生物制药的基本技术培训课件

生物制药的基本技术

生物制药是把生物体内的具有生物活性的基本物质，保持原来的结构和功能，又能在含有多种物质的液相或固相中较高纯度的分离出来。它是一项严格、细致、复杂的工艺过程，涉及物理、化学、生物学、工程等方面的知识和操作技术。1.中心的问题：（1）、标准化方法？标准化包括制订标准和贯彻标准的全部过程

（2）、如何发现或研制新药？

对于一个新研制的生物药物，从查阅文献开始，到探索实验、条件考察（记录客观）、总结制定工艺规程、制定分析鉴定方法，再进行中试放大，全面考察工艺是否成熟，是否稳定等。2生物制药的基本技术1、提取法(Extraction)2、发酵法（Zymotechnics）3、化学合成（Chemicalsynthesize）4、组织培养法（Tissueculture）5、现代生物技术(ModernBiotechnics):Geneengineering,Enzymeengineering,Cellengineering,proteinEngineering,Fermentationengineering

2.基本制造方法3生物制药的基本技术3.生化制药的六个阶段

1.原料的选择和预处理2.原料的粉碎3.提取：从原料中经溶剂分离有效成分，制成粗品的工艺过程。4.纯化：粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、层析、透析、超离心、膜分离、结晶等步骤进行精制的工艺过程。5.浓缩、干燥及保存6.制剂：原料药（精制品）经精细加工制成片剂、针剂、冻干剂、粉剂等供临床应用的各种剂型。4生物制药的基本技术一.RawMaterialSelectingandPretreatment原料选择和预处理、保存原料选择的基本准则：1、在大量的信息资料和实践经验的基础上，选择目标原料。2、选择有效成分含量高的新鲜材料；3、来源丰富易得；4、制造工艺简单易行；5、成本比较低；6、原料的采集不破坏生态环境,选择对环境友好的原材料资源，防止生物入侵。5生物制药的基本技术预处理方法：1、动物组织先要剔除结缔组织、脂肪组织等非活性部分；植物种子去壳除脂；微生物要进行菌体与发酵液分离等基本操作。便于贮存和运输。2、冷冻法预处理：有些材料要冷冻保存或低温保存，以便抑制微生物和酶的作用。3、有机溶剂除去部分水分：用丙酮或乙醇进行脱水和脱脂，有利于贮存。6生物制药的基本技术保存1、冷冻2、脱水3、保鲜7生物制药的基本技术二、原料的粉碎ComminutionofRawMaterial原料的粉碎：在提取前先将大块的原料粉碎或绞碎成适度的粒度，或将细胞破碎，使胞内活性物质充分释放到溶液中，有利于提取或吸附。动物脏器组织：常用绞肉机机械法粉碎；植物肉质组织：常用磨碎法；微生物：常用自溶、冷热交替、加砂研磨、超声、加压等处理方法。

8生物制药的基本技术1.机械法：组织捣碎机、匀浆器、研钵、球磨机、万能粉碎机、绞肉机、击碎机、刨片机。动物组织多在冰冻状态绞碎、溶浆。2.物理法

A、反复冻融法：把待破碎的样品冷至-20℃-15℃

，使之凝固，然后缓慢的溶解，如此反复操作，大部分动物性细胞及细胞内的颗粒可以破碎。B、冷热交替法：将材料投入沸水中，在90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中，使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。此法多用于细菌或病毒中提取蛋白和核酸。

9生物制药的基本技术C、超声波处理法：多用于微生物材料，处理的效果与样品浓度、使用频率有关。用大肠杆菌制备各种酶时，常用50~100mg/L菌体浓度，在1~10KC频率下处理10~15min。操作时注意避免溶液中气泡的存在。D、加压破碎法：加气压或水压，达0.59~34.32MPa(210~350kgf/cm2)的压力时，可使90%以上细胞被压碎。多用于微生物酶制剂的工业制备。10生物制药的基本技术3.生化及化学法：

A.自溶法：将新鲜的生物材料存放在一定的pH和适当温度下，利用组织细胞中自身的酶系将细胞破坏，使细胞内含物释放出来的方法。自溶的温度，动物材料在0-4℃，微生物在室温下。自溶时，需加少量的防腐剂，甲苯、氯仿，以防止外界细菌的污染。*由于自溶时间较长，不易控制，故制造具有活性的核酸和蛋白质时比较少用。

11生物制药的基本技术B.溶菌酶处理法：溶菌酶是专一地破坏细菌细胞壁的酶。多用于微生物，如蜗牛酶、纤维酶，植物细胞也适用。如用噬菌体感染大肠杆菌细胞制造DNA时，采用pH8.0的0.1mol/LTris-0.01mol/LEDTA制成2亿/ml的细胞悬液，然后加入100μg~1mg的溶菌酶，在37°C保温10min，细菌胞壁即被破坏。C.表面活性剂处理法：表面活性剂的分子中，兼有亲脂性和亲水性基团，能降低水的界面张力，具有乳化、分散、增溶作用。常用有：SDS、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠。12生物制药的基本技术三、提取Extraction提取：也称抽提、萃取，就是利用一种溶剂对物质的不同溶解度，从化合物中分离出一种或几种组分的过程。分为固体处理（液—固萃取）和液体处理（液—液萃取）。提取条件的选择：1、溶剂:常用水、稀盐、稀酸、稀碱，有机溶剂如乙醇、丙酮、氯仿、四氯化碳、丁醇等。丁醇提取的pH、温度范围较广（pH3-6,-2-40℃）。适用于动植物和微生物原料。2、pH:与溶解度和稳定性有很大关系，一般选择在pI的两侧。

