自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座

广东药学院药理系自由基损伤学说及抗氧化剂周四桂1自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第1页

铁器在空气中暴露日久会生锈，雪白银器也会因为氧化变黑。人机体与金属一样也会受到氧化而造成“生锈”，罪魁就是自由基。2自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第2页

1956年英国分子生物学家Harman首次提出：

“氧化应激决定寿命”，即自由基衰老学说，认为衰老是自由基引发组织随机毒害结果。

Harman,D.J.Gerontol.1956;11:298-300

氧化应激是因为氧自由基过量生成和(或)细胞内抗氧化防御系统受损,造成氧自由基及其相关代谢产物过量聚集,从而对细胞产生各种毒性作用病理状态。3自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第3页生成增加，消除降低PhysiolRev.;82:47–95.4自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第4页FreeRadicalBiology&Medicine

(IF=5.423)FreeRadicalRes

(IF=2.878)AntioxidRedoxSignal

(IF=8.456)RedoxReport

(IF=1.732)Journalsofimpactfactor5自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第5页ImpactFactorDistributionsIF>10.0=102journals(1.6%) EliteIF>5.0=228journals(3.6%) ExcellentIF>3.0=597journals(9.3%) VeryGoodIF>2.0=869journals(13.5%) GoodIF>1.0=2,020journals(31.5%) FairIF<1.0=2,601journals(40.5%) PoorFromatotalof6,417SCIindexedjournalsasofMarch,6自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第6页自由基概念7自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第7页自由基（Freeradicals）是指外层电子轨道带有一个或多个未成对电子分子、原子、离子或者基团。8自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第8页活性氧（ROS）

是指分子氧在还原过程中一系列中间产物。活性氧包含以自由基形式存在和不以自由基形式存在含有高活性中间产物。O2·-H2O2OH·SODCat活性氧自由基活性氧自由基GPX9自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第9页常见自由基

理化性质10自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第10页常见自由基活性氧

（ReactiveOxygenSpecies,ROS）活性氮（ReactiveNitrogenSpecies，RNS）

以碳、氧、氮或硫原子为中心自由基

11自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第11页

活性氧（ROS）O2·-H2O2OH·SODCatNO.+O2·-

→ONOO-活性氮（RNS）过氧亚硝基阴离子12自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第12页超氧阴离子

(O2·-)化学性质：O2·-在细胞内可直接造成DNA损伤，并可使过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和肌酸激酶失活，其细胞毒性作用主要经过衍生产生H2O2和OH·。去除：细胞内有SOD起去除作用。13自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第13页过氧化氢

(H2O2)化学性质：H2O2性质较稳定，半衰期最长，能够穿透大部分细胞膜，因而能够发挥主要信使功效，但这一特征也增加了其细胞毒作用。去除：H2O2在体内可经过氧化氢酶作用降解为水和氧气。“长期有效”“稳定”14自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第14页羟自由基

(OH·)化学性质：OH·是已知活性最强氧化剂，化学性质极为活泼，几乎能够与全部细胞成份发生反应，对机体危害极大。不过因为其作用范围小，仅能与它邻近分子反应。去除：主要经过抗坏血酸、GSH（或其它硫醇）、褪黑色素、NADPH等活性物质及细胞色素P450体系降解和去除。“寿命短”“稳定差”15自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第15页过氧亚硝基阴离子（ONOO-）化学性质：ONOO-作为一个强氧化剂，能够介导蛋白巯基和非蛋白巯基氧化，并可氧化细胞膜脂、蛋白及DNA，造成细胞损伤和疾病发生或介导信号转导。降解：在碱性条件下，ONOO-比较稳定。一旦质子化，马上分解产生类羟基和NO2自由基。16自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第16页17自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第17页机体对自由基防御18自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第18页19自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第19页氧化应激与心血管疾病20自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第20页在生理情况下活性氧可维持在极低水平，参加机体生长发育调控，信号转导、诱导增殖与分化、诱导凋亡，调整运动等各种生理过程，在生物体内发挥着主要功效。生成增加，消除降低机体损伤21自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第21页动脉粥样硬化是动脉硬化性血管病中最常见一个。动脉内膜积聚脂质外观呈黄色粥样。引发管壁增厚变硬、失去弹性和管腔缩小。22自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第22页23自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第23页氧化应激与动脉粥样硬化ATVB.;25:29-38.24自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第24页AT1ReceptorAngIIThrombinPDGFTNF-αNADPHOxidaseAcitvityO2.-NADPH氧化酶与动脉粥样硬化AT1ReceptorAntagnoistLackofp47phox25自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第25页氧化应激与高血压26自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第26页自由基信号转导路径27自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第27页氧自由基参加信号转导通路

