激活态雪旺细胞临床应用安全性的实验分析

激活态雪旺细胞临床应用平安激活态雪旺细胞临床应用平安性的实验研究中文摘要引言：组织工程为周围神经缺损的修复提供了新的方法，填充了雪旺细胞的可吸收人工神经导管有望在将来替代自体神经移植应用于临床。通过“激活液"(专利申请中)外源性刺激获得的激活态雪旺细胞，在增殖能力和分泌活性都明显超过正常的雪旺细胞，而且促进神经再生的效果也明显增强。体外培养、扩增的激活态雪旺细胞应用于临床的一个必要前提是平安可靠，无致癌性、致畸性。本研究的目的是联合体内、体外多个实验，检测激活态雪旺细胞是否平安，有无应用于临床的可能。本研究共分为4个局部：第一局部培养成年大鼠雪旺细胞的关键技术的比拟研究目的：通过横向比拟，探索适合临床应用的成年雪旺细胞培养技术。方法：成年SD大鼠，分4组，每组10只，从双侧坐骨神经取材培养雪旺细胞。A组采用体内预变性法+快速酶消化法；B组采用体内预变性法+慢速酶消化法；C组采用体外预变性法+快速酶消化法；D组采用体外预变性法+慢速酶消化法。细胞传代使用冷喷射传代法和胰酶消化传代法。比拟(1)体内、体外预变性增加取材神经中雪旺细胞的数目有无差异；(2)快速、慢速酶消化法从神经中获取雪旺细胞的效率；(3)冷喷射传代法和胰酶消化传代法的效率。筛选使动物痛苦小、而雪旺细胞数量多、纯度高等最适合临床应用的方法。结果：体外预变性和体内预变性都能明显增加取材神经中的雪旺细胞数目，无统计学差异，但体外预变性减轻了患者的痛苦。快速酶消化法和慢速酶消化法在培养1周时获得的雪旺细胞数目相似，无统计学差异。冷喷射传代法兼有纯化雪旺细胞的作用，会损失一定数量的雪旺细胞，对操作者技术要求高；胰酶消化传代法没有纯化的作用，对操作者技术要求低。结论：体外预变性减轻患者痛苦，更适合临床应用；快速、慢速酶消化法效果无明显差异，均可考虑应用；冷喷射传代法可以和胰酶消化传代法有机结合使用，前者在雪旺细胞纯度较低时应用，后者在雪旺细胞纯度较高时应用。【关键词】雪旺细胞；预变性；酶消化法；传代法；比拟学研究第二局部第二局部激活态雪旺细胞体外生物学特性的实验研究目的：体外检测激活态雪旺细胞的生物学特性，与良性、恶性细胞比照，分析其是否有恶性细胞的特点。方法：从成年大鼠坐骨神经中别离并体外培养激活态雪旺细胞，通过对细胞形态的连续观察、生长方式的变化、免疫学标志物鉴定、增殖率和纯度检测、迁移能力和侵袭能力检测、染色体核型分析，及全基因组表达谱基因芯片、细胞因子抗体芯片检测，对激活态雪旺细胞的生物学特性进行综合评估。结果：激活态雪旺细胞在体外培养形态均一、无异质性变化。增殖能力增加，受密度抑制影响减小。连续传代不丧失$100、P75岍8、GFAP等免疫学标识物，迁移能力、侵袭能力略有增加，但明显弱于恶性细胞。染色体仍为2倍体。基因和蛋白表达存在动态平衡，第2、3代总体表达最高。结论：从成年大鼠周围神经别离并体外培养获得的激活态雪旺细胞，根本不具备恶性细胞的生物学特性。【关键词】激活态雪旺细胞；形态学；免疫学标志物；迁移；侵袭；核型分析；芯片第三局部激活态雪旺细胞自体移植后的体内过程目的：模拟临床应用，探索激活态雪旺细胞的体内变化过程，是否会形成肿瘤。方法：从成年大鼠双侧坐骨神经培养足量的激活态雪旺细胞，移植到自体腋窝下，与良性、恶性细胞移植比照。50只成年大鼠分三组：A组：激活态雪旺细胞，自体移植细胞数目1×107个，大鼠20只；B：正常雪旺细胞，自体移植细胞数目1×107个，大鼠20只；C组，恶性大鼠胶质瘤C6细胞，移植细胞数目2×106个，大鼠10只。分别在移植细胞后0．5个月、1个月、2个月、4个月、6个月对大鼠腋窝注射细胞处取材，观察大体标本上是否有细胞团或肿瘤形成，解剖局部及内脏观察有无肿瘤转移灶的形成。将局部的细胞团块或肿瘤做免疫组织化学鉴定，并查找病理性核分裂相。结果：注射恶性细胞的大鼠(C组)，均在0．5～1个月长出肿瘤。而激活态雪旺细胞组(A组)和正常雪旺细胞组(B组)在体内不形成肿瘤，体内的过程相似，至少可以在腋窝下存活2个月，并表达免疫学标志物。结论：激活态雪旺细胞在体内非正常微环境下至少可以存活2个月，并表达免疫2学标志物，不形成肿瘤。【关键词】激活态雪旺细胞；自体移植；致癌性；核分裂相学标志物，不形成肿瘤。【关键词】激活态雪旺细胞；自体移植；致癌性；核分裂相第四局部激活态雪旺细胞自体移植对后代影响的实验研究目的：探索激活态雪旺细胞自体移植是否对后代产生影响。方法：从成年雌性动物坐骨神经培养出足量的激活态雪旺细胞后自体移植，然后与雄性大鼠同笼喂养3个月。与单纯坐骨神经切除的动物比照后代的生物学性状，如怀孕率，新生鼠的活胎数、死胎数、体重、体长、尾长的比拟，染色体数目的检测。新生鼠4周时的发育、根本行为能力、对伤害的认知等。结果：无论是否移植激活态雪旺细胞，单侧坐骨神经切除后的成年雌性大鼠，3个月内怀孕率均为40％。实验组和对照组的新生鼠的活胎数、死胎数、体重、体长、尾长无统计学差异，新生鼠发育状况、根本行为能力、对伤害的认知等均未见明显异常。