13生物制药的基本技术3、温度：一般在5℃以下，但对温度耐受力较大的药物，可适当的提高温度，使杂蛋白变性分离，有利于提取和纯化。如胃蛋白酶、酵母醇脱氢酶及多肽激素类，选择37-50℃提取，效果较好。影响提取的因素：1、被提取物质溶解度的大小：一般极性对极性；非极性对非极性；酸对碱；碱对酸；高温；远离等电点。2、扩散作用的影响：扩散方程式G=DF*ΔC/ΔX*t3、分配作用的影响：分配定律(C1/C2)恒温、恒压=K14生物制药的基本技术分离机理

萃取（Extraction）可指任意两相之间的传质过程。在液—液萃取过程中，常用有机溶剂作为萃取试剂，常称液—液萃取为溶剂萃取，它是生物制药中一种重要的分离提取方法。其原理是利用一种溶质组分在两个互不混溶的液相（如水相和有机溶剂相）中竞争性溶解和分配性质上的差异来进行分离提取的。溶剂萃取法广泛应用于抗生素、有机酸、维生素、激素等工业规模的提取上。萃取过程溶剂与水互不相溶目标产物在溶剂中的溶解度较大产物大部分被萃取至溶剂中15生物制药的基本技术萃取方法的适应性①非极性物质——最适合萃取（胞内产物）②既溶于水也溶于有机溶剂的极性化合物——尚可萃取（大多胞外）③大多数极性化合物（酸碱性物质）——不适合萃取（适合离子交换）16生物制药的基本技术特点①选择性较好②操作条件温和（低温）③能耗较少，设备简单④传质快—>生产能力较大⑤可达到较高的分离程度17生物制药的基本技术1.溶剂萃取18生物制药的基本技术一个良好的溶剂应满足的条件a.萃取容量大b.选择性好，只萃取产物不萃取杂质c.与被萃取的液相互溶度小d.易回收与再生e.稳定性好，不易分解f.经济性好，价廉g.安全无毒19生物制药的基本技术物质的溶解与相似相溶原理溶剂萃取是把目标物质从第一个液相中依靠更强大的溶解力抽提到第二个液相中，如把水相中的醋酸抽提到醋酸乙酯中，也就是说，萃取是通过溶质在两个液相之间的竞争性溶解（分配）而实现的。为了便于理解，可假定溶解过程从纯物质和纯溶剂开始，到形成均匀的分子混合物结束。20生物制药的基本技术从能量变化的角度可将溶解过程分为三个过程：a.溶质的各质点的分离（吸收能量）b.溶剂A在溶质B的作用下，形成可溶纳B质点的空位。（吸收能量）c.溶质点B进入溶剂A形成的空位（放出能量）

21生物制药的基本技术溶剂化：也称溶剂含化，是指一定数目的溶剂分子较小，因此结合在溶质质点上。若溶剂是水，则称为水（合）化。有溶剂化能力的溶剂称为溶剂化溶剂。分子间，可以有两方面的相似：分子结构相似：如分子的组成官能团，形态结构等的相似能量（相互作用）相似：如相互作用力有极性与非极性之分，两种物质如相互作用力相近则能互溶。22生物制药的基本技术溶剂的互溶性规律物质分子之间的作用力与物质种类有关，作用力包括较强的氢键和较弱的范德华力。按照生成氢键的能力，可将溶剂分成四种类型。N型溶剂：不能形成氢键A型溶剂：只有电子受体的溶剂B型溶剂：只有电子供体的溶剂AB型溶剂：同时具备电子受体A—H和供体B的溶剂，可缔合成多聚分子，因氢键的结合形成不同，又可分成三类：AB（1）型、AB（2）型、AB（3）型。23生物制药的基本技术分配定律应用前提条件（1）稀溶液（2）溶质对溶剂互溶没有影响（3）必须是同一分子类型，不发生缔合或离解24生物制药的基本技术2.液固萃取若溶质在固体的表面（如有胞外产品附着在细胞上）浸取操作比较容易进行，但大多数情况下需要从固体或动植物细胞内部把溶质浸取出来。25生物制药的基本技术溶剂从固体颗粒中浸取可溶性物质，其过程一般包括以下步骤：①溶剂从溶剂主体传递到固体颗粒的表面②溶剂扩散渗入固体内部和内部微孔隙内③溶质溶解进入溶剂④通过固体微孔隙通道中的溶液扩散至固体表面并进一步进入溶剂主体。26生物制药的基本技术浸取原理扩散速率G—已扩散的目标产物量t—扩散时间D—扩散系数F—扩散面积—目标产物浓度差—扩散距离27生物制药的基本技术提高萃取速率的方法①提高固相破碎度——消除内扩散

