默克密理博超滤实验方法

超滤实验1、实验目的：通过超滤除去细胞收集液中的杂质，使得细胞收集液中的有效成分得到富集。2、实验原理：超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。3、试剂和器材3.1、试剂PBS溶液：取PBS一包，溶于超纯水中并稀释至2L,现配现用。0.5mol/L氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠200.000g,溶于超纯水中并稀释至10L。O.1mol/L氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠40.000g，溶于超纯水中并稀释至10L。1%亚硫酸氢钠溶液:称取亚硫酸氢钠10.000g,溶于超纯水中并稀释至1L。3.2、材料培养过细胞的收集液3.3、器材蠕动泵1个30KD膜包、3KD膜包可高压灭菌带把手细口大瓶4个冰箱（-20C）1台PH试纸（范围6-8）若干计时器1个5L大烧杯4个灭菌的10ml离心管5支灭菌的1.5mlEP管5支封口膜若干千分位的电子天平一台保鲜膜一卷3.3.13橡胶管子3根（lm/根）4、操作方法4.1、超滤除杂4.1・1系统安装：放好垫片，将30KD0.5膜包放于Pellicon夹具中，将螺丝拧紧（对角线）；冲洗：在清洗罐中加入无菌纯水，将透过管和回流管处于排放状态，回流阀全开，调节泵转速为35rmp左右，进行回流端冲洗，冲洗体积为10L-20L/m（5L）；随后将回流管放回清洗罐，透过管处于排放状态，调节泵转速和回流阀至透膜压达到0.2bar，进行透过端冲洗，冲洗体积为10L-20L/m（5L）；超滤除杂：在进料罐中装入料液（留样），将回流管放入进料罐中，透过管放入收集容器中，调节泵转速与回流阀至透膜压达到0.9bar（进口压1.2bar，回流压0.6bar）,当透过液进入容器时开始计时，超滤过程中向进料罐中按照1:1（料液:PBS缓冲液）加入PBS缓冲液，分2-3次进行洗滤，至浓缩液体积达到500mL左右，终止超滤，留样。冲洗：同4.1.2；4.1.5清洗：在清洗罐中加入0.5MNaOH,将透过管和回流管处于排放状态，回流阀全开，调节泵转速为35rmp左右，进行回流端清洗，清洗体积为10L-20L/m（5L）；随后将回流管放回清洗罐，透过管处于排放状态，调节泵转速和回流阀至透膜压达到0.2bar，进行透过端清洗，清洗体积为10L-20L/m?（5L）；冲洗：在清洗罐中加入超纯水，将透过管和回流管处于排放状态，回流阀全开，调节泵转速为35rmp左右，进行回流端冲洗，用PH试纸对回流端流出的液体进行pH检测，至pH达到中性即可终止冲洗；随后将回流管放回清洗罐，透过管处于排放状态，调节泵转速和回流阀至透膜压达到0.2bar，进行透过端冲洗，用PH试纸对透过端流出的液体进行pH检测，至pH达到中性即可终止冲洗；卸膜包：将膜包和垫片从夹具中取出，浸泡于1%的亚硫酸氢钠中。4.2、超滤浓缩4.2.1系统安装：将3KD0.5膜包平行放于Pellicon夹具中，将螺丝拧紧（对角线）；4.2.2冲洗：在清洗罐中加入无菌纯水，将透过管和回流管处于排放状态，回流阀全开，调节泵转速为35rmp左右，进行回流端冲洗，冲洗体积为10L-20L/m?(5L)；随后将回流管放回清洗罐，透过管处于排放状态，调节泵转速和回流阀至透膜压达到0.9bar，进行透过端冲洗，冲洗体积为10L-20L/^(5L)；超滤浓缩：在进料罐中倒入除杂透过液，将回流管放入进料罐中，透过管处于排放状态，调节泵转速与回流阀至透膜压达到0.9bar(进口压1.2bar，回流压0.6bar)，当透过液流出时开始计时，至浓缩液体积达到500mL左右，终止超滤，留样。4.2.4冲洗：同4.2.2；4.2.5清洗：在清洗罐中加入0.1MNaOH，将透过管和回流管处于排放状态，回流阀全开，调节泵转速为35rmp左右，进行回流端清洗，清洗体积为10L-20L/^(5L)；随后将回流管放回清洗罐，透过管处于排放状态，调节泵转速和回流阀至透膜压达到0.9bar，进行透过端清洗，清洗体积为10L-20L/m?(5L)；4.2.6冲洗：在清洗罐中加入超纯水，将透过管和回流管处于排放状态，回流阀全开，调节泵转速为35rmp左右，进行回流端冲洗，用PH试纸对回流端流出的液体进行pH检测，至pH达到中性即可终止冲洗；随后将回流管放回清洗罐，透过管处于排放状态，调节泵转速和回流阀至透膜压达到0.9bar，进行透过端冲洗，用PH试纸对透过端流出的液体进行pH检测，至pH达到中性即可终止冲洗；4.2.7卸膜包：将膜包从夹具中取出，浸泡于1%的亚硫酸氢钠中。注：留样名称留样量(ml)备注原液1.5所留样品经过0.22“m30KD透过液100的滤器过滤后置于30KD浓缩液1.5-20°C的冰箱中冷藏，3KD透过液1.5并使用BCA法检测蛋3KD浓缩液500白浓度。5、注意事项5.1每次实验前应该应该提前1小时打扫超滤间，并打开紫外线进行灭菌。5.2