新生鼠的染色体仍为21对。结论：激活态雪旺细胞的自体移植对成年雌性动物的后代的生物学性状不产生明显的影响。【关键词】激活态雪旺细胞；自体移植；雌性；后代；发育ExperimentalExperimentalstudiesonsafenessofactivatedSchwanncellsinclinicalapplicationABSTRACTIntroduction：Tissueengineeringsuppliesanewapproachinrepairingperipheralnervedefects．TheabsorbableartificialnerveconduitsfilledwithSchwanncellscouldbeanalternativesubstituteofperipheralnerveautograft．ActivatedSchwarmcells，whichareacquiredthroughstimulatingSchwanncellswith“activationliquid'’(patentinapplying)，havehigherreproductiveactivityandsecretemoregrowthfactors．Furthermore，activatedSchwanncellsappeartofacilitatemuchmoreperipheralnerveregeneration．AnimportantprerequisiteofactivatedSchwanncellsutilizinginclinicalapplicationisabsolutesafeness，thatis，nocarcinogenicityandnoteratogenicity．TheaimofthisstudywastodetectthemalignantpotentialofactivatedSchwanncellsinvitroandinvivo．Thisstudyincludesfourparts：PartoneComparativestudiesoftechniquesinSehwanncellculturefromadultratsobjective：WeaimtofindsomeclinicallyapplicabletechniquesinadultSchwanncellculturethroughcomparativestudy．Methods：Fourtyadultratswererandomlydividedinto4groups．Schwanncellswereharvestedfrombilateralsciaticnerves．GroupA：Predegenerationinvivo+Fastenzymedigestion；GroupB：Predegenerationinvivo+Slowenzymedigestion；GroupC：Predegenerationinvitro+Fastenzymedigestion；Group：Pregegenerationinvitro+Slowenzymedigestion．Cellswerepassagedwithcoldjetortrypsinization．Comparativestudiesinclude：(1)ThedifferenceofpredegenerationbetweeninvitroandinvivoinincreasingthenumberofSchwanncellswithinperipheralnerves；(2)TheefficiencyofharvestingSchwanncellsbetweenfastenzymedigestionandslowenzymedigestion；(3)Theefficiencyofcoldjetandtrypsinizationinpassage．Throughcomparativestudies，themostsuitablemethodswerefoundtocultureSchwanncellsinclinicalapplication．Results：Predegeneration，bothinvivoandinvitrowereeffectiveinincreasingthenumberofSchwanncellswithinperipheralnerves．ThenumberofSchwanncells4expandedexpandedinvitrofor1week，weresimilarwitheitherfastenzymedigestionorslowenzymedigestion．NostatisticalsignificanceWaSfoundamongthefourgroups．Bothcoldjetandtrypsinizationwereeffectiveinpassage．