大蒜SOD酶的提取制备

大蒜SOD酶的提取制备

内容：细胞破碎及酶的抽提。酶的柱层析分离操作。包括装柱，恒流泵及部分收集器的试调，上样，洗脱等。酶的活力测定。

一.目的要求学习提取分离纯化超氧化物歧化酶的方法，掌握酶分离纯化的基本操作技术。包括以下内容：1．细胞破碎及酶的抽提；2．酶的柱层析分离操作；3．酶的活力测定。二.基本原理超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD,EC1.15.1.1)是一种歧化超氧负离子自由基O2─生成H2O2和O2的金属蛋白，为胞内酶，在生物体内具有延缓机体衰老，对肿瘤、自身免疫性疾病和辐射损伤具有重要的防御作用，是一种重要的药用酶。根据所含的金属离子，SOD可分为三类：Cu、Zn–SOD、Mn–SOD和Fe–SOD。SOD在生物界中分布极广，原核生物和真核生物中都有存在。本实验从大蒜中提取SOD，提取液经葡聚糖凝胶柱上层析，分离出SOD，然后用邻苯三酚法测定其酶活力。邻苯三酚在自氧化过程中产生有色中间物（红桔酚）和O2─,使溶液颜色变褐加深。加入SOD能歧化O2─阻止中间物（红桔酚）的积累，通过分光光度计比色分析反应液的颜色而测定其酶活力。三．材料器具材料：新鲜大蒜；SephadexG―75凝胶。仪器：高速组织捣碎机；高速冷冻离心机；层析柱（1×40cm）；自动部分收集器；恒流泵；进样器和微量进样器；可见/紫外分光光度计。试剂：（1）pH7.8,5mmol/L磷酸缓冲液（内含1mmol/LEDTA）；（2）考马斯亮蓝溶液：称取100mg考马斯亮蓝G―250于50ml95%乙醇中，摇动，待溶解后，加入100ml85%磷酸，反复震动后加蒸馏水定容至1000ml,过滤待用；（3）pH8.2,50mmol/LTris-HCl缓冲液；（4）50mmol/L邻苯三酚溶液；（5）10mmol/LHCl溶液4.试剂的配法

（1）pH8.2、50mmol/L

Tris-HCl

称取Tris

0.61g，EDTA-2Na

0.037g，用双蒸水溶解至80mL左右，用HCl调节pH

=8.20（用pH计校正），最后定容至100mL。

（2）10mmol/L

HCl

（3）50

mmol/L邻苯三酚

称取邻苯三酚0.063g，用10mmol/L

HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。

（4）SOD样液

四.实验操作(一)SOD的提取取新鲜大蒜适量,冷水浸泡24h,沥干，加冰冻的pH7.8,5mmol/L磷酸缓冲液适量，用高速组织捣碎机捣碎。用高速冷冻离心机以8000rpm离心除去固型物（需4—5次，每次15min）,上清液即SOD酶液。（二）SOD的凝胶层析分离纯化1.凝胶的准备：（1）

称取SephadexG―75干凝胶2g，加适量洗脱液沸水浴溶胀2小时（也可室温溶胀24小时）。（2）用倾斜法倾去表面悬浮的细小颗粒，室温储存于磷酸缓冲液中备用。2．装柱：

（1）将层析柱竖直固定于支架上,连接好恒流泵、部分收集器,调节洗脱液的操作压60cm。

（2）先向层析柱中加入1/3高度的pH7.8,5mmol/L磷酸缓冲液,然后用大口进样器吸取上述准备好的凝胶徐徐注入柱中缓冲液内,让其自然沉降，沉降好的柱床顶部离管口1—2cm为宜。若高度不够，可放去部分缓冲液，搅起管中凝胶界面，继续添加凝胶。

（3）装毕，用2—3个床体积的洗脱液洗脱，以使床柱稳定。

3．上样：（1）放去床表面上的缓冲液至与凝胶界面平齐。（2）用进样器吸取酶液0.5ml，加样时将进样器尖端接触柱内壁并在离床表面数毫米处随加随沿内壁转动一周，使样品尽快分布于全表面。然后打开恒流泵，待样品液面与床柱表面平齐时，关闭恒流泵，以少许（0.1—1ml）缓冲液冲洗内壁数次，在打开恒流泵，放至液面与床柱表面平齐。（3）先用进样器加1cm高度的缓冲液覆盖样品，然后加足缓冲液，连接好进液管。

4．洗脱：开启部分收集器和恒流泵，以pH7.8,5mmol/L磷酸缓冲液进行洗脱。调节流速，控制每管收集洗脱液1ml，每管按收集顺序做好标记。5．洗脱液酶蛋白含量的测定：：（1）取洁净试管数支，分别加入考马斯亮蓝溶液3ml,摇匀，将其中一支试管不加任何试液作为对照管，其余的分别加入从第五收集管起的洗脱收集液50μl,反复摇匀。（2）以对照管为调零液，用1cm比色杯在595nm波长下测定各管的OD595nm值。（3）合并OD595nm值高的原收集液，此即纯化的SOD酶液。保留测酶活力。（4）测定完毕，先用乙醇洗去比色杯的颜色，再用蒸馏水荡洗，用擦镜纸拭干水珠，倒扣在培养皿内。（5）清理干净工作台，在仪器使用登记本上登记使用情况。（三）SOD酶活力测定在一般情况下，SOD活性测定只能应用间接活性测定法。其测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2

-，利用SOD分解而间接推算酶活力。在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。本实验采用邻苯三酚自氧化方法。邻苯三酚自氧化法原理：邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2

-（超氧阴离子自由基），生成带色的中间产物（红桔酚），反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。本实验中测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在325nm波长出有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能催化O2

-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间有色产物的积累，导致吸光值下降因此，通过测定它们在特定波长下得光吸收变化速率计算出SOD的酶活性。

邻苯三酚───────O2

-+红桔酚（自氧化：有色物质积累，吸光值增加）

2O2

-+2H+────H2O2+O2（SOD催化：阻止中间产物积累，吸光值降低）

pH=8.2SOD实验步骤：1．测定邻苯三酚溶液自氧化速率：取两支试管按右表加入25℃预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L

HCl代替邻苯三酚

），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化。要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.070士0.002（可增减邻苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。试剂空白管（mL）自氧化管（mL）pH8.2、50mmol/L

Tris-HCl4.54.510mmol/LHCl0.01——45mmol/L邻苯三酚——0.012.SOD样液活力测定：样品管取代自氧化管。样品管测定时先加入预热的待测酶液，在25℃水浴锅中保温10min，再加入预热的邻苯三酚。其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。试剂空白管（mL）样品管（mL）pH8.250mmol/LTris-HCl4.54.510mmol/LHCl0.015——SOD样酶——0.00545mmol/L邻苯三酚——0.013.数据处理3.1加入SOD酶前后邻苯三酚自氧化速率的计算

时间30s60s90s120s150s180s210s自氧化大蒜提取液SOD标准品3.2SOD酶活力计算：(酶活力单位定义:在一定条件下,每1mL反应液中每分钟抑制邻苯三