破碎度↑粒度↓破碎过度使浸取操作中固体床层被压实，不利于溶剂渗透和溶质扩散，助粉碎消耗能量。②搅拌——消除外扩散搅拌使固体表面溶质接近主体液浓度28生物制药的基本技术③分次提取，不断更新溶剂

④适当提高温度温度↑粘度（u）↓D↑G/t↑29生物制药的基本技术增溶作用原先不溶或难溶性的生物大分子物质向可溶性的分子量较小的生物物质转变。这些过程中含有酶或酸碱催化的生物大分子水解反应或促使大分子增溶的作用。如：啤酒酿造的麦芽淀粉向可溶性糖的转化。另，浸取过程有时会促使某些溶质向不溶性物质转变。如，甜菜在开水中浸泡可以使不希望溶出的可溶性蛋白发生热凝固，同时使阻碍糖分溶出的细胞膜变化。在中草药物浸出时，要避免如上药效成分的损失。30生物制药的基本技术浸取溶剂选择①分配系数大②选择性高，对目标产物溶解度大，而对杂质小。③价廉、无毒、无腐蚀性31生物制药的基本技术四、分离纯化SeparationandPurification1、盐析法利用不同的蛋白质在高浓度盐溶液中，溶解度不同程度的降低来进行分离纯化。在低盐浓度下，溶解度随着盐浓度升高而增加，称盐溶作用；当盐浓度不断升高时，不同蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出沉淀，称盐析作用。

优点：设备和条件要求低，安全应用范围广泛。在高盐情况下，蛋白质不易发生变化，一般在室温下操作。

缺点：分级分离能力不高。

常用的中性盐：硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠。

32生物制药的基本技术盐析的机理①盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解蛋白质的有效水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏了蛋白表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下降；②盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度降；③盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水分子的极化，使水活度降低。33生物制药的基本技术盐析时应注意的几个问题：（1）盐饱和度：由于蛋白质的结构和性质不同，盐析要求的饱和度也不同。要按工艺要求，正确计算饱和度。（2）pH值的选择：蛋白质在pI时的溶解度最小。因此，进行盐析时的pH，要选择在被分离蛋白质的pI附近。（3）蛋白质浓度：在相同条件下，蛋白质浓度越大越易沉淀，使用盐的饱和度极限也愈低。蛋白质浓度愈高，其他蛋白质共沉淀作用也愈强，这是不希望的。选择适当的蛋白质浓度，可避免共沉的干扰。34生物制药的基本技术

（4）温度：一般在室温下进行，浓盐对蛋白质有保护作用。但对温度敏感的，要在低温下进行。

常在0-4℃范围内迅速操作。如尿激酶。（5）盐析沉淀物的脱盐：盐析的沉淀分离后，经脱盐才能获得纯品。最常用的脱盐方法是透析，时间一般较长，应常换透析液，注意防止污染。35生物制药的基本技术2、有机溶剂沉淀法利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离目的蛋白质的方法。蛋白质的沉淀与溶解，与溶剂的介电常数有关。降低溶液的介电常数，使其溶解度变小，同时，还破坏蛋白质的水化膜而使蛋白质沉淀析出。36生物制药的基本技术几种溶剂的介电常数溶剂名称20℃时的介电常数溶剂名称20℃时的介电常数乙醚4.33甲醇33丙酮21.4水80乙醇242.5mol/L甘氨酸水溶液137介电常数与静电力的关系：F=Q1Q2/Kr2式中：K—介电常数。指带相反电荷的微粒之间的静电引力。F—相距为r的2个带电量分别为Q1、Q2点电荷相互作用的静电引力。经验：如30-40%乙醇沉淀的物质，改用丙酮时，其体积分数可减少10%左右。即可用20—30%的丙酮；而70-80%乙醇沉淀的物质，可用50—60%的丙酮即可。注：水有较高的介电常数，具有很好的溶剂性能，是一种广谱溶剂。有机溶剂法比盐析法分辨力强，沉淀也好过滤，易干燥，但对有些生物活性物质能引起失活和变性。应用时还要注意挥发和火灾等。37生物制药的基本技术38生物制药的基本技术有机沉淀法应注意的问题：