ThedifferenceswerethatcoldjetcouldpurifySchwanncellsduringpassage，butneedsskillfuloperatorsandlossesacertainnumberofcells；andtrypsinizationdoestheopposite．Conclusion：Predegenerationinvitroalleviatespatients’suffering，andmoreapplicableinclinicalmedicine．BothfastandslowenzymedigestioncouldbeuseinharvestingSchwanncellsfromperipheralnerves．ColdjetandtrypsinizationshouldbecombinedinpassagingSchwanncells．KeywordsSchwanncell；predegeneration；enzymedigestion；passage；comparativestudyPartTw0InvitrostudiesofbiologicalcharacteristicsofactivatedSehwanneeHsobjeetive：WeaimtoassessthemalignantpotentialofactivatedSchwarmcellsinvitrothroughcomparison、杭mbothbenignandmalignantcells．Methods：Afterdissociationfromadultratsciaticnerves，activatedSchwanncellswereculturedinvitro．WedetectedthebiologicalcharacteristicsofactivatedSchwanncellsinvitrothroughaserialofexperiments，suchassuccessivecellmorphologyandgrowthpatternobservations，immunologicalmarkeridentifications，proliferationindexandpuritydetections，woundhealingassayandTranswellinvasionassay,karyotypeanalysisanddetectionsofgeneexpressionprofilingchipsandcytokineantibodychips．AndthecharacteristicsofactivatedSchwanncellswerecomparedwithnormalSchwanncellsandmalignantcells．Results：MorphologyofactivatedSchwanncellsWasthesamewithnormalones．Proliferationactivitywasincreased，anddensityinhibitionWasdecreasedinactivatedSchwanncells．ActivationandsuccessivepassagesdidnotinfluencetheexpressionofimmunologicalmarkersofSchwanncells．ProliferationrateofactivatedSchwanncellswashigherthannormalones．Afteractivation，theabilitiesofmigrationandinvasionofSchwanncellswerealittleenhanced，however’muchlowerthanmalignantcells．ThekaryotypeofactivatedSchwanncellsWasnormal．Theexpressionsofgenesandproteinswereunderdynamicbalance，andthehighestviabilitywasinthesecondandthirdpassages．5Conclusion：ActivatedConclusion：ActivatedSchwanncells，whichweredissociatedfromratperipheralnervesandexpandedinvitro，havenobiologicalcharacteristicsofmalignantcells．Keywords ActivatedSchwanncell；morphology；immunologicalmarker；migration；invasion；karyotypeanalysis；chipPartThreeInvivostudiesofactivatedSchwanncellsafterautotransplantationObjective：ThisstudywastodetectwhetheractivatedSchwanncellshavecarcinogenicityinvivoornot．