DNS氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析

DNS氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析第1页/共52页吸附层析的概念及原理吸附---一种物质被聚集在另一种物质表面的现象。吸附剂：

---凡是能够将其他物质聚集到本身分子表面的物质称为吸附剂，如氧化铝、硅胶等。被吸附物

---聚集在吸附剂表面的分子就称为被吸附物。第2页/共52页吸附层析（AbsorptionChromatography)各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心,利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离.第3页/共52页主要是利用吸附剂对不同物质吸附力的不同而达到分离的目的。薄层层析中吸附剂选择是关键。吸附剂第4页/共52页吸附剂的选择（1）应不溶于所使用的溶剂;与所使用的溶剂和样品中各组分不起化学反应；（2）应具有较大的吸附表面（吸附容量）和一定的吸附力;对被分离个组分有不同的吸附力,有足够的分辨力；（3）吸附剂颗粒大小要均匀，保持良好的重复性。第5页/共52页吸附剂的吸附能力常称为活度，用罗马字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ表示。

活度强弱含水量多少第6页/共52页常用吸附剂极性：硅胶:为首选吸附剂。本身具微酸性，适用于分离酸性及中性物质。氧化铝:氧化铝具有分离能力强、活性可以控制等优点碱性/中性/酸性氧化铝……非极性：纤维素聚酰胺：→合成：己二酸、己二胺→特点：氢键吸附剂……第7页/共52页是—类化学纤维原料，即锦纶(又称尼龙)。由己二酸与己二胺聚合而成。因为在这类物质分子中都含有大量酰胺基团，故统称聚酰胺。聚酰胺第8页/共52页——是由于聚酰胺的-C＝O(羰基)及>NH(氨基)能与被分离物质之间形成氢键。如酚类(包括黄酮类、鞣质等)和酸类（如核苷酸、氨基酸等)是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢键如硝基化合物和醌类等物质与酰胺键的氨基形成氢键被分离物质形成氢键能力的强弱，确定吸附能力的差异。在层析过程中，展层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。因此选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数能有较大差异，经过吸附与解吸的展层过程，可以一一分离.聚酰胺对极性物质的吸附作用第9页/共52页溶剂不同溶剂具有不同的结构性质，依极性大小各种溶剂的洗脱能力各不相同。一般所选溶剂要求：a.纯度合格b.黏度要小→易与样品中各组分相分离c.与所欲分离样品和吸附剂不起化学反应第10页/共52页溶剂选择考虑因素1、溶剂与吸附剂之间的相互作用力2、溶剂与样品之间的作用因素溶剂的选择可通过实验来确定。第11页/共52页薄层层析的操作1、点样样品最好溶解在挥发性的溶剂中，如氯仿、丙酮等，避免用水每次点少量样品，可在溶剂挥发后反复进行至点完为止。样品原点直径＜3mm第12页/共52页2.平衡3.展开方法：上行层析法下行层析法双向展开法第13页/共52页显色1）有色物质（如黄体酮）展开后即可显出斑点2）紫外灯下显出荧光斑点，如核苷酸和某些生物碱3）显色剂显色第14页/共52页荧光试剂——DNS-Cl二甲氨基萘磺酰氯蛋白质、多肽、氨基酸可与其游离氨基结合DNS-aa发出黄绿色荧光第15页/共52页DNS-Cl在pH过高时，水解产生副产物DNS-OH，即：第16页/共52页在DNS-Cl过量时，会产生DNS-NH2，即：第17页/共52页DNS-氨基酸在紫外光照射下呈现黄色荧光DNS-OH和DNS-NH2产生蓝色荧光→可彼此区分。第18页/共52页三、薄层层析的应用（一）定性分析：将已知化合物作为标准品与样品一起进行层析后对照，可初步确定未知化合物的组成。（二）定量分析：可直接在薄板上测定，无须破坏薄层；用工具将斑点从薄层上取下，用溶剂洗脱，再用其他方法测定。第19页/共52页临床生化上的应用1.氨基酸的分离2.核苷、核苷酸和核酸的分析第20页/共52页DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析

二甲氨基萘磺酰氯(1-Dimethylaminonaphtalene-5-sulfonylchloride，DNS-Cl)可与氨基酸的游离氨基结合成DNS-氨基酸。形成的DNS-氨基酸在紫外线（260nm或365nm）照射下发出强烈的黄色荧光，因此可用荧光检测DNS-氨基酸的存在。第21页/共52页pH9.840℃,30min第22页/共52页本实验中，聚酰胺上胺基与氨基酸的羰基形成氢键，酰胺基团上羰基与AA中羟基或酚基形成氢键。由于有些AA结构相似，如只采用一种溶剂系统进行单向层析，难达到完全分离的目的。因此可选择另一溶剂系统进行第二向层析。

第一向——苯－冰醋酸第二向——甲酸－水第23页/共52页二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）可与氨基酸的游离氨基结合成DNS-氨基酸。形成的DNS-氨基酸在紫外光下呈黄绿色荧光。