（1）控制工艺过程的温度：整个操作过程应在低温下进行，而且最好是同一温度。（2）防止溶剂局部浓度过高：加入有机溶剂时搅拌要均匀，速度要适当，避免局部浓度过高，引起沉淀物的破坏、变性或失活。（3）及时处理沉淀物：沉淀物经过滤或离心后，要立即用水或缓冲液溶解，降低有机溶剂的浓度。（4）pH的选择：在待沉淀蛋白质的pI附近。（5）有机溶剂也是酶和蛋白质的变性因素，尤其是对敏感酶类要小心。39生物制药的基本技术3、等电点沉淀法利用蛋白质在等电点时的溶解度最低，而各种蛋白质又具有不同的等电点的特性进行分离的工艺过程。由于各种蛋白质在等电点时，仍有一定的溶解度而沉淀不完全，多数蛋白质的等电点又都十分接近，所以单独使用效果不理想，分辨力差，多用于提取后除杂蛋白。实际生产中常与有机溶剂沉淀法、盐析法联合使用。40生物制药的基本技术①从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝8.9，可先于pH3.0左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质(pI=3．O)。工业生产胰岛素(pI＝5.3)时，先调pH至8.0除去碱性蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质(同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。41生物制药的基本技术②碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取：调pH4.0后出现含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。用pH9.0的0.1mol/LTris-HCl缓冲液重新溶解，加入20～40%饱和度的硫酸铵分级，离心收集的沉淀Tris-HCl缓冲液再次沉淀，即得较纯的碱性磷酸酯酶。42生物制药的基本技术4、膜分离法膜分离技术包括超滤、反渗透析、电渗析、微孔过滤、气体渗析和超精密过滤。（1）超滤：根据溶质分子和悬浮粒子是否通过多孔膜来进行筛分。在液压的驱动下，能通过超滤膜的分离粒子的范围，一般在0.001—0.01μm。即利用一种特制的膜对溶液中的各种溶质分子进行选择性过滤。优点：成本低、操作方便、条件温和、能较好地保持药物活性、回收率高。适用于酶和蛋白质药物的分离、浓缩、脱盐、提纯、除菌、除病毒和热原。

43生物制药的基本技术小型超滤设备图44生物制药的基本技术平板式超滤膜

（0.1m2）45生物制药的基本技术平板式超滤膜盒46生物制药的基本技术47生物制药的基本技术（2）反渗透：以高分子透过性薄膜为分离介质，在超过溶液渗透压力的情况下，使溶液中的溶剂透过薄膜，同时使溶质和不溶物阻截在膜前。这一过程类似于渗透,但方向相反，即溶剂从高浓度一侧传递到浓度低的一侧，故称反渗透。特点：能耗少，体积小，适应大规模生产。（3）微孔滤膜：由高分子材料制成的薄膜过滤介质，可以过滤一般介质不能截留的细菌和微粒。膜的孔径在0.2-10μm。（4）超精密过滤：以聚乙烯醇为主体的中空多孔滤膜，分级性能在超滤膜与微孔滤膜之间。为0.01~0.2μm。用于水的精制、循环水的净化、除悬浮固体粒子以及糖液、酶液的精制。48生物制药的基本技术膜的分类按孔径大小：微滤膜、超滤膜、反渗膜、纳滤膜按膜结构：对称性膜、不对称膜、复合膜按材料分：天然高分子材料膜、合成高分子材料膜、无机材料膜49生物制药的基本技术膜分离的特点①操作在常温下进行；②是物理过程，不需加入化学试剂；③不发生相变化（因而能耗较低）；④在很多情况下选择性较高；⑤浓缩和纯化可在一个步骤内完成；⑥设备易放大，可以分批或连续操作。因而在生物产品的处理中占有重要地位50生物制药的基本技术51生物制药的基本技术52生物制药的基本技术

5、离子交换层析采用不溶性高分子化合物作为离子交换剂，分离纯化各种生化物质。基本原理：离子交换树脂在水中能溶胀，溶胀后，其分子中的极性基团（活性基团），具有可扩散的离子，能与溶液中的离子起交换作用；非极性基团作为树脂的骨架，使树脂不溶于水并具有网状结构，为离子交换的进行及溶液和树脂的分离创造了条件。离子交换层析包括吸附、吸收、穿透、扩散、离子交换、离子亲和力等物理化学过程。

53生物制药的基本技术树脂种类和理化性能：

（1）强酸性阳离子交换树脂：功能团为磺酸基，pH一般没有限制。（2）弱酸性阳离子交换树脂：功能团为羧基、酚基。在酸性溶液中不发生交换，pH愈大交换能力愈强。（3）强碱性阴离子交换树脂：功能团为三甲基季胺基团。pH没有限制。（4）弱酸性阴离子交换树脂：功能团为伯胺基、仲胺基、叔胺基。pH愈低交换能力愈大。54生物制药的基本技术

影响交换速度的因素：（1）树脂颗粒的大小：颗粒小，表面积大，能促进内部和外部扩散。（2）搅拌和流速：加快搅拌速度或加大液体流速，都能减少树脂外液膜的厚度，从而使液相扩散速度增加。（3）离子浓度：交换速度随离子浓度的上升而增加，达到一定浓度后交换速度不在升高。（4）离子的水化半径：水化半径小的易被吸附。（5）树脂酸碱性的强弱和溶液的pH有关55生物制药的基本技术（6）交联度大小：交联度愈小，树脂愈易膨胀，交换速度愈快。但交联度小的树脂选择性较差。