Methods：SufficientactivatedSchwanncellswereharvestedfromratbilateralsciaticnerves．Thenthecellswerewereautotransplantedintoaxillaryfossatoseewhethertheycouldproducetumorsinvivoornot．NormalSchwanncellswereusedasanegativecontrol，andmalignantratC6gliomacellswereusedasapositivecontr01．activatedFi坶ratswererandomlydividedinto3groups．GroupA：Atotalof1l0Schwanncellswereautotransplantedintorightaxillaryfossaof20rats；GroupB：Atotalof1l07normalSchwanncellswereautotransplantedintorightaxillaryfossaof20rats；GroupC：Atotalof2x106ratgliomacellsweretransplantedintofightaxillaryfossaof10rats．Equivalentratsweresacrificedat0．5months，1months，2months，4monthsand6monthsaftercelltransplantation，respectively．Thecompletegrossnecropsiesofadjacentorgansweredonetofindanypotentialhypercellulararea，whichwerefurtherexaminedhistologically．Theoriginofcellmasswasidentifiedthroughimmunohistochemistry．KaryokinesiswasobservedinsectionsfromallcellmassesafterH&Estaining．Results：Allthe10ratsreceivingC6celltransplantationdevelopedtumorsduring0．5to1month．AndallratswhichwereautotransplantedwithSchwanncells，whetheractivatedornormalSchwanncells，werefoundnotumorformation．AndSchwanncellscouldsurviveataxillaryfossaforatleast2monthsandexpressimmunologicalmarkers．Conclusion：ActivatedSchwanncellscouldsurviveandexpressimmunologicalmarkersatleast2monthsinabnormalmicro—enviromentinvivo，andproducenotumors．KeywordsActivatedSchwanncell；autotransplantation；carcinogenicity；karyokinesis6PartPartFourTheinfluenceofautotransplantationofactivatedSchwanncellsondescendantsobjecfive：ThisstudywastodetectwhetherautotransplantationofactivatedSchwanncellshaveinfluencesondescendants．Methods：SufficientactivatedSchwanncellswereharvestedfromsciaticnervesofadultfemalerats．Adultfemaleratssimplyresectedsciaticnerveswereusedascontrols．Afterautotransplantation，allratswerecagedwitllmalerats．Itemsofcomparativedetectioninclude：pregnancyrate，theamountoffoeti，boayweight，bodylength，taillengthandchromosomenumber．Itwasalsoobservedthatgrowth，fundamentalbehavioralcapacityandcognitionofinjurytillfourweeks．