。

2

结果

2.1

初免后两种检测办法的比拟

按0、3、7、14、28日程序免疫后1个月采集的血样用两种办法检测的结果比拟，见表1。表1

初免后两种检测办法的比拟〔略〕注：兰生所试剂〔批号为20220703〕

从表1可以看出，小鼠中和法与A厂家ELISA试剂盒检测结果存在很大差别，从而导致了大量的特免血浆漏检。

[1]

[2]

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2.2

不同厂家ELISA试剂盒检测结果比拟

经小鼠中和法测得SNT效价〔≥10IU/ml〕样品与其他三个生产厂家试剂盒检测结果比拟，见表2。表2

不同厂家ELISA试剂盒检测结果比拟(略)注：样品1～7号为同一供浆者不同次血浆样，8～9号为同一供浆者。不同次血浆样中，小鼠中的样品作过一次。海泰批号为202201

从表2可以看出，采用B、C、D厂家ELISA试剂盒经中和法测得SNA≥10IU/ml的9份血样进行检测，结果显示，B、D厂家ELISA试剂盒检测结果与中和法SNT值接近。

2.3不同ELISA试剂盒规范曲线比照

以9008批HRIG为工作参考品，用不同ELISA试剂盒测得的线性关系比拟，见表3。表3

不同ELISA试剂盒规范曲线比照〔略〕注：工作参考品为98008HRIG冻干品经小鼠中和法测得效价为60IU/ml

从表3可以看出，以HRIG〔批号：98008〕为工作参考品的检测结果可以看出，B、DELISA生产厂家的试剂盒线性关系较好〔分别为：r＝0.997，r＝0.996〕，可以作为初筛狂犬免疫血浆的首选试剂。

3讨论

ELISA检测办法与小鼠中和法的比拟：早在20世纪末国内就有人［4］将ELISA与小鼠中和试验进行了比拟，两者已经有了很好的一致性。苏军英等［5］在vero细胞狂犬病疫苗免疫人的效果察看中，用ELISA与MNT、RFFIT三种办法进行比拟，也有相似的结果［6，7］。在实验中测定的结果也证实上述两种办法具有良好的正相关性。同时通过在ELISA实验中同步设立了已知的SNT效价的阳性对照作为工作参考规范，最大限度地减少其他因素对实验结果的影响。针对大规模人源性狂犬病毒特异性免疫血浆的采集工作的需要，实验中根据稀释阳性对照规范的ELISA测定结果绘制规范曲线作为参照，建立了有效的收浆计划［8］，从而克服了小鼠中和法诸如检测周期长、实验条件复杂、费用高、其检测样品受到限制等不利于采浆站大规模初筛特异性免疫血浆的要求。为加快HRIG制品的研制、开发提供了技术条件。

【参考文献】

1WHOExpertCommitteeonRebies.Technicalreportseries709.Geneva，1984,32-33.

2BenjavonkulchaiM,KoprowskiC,LimsuwunK,etal.Animmunogenicityandefficacystudyof

purifiedchickcellculturerabiesvaccinemanufacturedinJapan.Vaccie，1977,15(17-18):1818-1819.

2Recommendationsoftheimmunizationpracticesadvisorycommittee(ACIP).Morbidityandmortalityweekyreport，1991,40.

4中华人民共和国药典〔附录ⅪJ〕，2022,176.

5苏军英，陶小润，孙承梅.人用狂犬病毒免疫抗体检测办法的比拟.中国生物制品学杂志，1999,12〔4〕：236-237.

6文洁，任雅萍，周学良.ELISA用于人血清抗狂犬病毒抗体的检测.中国人兽共患病杂志，1989,5〔6〕：7-8.

7MebatsionT,Sillero-zc,GottelliD.DetectionofrabiesantibodybyELISAandRF