（7）有机溶剂的影响：当有有机溶剂存在时，会降低树脂对有机离子的选择性，而容易吸附无机离子。56生物制药的基本技术离子交换法的特点优点：①提取周期短、效率高②设备简单、成本低③工艺操作方便④不需使用大量有机溶剂缺点：①辅助时间长（洗脱、再生、活化、辅助时间约为提取时间的10倍以上）。②消耗大量酸碱（目标产物2-5倍）③PH变化范围大（目标产物PH的稳定性）④对某些产品难于找到合适的树脂（易吸附、易分离、易除杂质）57生物制药的基本技术离子交换法的基本应用①产品提纯：将被提取物中不需要的杂质用离子交换剂吸附除去，以得到较高纯度的产品，如：酒精脱臭、低度白酒除浊。②产品提取：把溶液中的产品用交换剂吸附（同时得以浓缩），而杂质仍留在溶液中，如多种抗生素、有机酸、氨基酸、酶制剂、VB12、ATP等的提取。③产品分离：溶液中含有两种或两种以上的产品时，可用不同类型的交换剂分别吸附而得以分离。如：核苷酸、多种氨基酸、混合物的分离等。58生物制药的基本技术适用范围：离子交换——分离极性化合物（离子型）萃取——分离非极性或弱极性化合物59生物制药的基本技术离子交换树脂性能比较性能阳离子交换树脂阴离子交换树脂强酸性弱酸性强碱性弱碱性活性基团磺酸羧酸季氨胺pH对交换能力的影响无在酸性溶液中交换能力很小无在碱性溶液中交换能力很小盐的稳定性稳定洗涤时要水解稳定洗涤时要水解再生需过量的强酸很容易需要过量的强碱再生容易，可用碳酸钠或氨交换速度快慢(除非离子化后)快慢(除非离子化后)60生物制药的基本技术离子交换操作方法

树脂预处理离子交换吸附洗脱61生物制药的基本技术树脂预处理物理处理：水洗、过筛，去杂，以获得粒度均匀的树脂颗粒；化学处理：转型（氢型或钠型）阳离子树脂酸—碱—酸阴离子树脂碱—酸—碱最后以去离子水或缓冲液平衡62生物制药的基本技术离交操作方式静态：操作简单、但是分批操作，交换不完全动态：离子交换柱，操作连续、交换完全，适宜多组份分离 柱式固定床（Fixed－Bed） 模拟移动床（SMB）63生物制药的基本技术洗脱方式离子交换完成后，将树脂吸附的物质重新转入溶液的方法洗脱方法（1）改变溶液pH值（2）改变溶液离子强度64生物制药的基本技术树脂再生是指使离子交换树脂重新具有交换能力的过程酸性阳离子树脂酸-碱-酸-缓冲溶液淋洗碱性阴离子树脂碱-酸-碱-缓冲溶液淋洗方式有：顺流再生和逆流再生65生物制药的基本技术6、凝胶层析指化合物随流动相流经装有凝胶的固定相的层析柱时，因其各种物质分子大小不同而被分离的技术。又称凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛过滤、阻滞扩散层析、排阻层析。优点：设备简单，操作方便，分离效果好，回收率高，分离条件缓和，不使活性物质失活变性，凝胶可重复使用，无需再生处理。66生物制药的基本技术

缺点：分离速度慢。广泛用于分离氨基酸、多肽、蛋白质、酶及多糖等药物。几种常用的凝胶：（1）葡聚糖凝胶：基本骨架是1—6糖苷键。由葡聚糖和甘油以醚桥形式交联而成的网状结构。最著名的商品为Sephadex葡聚糖凝胶，珠状颗粒物，化学性质稳定，不溶于水、弱酸、碱和盐溶液。低温时，在0.1mol/L盐酸中保持1-2h不改变性质；室温时，在0.01mol/L盐酸中放置半年也不改变；在0.25mol/L的氢氧化钠中，60℃

两个月没有发改变。可在120℃

加热30min灭菌而不破坏，但高于120℃

即变黄。湿状贮存易发霉，若长期不用，需加防腐剂。

67生物制药的基本技术（2）聚丙烯酰胺凝胶：由碳—碳骨架构成。完全为惰性。稳定性比葡聚糖凝胶好，洗脱时不会有凝胶物质下来。缺点：不耐酸。遇酸时酰胺键会水解为羧基，使凝胶带有一定的离子交换基团。（3）琼脂糖凝胶：天然凝胶，不是共价交联，是以氢键交联。空隙度以琼脂糖的浓度来改变，化学稳定性不如葡聚糖凝胶。没有干凝胶，必须在溶胀状态保存，遇脱水剂、冷冻和一些有机溶剂即破坏，丙酮和乙醇对它无影响。在pH4.5-9,温度0-40℃稳定。对硼酸有吸附，不能用硼酸缓冲液。他能分离几万到几千万相对分子质量的物质，弥补了葡聚糖和聚丙烯酰胺凝胶的不足。瑞典商品名Sepharose，美国称生物凝胶—A（Bio-Gel-A）,英国称Sagavac.68生物制药的基本技术

(4)疏水性凝胶：常用的为聚甲基丙烯酸酯（Polymethacrylate）凝胶、聚苯乙烯凝胶（如Styrogel,Bio-Beads-S）69生物制药的基本技术7、亲和层析

生物活性物质都有亲和作用，如酶与底物、激素与受体、核酸的互补链间，多糖与蛋白质复合体。亲和层析是利用生物大分子的特异亲和力而设计的层析技术。可逆结合的特异性物质称为配基，与配基结合的层析介质称为载体。亲和层析能从粗提液中，通过一次简便处理，便可得到高纯度的活性物质，既可分离一些生物材料中含量极微的物质，又能分离一些性质十分相似的物质。

