酵母双杂交系统专家讲座

主要从以下几方面介绍

酵母双杂交系统概念原理优点与缺点应用优化酵母双杂交系统专家讲座第1页酵母双杂交系统概念酵母双杂交系统是一个建立在酵母菌基础上遗传学分析方法，主要用于检测蛋白间相互作用及克隆与已知蛋白相关未知新基因。在功效基因组学和蛋白质组学研究中起主动促进作用。在细胞信号转导研究中，经过酵母双杂交系统能较全方面真实地反应细胞内信号蛋白网络性联络与调整。该法由Fields等人于1989年首次建立并得到广泛地应用。酵母双杂交系统专家讲座第2页酵母双杂交原理利用酵母作为真核蛋白相互作用模型利用诱饵质粒筛选文库或者单个已知蛋白经过汇报基因转录判定蛋白相互作用使用不一样培养基筛选阳性克隆酵母双杂交系统专家讲座第3页双杂交系统两个主要元件：转录激活因子：DNA结合结构域（DNAbindingdomain，简称为DB）和转录激活结构域（activationdomain，简称为AD）报道株：经改造、含报道基因重组质粒宿主细胞。最惯用是酵母细胞。酵母细胞作为报道株酵母双杂交系统含有许多优点①易于转化、便于回收扩增质粒；②含有可直接进行选择标识基因和特征性报道基因；③酵母内源性蛋白不易同起源于哺乳动物蛋白结合。酵母双杂交系统专家讲座第4页酵母双杂交模型DNA-BindingDomainBaitProteinPreyProteinTranscriptionActivatingRegionReporterGeneDNA-BindingSite酵母双杂交系统专家讲座第5页模型酵母双杂交系统专家讲座第6页文库筛选步骤将待测基因与Gal4或LexA或其它适当蛋白DNA结合域融合构建诱饵质粒将诱饵质粒转化缺乏汇报基因开启子酵母细胞株中，选择被转化酵母再将文库质粒转化到酵母中经过汇报基因功效筛选相互作用蛋白酵母双杂交系统专家讲座第7页序列分析

从酵母中分离质粒然后转化E.coli从大肠杆菌中提取质粒并测序在数据库中比对所测定序列与已知蛋白同源性酵母双杂交系统专家讲座第8页质粒构建在Gal4（或其它适当蛋白功效域）DNA结合域前面多克隆位点处插入待测基因序列构建诱饵质粒诱饵质粒含有筛选基因，比如氨苄青霉素抗性基因，Leu2,Ura3,orTrp1等。酵母双杂交系统专家讲座第9页实例：

酿酒酵母GAL4蛋白质N-端和C-端分别融合两种蛋白质相互作用可激活含有UAS（upstreamactivatingsequence，上游激活序列）汇报基因表示i.

GAL4蛋白质是一个调控基因，控制半乳糖利用酶类基因表示，这些基因5’-端存在UAS序列；ii.

GAL4存在两个结构域：N-端(1-147)含有UAS-DNA结合域(DNA-bindingdomain,BD),C-端(768-881)含有转录激活结构域(transcriptionalactivationdomain,AD)。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍含有各自功效，而且不一样两结构域可重建发挥转录激活作用。单独DB即使能和开启子结合，不过不能激活转录酵母双杂交系统专家讲座第10页酵母双杂交系统专家讲座第11页

iii.

假如AD和BD分别与两个基因编码序列融合，且两种蛋白质能相互发生结合，就可造成GAL1-LacZ基因表示。其中与AD融合基因称之为钓饵基因，与BD融合基因可称之为目标基因(即建立基因文库)。为了提升汇报基因表示活性，LacZ基因还能够与HIS3基因融合在一起，只有当HIS3基因表示量足够大时，转化细胞才能在合成培养基上生长。2)

操作步骤构建诱饵融合基因（AD）转化对应酵母菌株在检测平板上筛选构建文库（BD）阳性菌落提取质粒DNA，转化大肠杆菌阳性克隆深入判定

酵母双杂交系统专家讲座第12页酵母双杂交系统专家讲座第13页酵母双杂交系统优点与缺点优点快速取得相互作用蛋白基因只需单一步骤质粒构建在体内判定蛋白相互作用高度敏感--弱小，暂时相互作用也能判定能在整个时间段积聚弱小相互作用信号缺点首先，它并非对全部蛋白质适用；其次，假阳性发生较为繁多；再次，双杂交判定过程中要经过两次转化，而且，酵母细胞转化效率比细菌要低约4个数量级。最终，在一些酵母菌株中大量表示外源蛋白质常会带来毒性作用，从而影响菌株生长及汇报基因表型。酵母双杂交系统专家讲座第14页酵母双杂交系统应用酵母双杂交系统作为一个高度敏感、适合用于细胞核内外以至于细胞内外各种蛋白质在体研究体系，双杂交系统主要应用于：1、利用酵母双杂交发觉新蛋白质和蛋白质新功效。例：Engelender等人以神经末端蛋白alpha-synuclein蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交CLONTECHMATCHMARKERSYSTEM3为操作平台，从成人脑cDNA文库中发觉了与alpha-synuclein相互作用新蛋白Synphilin-12、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体相互作用。例：起源于矮牵牛黄烷酮醇还原酶DFR与其抗体scFv反应中，抗体单链三个可变区A4、G4、H3与抗原之间作用有强弱差异。Geert等利用酵母双杂交技术，将黄烷酮醇还原酶DFR作为诱饵蛋白，编码抗体三个可变区基因分别被克隆在AD-LIBRARY载体上，将BD-BAIT载体和每种AD-LIBRARY载体分别转化改造后酵母菌株中，并检测汇报基因在克隆菌落中表示活性，从而在活细胞水平上检测抗原和抗体免疫反应。酵母双杂交系统专家讲座第15页3、利用酵母双杂交筛选药品作用位点以及药品对蛋白质之间相互作用影响。比如：Dengue病毒能引发黄热病、肝炎等疾病，研究发觉它病毒RNA复制与依赖于RNARNA聚合酶（NS5）与拓扑异构酶NS3，以及细胞核转运受体BETA-importin相互作用相关。研究人员经过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用氨基酸序列。假如能找到对应基因药品阻断这些蛋白之间相互作用，就能够阻止RNA病毒复制，从而到达治疗这种疾病目标。4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（GenomeProteinLinkageMap）比如：HUA等人利用酵母双杂交技术，将全部已知基因和EST序列为诱饵，在表示文库中筛选与诱饵相互作用蛋白，从而找到基因之间联络，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些主要生命活动：如信号传导、代谢路径等有主要意义。酵母双杂交系统专家讲座第16页酵母双杂交系统方法优化(1)酵母接合型引入:Bendixenetal经过酵母接合型引用，防止了两次转化操作同时又提升了双杂交效率。(2)诱饵表示载体:惯用有二种，酵母细胞GAL4和来自大肠杆菌Lex