EGFReceptorProteinTyrosinePhosphatasesInsulinReceptorKinaseActivityCytoplasmicProteinKinasesMAPKCascadesProteinKinaseCIsoformsCytosolicCa2+ConcentrationsTranscriptionFactor28自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第28页RoleofROSinEGFReceptor-MediatedSignalling29自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第29页

MAPK信号级联反应StimulusGrowthfactors,Mitogen,GPCRp38MAPKStress,GPCR,Inflammatorycytokines,GrowthfactorsStress,Growthfactors,Mitogen,GPCRMEKK1,4,MLK3,ASK1MEKK2,3,Tpl2MLK3,TAK,DLKRaf,Mos,Tpl2MKK3/6MEK1/2MKK4/7MEK5ERK1/2MAPKKKGrowth,Differentiation,DevelopmentInflammation,Apoptosis,Growth,DifferentiationGrowth,Differentiation,DevelopmentERK5/BMK1JNK1,2,3MAPKKMAPKBiologicalresponses自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第30页自由基检测31自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第31页化学发光法检测原理：活性氧、氧自由基与发光增效剂反应，释放能量，产生化学发光。检测对象：超氧阴离子、羟自由基、H2O2

和脂质过氧化产生自由基都能够产生化学发光。优点：灵敏、快速、操作简单、价格低廉。缺点：非特异性。另外，几乎全部氧化剂，如次氯酸、高锰酸钾等都能够与发光增效剂反应，产生化学发光，严重干扰活性氧检测。Fe2+也能够产生非常强化学发光。32自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第32页二氢乙啶(Dihydroethidium,DHE)

检测原理：可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内超氧阴离子氧化，形成氧化乙啶；氧化乙啶可掺入染色体DNA中，产生红色荧光。用流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察，是一个快速简便组织或培养活细胞中ROS经典检测方法。33自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第33页Circulation.;117:1045-1054.DeterminationofROSbyDHEStaining34自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第34页检测原理：在碱性条件下，光泽精与超氧阴离子等过氧化物作用形成激发态N2甲基吖啶(N2methylacridan)。并发出450nm激发光，测量此激发光强度即可定量产生超氧阴离子浓度。能够定量，但检测时间长，并需要新鲜组织样本。Lucigenin(光泽精)-EnhancedChemiluminescence35自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第35页DeterminationofROSbyLucigenin-EnhancedChemiluminescence36自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第36页检测原理：DCFH-DA本身没有荧光，能够自由穿过细胞膜，进入细胞内后，能够被细胞内酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很轻易被装载到细胞内。细胞内活性氧能够氧化无荧光DCFH生成有荧光DCF，检测DCF荧光就能够得到细胞内活性氧水平。2’,7’-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)37自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第37页BrJPharmacol.;154(1):105-13.DeterminationofROSby

DCFH-DAStaining38自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第38页39自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第39页40自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第40页41自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第41页自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第42页影响自由基药品43自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第43页影响自由基药品抗氧化药品促氧化药品“以毒攻毒”44自由基损伤学说及抗氧化剂专家讲座第44页抗氧化药品①维生素类及内源性物质，如维生素E、维生素C、维生素A、GSH等；②活性氧防御酶类，如SOD、过氧化氢酶、过氧化物酶、Co-Q类等；③化合物，如SOD模拟化合物、普罗布考以及一些传统药品如硫酸锌、甘露醇、钙拮抗药、血管担心素转化酶抑制药、肼肽嗪、乙酰半胱氨酸、β2受体激动药及阻断药等；④中药及其有效成份，如银杏、丹参、云芝及其所含黄酮类、酚类、多糖类等.45自由基损伤学说及抗氧化