70生物制药的基本技术优点：设备要求不高，操作简便，适用范围广，特异性强，分离速度快，效果好，条件温和。缺点：通用性较差，洗脱条件要求苛刻。几种常用的载体：（1）纤维素：自然界中数量最大的大分子生物材料，取材十分方便。但由于其结构紧密、均一性差，不利于大分子的渗入。活化后常带有电荷，非特异性吸附较强，加上空间位阻等原因，其应用不如凝胶载体广泛。目前主要用于分离与核酸有关的物质。如用寡聚脱氧胸腺核苷酸纤维素作固定相分离细胞提取液中的mRNA.市售商品有：无定型微纤维、微晶纤维素、珠状纤维素。71生物制药的基本技术（2）琼脂糖凝胶：用于亲和层析的主要为交联珠状凝胶。其琼脂糖的质量浓度为20g/L(2%)、40g/L(4%)、60g/L(6%)几种，相应的商品称为Sepharose2B、4B、6B(Pharmacia)和UltrogelsA-2,A-4,A-6)。这类载体能使吸附物质保持活性，能迅速活化并接上各种功能基团，结构疏松，孔径大，流速快。（3）葡聚糖凝胶：与琼脂糖凝胶相比孔径太小，特别是经配基偶联后，凝胶膨胀度会进一步变小，所以应用受到限制。（4）聚丙烯酰胺凝胶：碳—碳骨架，由丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，具有网状三维空间结构。商品名为BiogelP。注意避免接触强氧化剂，配基偶联后会使它的网格缩小，在一定程度上限制了它的应用。

72生物制药的基本技术（5）多孔玻璃珠：化学和物理稳定性好，机械强度高，不但能抵御酶及微生物的作用，还能耐受高温灭菌和较剧烈的反应条件。缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质有非特异性吸附，而且可供连接的化学活性基团也少。改良方法：为了克服其缺点，市售Bio-Glass的商品都已事先连接了氨烷基（烷基胺）。用葡聚糖包被玻璃珠，则可改善其亲水性，并增加化学活性基团。用抗原涂布的玻璃珠已成功地分离了免疫淋巴细胞，在DNA连接的玻璃珠上纯化了大肠杆菌的DNA和RNA聚合酶。

73生物制药的基本技术（6）其他载体：由聚丙烯酰胺和琼脂糖混合组成的载体，商品名为UltrogelsACA。它的特点是载体上既有羟基又有酰胺基，并且都能与配基单独作用。但不能接触强碱，以免酰胺水解，使用温度不超过40°C。在丙烯酰胺和琼脂糖的混合胶中加入7%的四氧化三铁，则可制得一种称为磁性胶（MagnogelsACA44）的载体。当悬浮液中含有不均匀粒子时，依靠磁性能将载体与其他粒子分离。磁性胶载体常用于酶的免疫测定、荧光免疫测定、放射免疫测定、免疫吸收剂和细胞分离等的微量测定和制备。

74生物制药的基本技术影响吸附亲和力的几个因素：

（1）配基浓度；（2）空间障碍；（3）配基与载体的结合位点；（4）载体的孔径；（5）微环境（化学因素）。75生物制药的基本技术8.大孔树脂大孔吸附树脂主要以苯乙烯、二乙烯苯等为原料，在0.5%的明胶溶液中，加入一定比例的致孔剂聚合而成。其中，苯乙烯为聚合单体，二乙烯苯为交联剂，甲苯、二甲苯等作为致孔剂，它们互相交联聚合形成了大孔吸附树脂的多孔骨架结构。树脂一般为白色的球状颗粒，粒度为20～60目，是一类含离子交换集团的交联聚合物。

聚合物形成后，致孔剂被除去，在树脂中留下了大大小小、形状各异、互相贯通的孔穴。因此大孔树脂在干燥状态下其内部具有较高的孔隙率，且孔径较大，在100~1000nm之间，故称为大孔吸附树脂。76生物制药的基本技术理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂。不受无机盐类及低分子化合物的影响。树脂吸附作用是依靠它和被吸附的分子之间的范德华引力，通过它巨大的比表面进行物理吸附而工作。根据吸附力及其分子量大小可以经一定溶剂洗脱分开而达到分离、纯化、除杂、浓缩等不同目的。77生物制药的基本技术（1）非极性大孔吸附树脂是由偶极距很小的单体聚合制得，不带任何功能基，孔表的疏水型较强，可吸附溶液中的有机物，最适于极性溶剂中吸附非极性物质，也称为芳香族吸附剂，例如苯乙烯、二乙烯苯聚合物。（2）中等极性大孔吸附树脂是含酯基的吸附树脂。表面兼有疏水和亲水两部分。既可极性溶剂中吸附非极性物质，又可由非极性溶剂中吸附极性物质，也称为脂肪族吸附剂，例如聚丙烯酸酯型聚合物。（3）极性大孔吸附树脂极性大孔吸附树脂是指含酰胺基、氰基、酚羟基等含氮、氧、硫极性功能基的吸附树脂，它们通过静电相互作用吸附极性物质，如丙烯酰胺。78生物制药的基本技术树脂种类众多，型号各异，性能差异大。树脂型号主要有：美国Rohn&hass公司生产的AmberliteXAD；日本三菱公司生产的DiaionHP-10、-20、-30、-40、-50(非极性)；