Result：砀epregnancyratesofadultfemaleratswhichwereresectedofunilateralsciaticnervewere40％in3months．Nodifferencewasseenbetweenautotransplantationandcontrolgroup．Similarly,nosignificantdifferenceWasseeninparametersofnewlybornrats，suchaslivefeoti，deadfeoti，bodyweight，bodylength，taillength，eta1．Noabnormalitieswerefoundingrowth，fundamentalbehavioralcapacityandcognitionofinjuryofnewlybornratsfourweekslater．111echromosomenumberofnewlybornratsWas42．Conclusion：AutotransplationofactivatedSchwanncellsdidnotinfluencethebiologicalcharacteristicsofdescendantsofadultfemalerats．KeywordsActivatedSchwanncell；autotransplantation；female；descendant；growth7刖蟊周围神经缺损是临床常见疾患之一。对于各种原因引起的周围神经缺损，目刖蟊周围神经缺损是临床常见疾患之一。对于各种原因引起的周围神经缺损，目前临床上仍采用自体感觉神经移植修复。然而，该方法有其难以克服的缺点。第一，来源有限，管径不相匹配；第二，供区感觉丧失、切口遗留疤痕；第二，感觉和运动神经相互不匹配。有学者证实运动神经损伤后，使用运动神经移植优于感觉神经移植n3，其原因在于感觉神经和运动神经中的雪旺细胞(Schwanncell，SC)具有不同的表型，功能有差异瞳1；第三，自体神经中的硫酸软骨素蛋白聚糖抑制再生口3。所以周围神经组织工程替代物，近百年来一直是研究的热点。人们早期研究用硅胶管、肌肉、血管等作为替代物去修复周围神经的缺损，效果有限H1。随着组织工程学、材料学等的不断进步，组织工程神经导管(体内可降解、组织相容性好、无细胞毒性)被认为最有潜力作为周围神经替代物，在美国等兴旺国家已在临床上使用，但是只能修复最细神经(指固有神经)短距离(耋3cm)缺损畸，6|。Sinis等n1将SC体外扩增后放入导管中去修复周围神经缺损，以提高周围神经再生和促进肢体功能恢复，然而不能到达加速周围神经再生的预期目标，可能缘于这些研究中应用的SC分裂增殖缓慢、生物活性低。所以，要增加神经导管修复长度，神经导管内必须填充足量的、高生物活性的细胞。劳杰等随1在2000年应用其改进的细胞培养技术，首创提取“激活态雪旺细胞〞(ActivatedSchwanncell，ASC)，其特点是在预变性获得的成年原代SC培养中参加该研究团队自行研制的“激活液"单次刺激30分钟，使SC增殖加速、分泌增强睁111。蒋良福等四’103发现ASC比SC在生长相关蛋白43、脑源性神经生长因子、C-JUN、P21基因mRNA水平增高。何继银等n羽发现ASC与SC的差异在于通过不同的信号转导通路发挥作用，ASC和SC是同一种细胞的两种状态。蒋良福等n33将自体ASC培养在几丁糖一胶原膜外表，缝制成导管，修复成年大鼠坐骨神经lOmm缺损，能有效促进神经再生，并且和自体神经移植效果接近，优于未激活的SC。由此可见，ASC具有填充到人工神经导管，修复长距离神经缺损的潜质。然而，应用于临床的一个必要前提是平安可靠。具有可能致癌、致畸作用的生物制品(包括细胞、蛋白等)绝对不能应用于临床。国内外有很多学者通过加入高浓度的有丝分裂剂体外培养SC，也能在短期内获得大量的高生物活性的SC。如应用神经调节蛋白家族(包括heregulin，神经胶质生长因子等)、腺苷酸环化酶激活剂(forskolin、霍乱毒素n钔等)、神经营养因子(如碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子)、牛垂体提取液(含神经胶质生长因子、血小板源性生长因子等)、神经轴膜碎片、髓磷脂碱性蛋白及其衍生物等n5。171。然而这些8有丝分裂剂的大量使用，可能增加SC的永生性。有报道SC在高浓度丝裂原中持有丝分裂剂的大量使用，可能增加SC的永生性。有报道SC在高浓度丝裂原中持续培养一段时间后(如联合应用heregulin和forskolinn8’19]，及长期应用霍乱毒素n43)可能会引起永生，将不再依赖丝裂原存活及分裂，即使重新用不添加丝裂原及血清的根底培养基培养，也能保持高增殖率，但是会逐渐失去披髓的能力，并且植入同源大鼠体内引起肿瘤形成n8’193。