DNS-Cl+AADNS-AA+HCl

反应的副产物：DNS-NH2黄色荧光和DNS-OH蓝色荧光显色第24页/共52页DNS-氨基酸的双向层析图谱ⅠⅡ颉亮苯丙赖甘丝天脯谷第25页/共52页1、DNS－氨基酸的制备2、混合DNS－氨基酸的双向层析（1）点样。距右下角距两边各0.5cm，直径控制在2－3mm之间，点在无光泽面,可重复几次点样。（2）苯－冰醋酸层析：展层剂前缘距薄膜顶端3mm处即可停止,冷风吹干，紫外观察。（3）甲酸－水层析：调转90度与第一相垂直，热风吹干，紫外灯下观察，用铅笔轻轻标记。操作以及注意事项第26页/共52页（1）严格控制点样位置以及点样直径。（2）展层时勿将点样浸入溶剂系统。（3）展层后必须经电吹风将膜吹干。（4）使用紫外照射时要注意使用时间短.注意第27页/共52页ProcedureforTLC1.Preparethedevelopingcontainer.ThedevelopingcontainerforTLCcanbeaspeciallydesignedchamber,ajarwithalid,orabeakerwithawatchglassonthetop:

第28页/共52页Poursolventintothebeakertoadepthofjustlessthan0.5cm.

第29页/共52页ToaidinthesaturationoftheTLCchamberwithsolventvapors,linepartoftheinsideofthebeakerwithfilterpaper

第30页/共52页Coverthebeakerwithawatchglass,swirlitgently,andallowittostandwhileyouprepareyourTLCplate.

第31页/共52页TLCplatesusedintheorganicchemteachinglabsarepurchasedas5cmx20cmsheets.Eachlargesheetiscuthorizontallyintoplateswhichare5cmtallbyvariouswidths;themoresamplesyouplantorunonaplate,thewideritneedstobe.PreparetheTLCplate.第32页/共52页ShowninthephotototheleftisaboxofTLCplates,alargeun-cutTLCsheet,andasmallTLCplatewhichhasbeencuttoaconvenientsize.

Plateswillusuallybecutandreadyforyouwhenyoucometolab.Handletheplatescarefullysothatyoudonotdisturbthecoatingofadsorbentorgetthemdirty.第33页/共52页Measure0.5cmfromthebottomoftheplate.Takecarenottopresssohardwiththepencilthatyoudisturbtheadsorbent.

第34页/共52页Usingapencil,drawalineacrosstheplateatthe0.5cmmark.Thisistheorigin:thelineonwhichyouwill"spot"theplate.第35页/共52页It'skindofhardtoseethepencillineintheabovephotos,sohereisaclose-upofhowtheplatelooksafterthelinehasbeendrawn.第36页/共52页Undertheline,marklightlythenameofthesamplesyouwillspotontheplate,ormarknumbersfortimepoints.Leaveenoughspacebetweenthesamplessothattheydonotruntogether,about4samplesona5cmwideplateisadvised.Useapencilanddonotpressdownsohardthatyoudisturbthesurfaceoftheplate.Aclose-upofaplatelabeled"123"isshowntotheright.第37页/共52页SpottheTLCplate

...swirluntildissolvedaddafewdropsofsolvent...

第38页/共52页dipthemicrocapintosolution-thearrowpointstothemicrocap,itistinyandhardtosee

makesureitisfilled-holdituptothelightifnecessary

第39页/共52页touchthefilledmicrocaptoTLCplatetospotit-makesureyouwatchtoseethatalltheliquidhasdrainedfromthemicrocap

第40页/共52页rinsethemicrocapwithcleansolventbyfirstfillingit...

...andthendrainingitbytouchingittoapapertowel

第41页/共52页here'stheTLCplate,spottedandreadytobedeveloped

第42页/共52页Developtheplate.placetheTLCplateinthedevelopingcontainer-makesurethesolventisnottoodeep第43页/共52页ThesolventwillriseuptheTLCplatebycapillaryaction.Inthisphoto,itisnotquitehalfwayuptheplate.Inthisphoto,itisabout3/4ofthewayuptheplate.第44页/共52页Removetheplatefromthebeaker.第45页/共52页quicklymarkalineacrosstheplateatthesolventfrontwithapencilAllowthesolventtoevaporatecompletelyfromtheplate.Ifthespotsarecolored,simplymarkthemwithapencil.第46页/共52页Visualizethespots

MostsamplesarenotcoloredandneedtobevisualizedwithaUVlamp.HoldaUVlampovertheplateandmarkanyspotswhichyouseelightlywithapencil.thisisaUVlamp

第47页/共52页herearetwopropersizedspots,viewedunderaUVlamp

(youwouldcirclethesewhileviewingthem)第48页/共52页Theplateshowsthree