还有：ParapetP-S、ParapetQ、ParapetR、ParapetS、ParapetN、Chromosorb系列等；中国主要的树脂有天津农药股份有限公司的D系列，上海试剂厂101、102、402等，南开大学化工厂产品D系列、H系列、AB-8(弱极性)和上海医药工业研究院SIP系列等。79生物制药的基本技术同一型号大孔吸附树脂对有效部位吸附能力强弱的规律为：以药材计，生物碱>

黄酮>酚性成分>无机物。不同树脂结构对不同物质吸附效果不同，筛选实验表明，D-及DA-型树脂对多糖的吸附作用较单糖和双糖大。AB-8树脂对皂苷的吸附容量较蛋白质、糖大。聚苯乙烯树脂一般适用于非极性和弱极性物质的化合物，如皂苷类和黄酮类；聚丙烯类树脂，一般带有酯基或酰氨基，对中极性和极性化合物如黄酮醇和酚类的吸附较好。80生物制药的基本技术预处理用乙醇加热回流洗脱，洗至洗脱液蒸干后无残留物。经乙醇洗净的树脂挥去溶剂后保存备用2.装柱以乙醇湿法装柱，继续用乙醇在柱上流动清洗，不时检查流出的乙醇，至与水混合不呈白色混浊为止(取1mL乙醇液加5mL水)。然后以大量的蒸馏水洗去乙醇，备用。少量乙醇存在将会大大降低树脂的吸附力。3.再生树脂柱反复使用后一般用95%乙醇洗至无色后水洗即可。如树脂颜色变深可用稀酸或稀碱洗脱后水洗。如柱上方有悬浮物可用水、醇从柱下进行反洗可将悬浮物洗出。多次使用柱床挤压过紧或树脂破碎影响流速,可取出树脂,盛于一较大容器中用水漂洗除去小颗粒或悬浮物。81生物制药的基本技术近几年来，由于大孔吸附树脂新技术的引进，使中草药有效单体成分或复方中某一单体成分的指标得到提高。它具有快速、高效、方便、灵敏、选择性好等优点。1大孔吸附树脂在中药有效成分纯化中的应用大孔吸附树脂用于白芍总苷、甜叶菊苷、刺玫果苷、三七总苷、西洋参总皂苷、绞股蓝总皂苷、

甘草酸、三棵针生物碱、丹皮酚、银杏叶黄酮、制川乌和制草乌中总生物碱、灵芝中尿嘧啶和尿嘧啶核苷、川芎嗪和阿魏酸的分离。2大孔吸附树脂在中药复方制剂中的应用

82生物制药的基本技术五、Concentration浓缩浓缩：低浓度溶液通过除去溶剂变为高浓度溶液的过程。常在提取后和结晶前进行，有时也贯穿与整个制药过程。蒸发装置的设计原理：加热、扩大液体表面积、低压。1、薄膜蒸发浓缩Filmevaporationconcentration卧式喷淋薄膜蒸发器、Rose蒸发器、板式蒸发器2、减压蒸发浓缩Decompressionevaporationconcentration减压抽真空（真空浓缩），适用不耐热的药物和制品。83生物制药的基本技术3、吸收浓缩Absorbingconcentration通过吸收剂直接吸收除去溶液中的溶剂分子使溶液浓缩的方法。吸收剂与溶液不起化学反应，对生化药物不起吸附作用，易与溶液分开。吸附剂除去溶剂后可重复使用。

常用的吸收剂：聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、凝胶。凝胶可直接投入待浓缩的溶液中，溶剂和小分子被吸收到凝胶内，大分子留在溶液中，然后离心过滤。使用聚乙二醇时，先将溶液装入半透膜的袋内，扎紧袋口，外加聚乙二醇覆盖，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇吸去。84生物制药的基本技术六、Crystallization结晶结晶：利用某些药物具有形成晶体的性质使目标药物（溶质）呈晶态从溶液中析出的过程。结晶的条件：（1）纯度purity：各种物质在溶液中均需达到一定的纯度才能析出结晶。蛋白质和酶，纯度不低于50%。总趋势是越纯越易结晶，但已结晶的制品不表示达到了绝对的纯化，只能说到了相当纯的程度。有时纯度不高，加入有机溶剂和制成盐，也能达到结晶。85生物制药的基本技术（2）浓度consideration：结晶液的浓度要较高，以利于分子间的碰撞聚合。但浓度过高，相应杂质和溶液黏度增大，反而不利于结晶，或生成纯度较差的粉末结晶。

（3）pH：选择pH在pI附近，有利于晶体析出。

（4）温度temperature：通常在低温条件进行，活性物质不易变性，又可避免细菌繁殖。

（5）时间Time：结晶的生成和生长需要时间。但生物药物要求在几小时内完成，时间不宜过长。（6）晶种Crystalseed：不易结晶的药物常加晶种。86生物制药的基本技术结晶的概念溶液中的溶质在一定条件下，因分子有规则的排列而结合成晶体。晶体的化学成分均一，具有各种对称的晶体，其特征为离子和分子在空间晶格上呈规则的排列。87生物制药的基本技术生物工业的最终产品形态有许多是以固体形态出现，固体产品有结晶和无定形两种状态1、结晶析出速度慢，溶质分子有足够时间进行排列，粒子排列有规则。蔗糖、食盐、氨基酸、柠檬酸等都是结晶型2、无定形固体析出速度快，粒子排列无规则。淀粉、酶制剂、蛋白质和某些喷雾干燥获得的产品是无定型物质88生物制药的基本技术重结晶经过一次粗结晶后，得到的晶体通常会含有一定量的杂质。此时工业上常常需要采用重结晶的方式进行精制。重结晶是利用杂质和结晶物质在不同溶剂和不同温度下的溶解度不同，将晶体用合适的溶剂再次结晶，以获得高纯度的晶体的操作。89生物制药的基本技术重结晶的操作过程选择合适的溶剂；将经过粗结晶的物质加入少量的热溶剂中，并使之溶解；冷却使之再次结晶；分离母液；洗涤；90生物制药的基本技术真空浓缩结晶锅设备构造加热蒸发室、加热夹套、汽液分离器、搅拌器等四部分。真空浓缩结晶锅主要技术参数容积M筒体高度H(mm)筒体直径Φ(mm)夹套直径Φ(mm)转速r.p.n电机功率kw

92生物制药的基本技术七、干燥Desiccation干燥：湿的固体生物药物，除去水分或溶剂而获得相对或绝对干燥制品的工艺过程。它也是一种蒸发，但不同于浓缩。通常包括原料药的干燥和制成的临床制剂的干燥。（1）常压干燥Normalpressdesiccation：通风与加热结合。成本低，干燥量大。但时间长，易污染。（2）减压干燥Decompressiondesiccation：利用专用设备减压，使溶剂迅速蒸发。时间短，温度低。制药常用方法。

93生物制药的基本技术（3）喷雾干燥Spraydesiccation：将液体通过喷射装置喷成雾滴后，在一定流速的热气流中，迅速蒸发干燥的方法。从理论推算：每升液体，如果喷成10μm直径的雾滴，约有1.91×1012多个雾滴，表面积有600m2。实验表明：把含水量为80%的1L溶液，喷成直径约10-60μm雾滴，当与热空气接触时，仅3-5s可使雾滴水分气化而得到干燥产品。优点：快速高效，可在无菌条件下操作，应用广泛。缺点：热利用率不高，设备费用投资大。94生物制药的基本技术料液雾化的方法（1）气流式喷雾它是采用压缩空气（或蒸汽）以很高的速度（300m·s－1）从喷嘴喷出，利用气液两相间的速度差所产生的摩擦力，将料液分裂为雾滴，故也称为双流体喷雾。（2）压力喷雾采用高压泵（0.17～0.34MPa）将料液加压，高压料液通过喷嘴时，压力能转变为动能而高速喷出分散的雾滴。（3）离心喷雾料液在高速转盘5000～20000r·min－1中受离心力作用从盘的边缘甩出而雾化95生物制药的基本技术喷雾干燥特点

(1)喷雾干燥是细小的雾滴与热空气接触，具有极大的表面积，利于传热传质过程，物料干燥时间短（几秒至30秒）；(2)干燥温度较低，适于热敏性物料的干燥；(3)可生产粉末状、空心球状或疏松团粒状，且具有较高的速溶性产品；(4)容易通过改变操作条件以调节控制产品的质量指标，如粒度分布、最终湿含量等；(5)干燥流程简化，操作在密闭状态下进行，有利于保持食品卫生、减少污染；(6)所需设备较庞大，空气消耗量大、热利用率低，动力消耗也较大，因此，喷雾干燥总的设备投资费用较高96生物制药的基本技术

（4）冷冻干燥Freezingdesiccation：

在低温（-60-10℃）及高真空6.67-40Pa（0.05-0.3mmHg）下，将物料与溶液中的水分直接升华的干燥方法。

适用于高度热敏的生物药物。制剂应具有多孔、疏松、易溶的特点，一般含水量在1%-3%。设备投资及维护费用高，生产能力不大。97生物制药的基本技术八、Sterilization灭菌灭菌：指杀灭或除去一切微生物的操作技术。1、干热空气灭菌：通常在烘箱里利用热空气杀灭微生物，在100℃，1h可杀死繁殖的细菌。但某些细菌在一定情况下可以变成芽孢，有较强的耐热力，一般需160-170℃

灭菌1h以上或140℃灭菌3h以上。灭菌的时间应自全部进行灭菌的物品达到灭菌温度时算起。待灭菌物品的温度常落后于烘箱室的温度，特别是导热性能差或装量大的待灭菌物品。要确保灭菌完全，应测定温度延后时间，将延后的时间考虑到规定的灭菌时间内。98生物制药的基本技术2、湿热灭菌：

常压灭菌，即在常压下用100℃流通蒸汽或在水内煮沸来杀灭细菌。减