ASC不同于既往报道的通过参加有丝分裂剂持续培养获得的永生细胞，而是通过“激活液〞单次刺激后获得，其激活状态是否一直维持在高水平，还是能够逐渐下降，最后回归正常值?刺激后有没有引起染色体的损伤?有没有引起基因表达的失衡带来不良后果?会不会出现恶变?植入体内能否形成肿瘤?即ASC能否作为平安可靠的细胞应用于临床?本课题将围绕与ASC能否适用于临床，及与平安性有关的生物学特性进行研究，具体如下：一、 筛选适合临床应用的培养ASC的技术。要求方法简单、容易重复、费用小、患者痛苦小、取材最少的自体神经在最短时间内培养出最高数量的高纯度ASC。二、 体外实验：(一)ASC的形态学、生长方式的动态变化，是否出现异质性?是否发生了肿瘤细胞样变化?(--)ASC每代的增殖能力和纯度是否一致?(三)ASC的迁移能力是否较SC明显增加?与恶性胶质细胞相比方何?(四)ASC的侵袭能力是否较SC明显增加?与恶性胶质细胞相比方何?(五)ASC的免疫学标志物是否丧失?(六)ASC的染色体数目是否正常?(七)ASC的基因表达(转录水平)是否呈现动态平衡，有无紊乱?(八)ASC的蛋白表达(翻译水平)是否呈现动态平衡，有无紊乱?三、 体内实验：(一)ASC在体内非正常微环境下的存活时间?(二)ASC在体外是否致癌?9四、 四、 ASC自体移植对母体及后代的影响(--)ASC自体移植是否对母体产生影响，导致怀孕率下降?(二)ASC自体移植是否对后代产生影响，导致先天畸形或后天发育不良?本论文的创新点：1．在现有培养方法的根底上，筛选适合用于临床应用的培养技术。2．验证了ASC是平安的细胞，不具有致癌性和致畸性，在体内非正常微环境下至少存活2个月。可用于临床上填充神经导管，修复周围神经缺损。参考文献[1]BrennerMJ，HessJR，MyckatynTM，eta1．Repairofmotornervegaps谢t11sensorynerveinhibitsregenerationinrats．[J】．Laryngoscope，2023，116(9)：1685-1692．[2】HokeA，RedeRRHameedH，eta1．Schwanncellsexpressmotorandsensoryphenotypesthatregulateaxonregeneration．【J]．JNeurosci，2023，26(38)：9646-9655．【3】NeubauerD，GrahamJB，MuirD．Chondroitinasetreatmentincreasestheeffectivelengthofacellularnervegrains．【J]．ExpNeurol，2023，207(1)：163-170．[4]李岩峰，劳杰．组织工程神经导管研究进展【J]．中华创伤杂志，2023，25(4)：381．384．【5]IchiharaS，InadaY，NakamuraT．Artificialnervetubesandtheirapplicationforrepairofpefipheralnerveinjury：anupdateofcurrentconcepts[J]．Injury-internationaljournalofthecareoftheiIljured，2023：$29一$39．【6】WeberRA，BreidenbachWC，BrownRE，eta1．Arandomizedprospectivestudyofpolyglycolicacidconduitsfordigitalnervereconstructioninhumans．[J】．PlastReconstrSurg，2000，106(5)：1036-1045，1046-1048．[7]SinisN，SchallerH，Schulte—EversumC．Nerveregenerationacrossa2-cmgapintheratmediannerveusingaresorbablenerveconduitfilled、析tllSchwanncells[J]．JournalofNeurosurgery，2023，103(6)：1067-1076．[8】劳杰，熊良俭，顾玉东，等．应用激活态雪旺细胞充填导管修复周围神经缺损的初步研究[J】．中华手外科杂志，2000，16(04)：136,140．[9】9劳杰，姜良福，顾玉东，等．脑源性神经营养因子在激活态雪旺细胞中表达的初步实验研究【J]．中华手外科杂志，2023，19(2)：109—111．【lO】劳杰，蒋良福，顾玉东．激活态雪旺细胞生长相关蛋1刍43mRNA表达的研究[J】．中华骨科杂志，2023，25(6)：372．374．10[11]劳杰，顾玉东．激活态雪旺细胞在细胞培养下的生长规律【J]．中华手外科杂志，[11]劳杰，顾玉东．激活态雪旺细胞在细胞培养下的生长规律【J]．中华手外科杂志，2023，18(3)：174-176．[12】何继银，劳杰，顾玉东，等．激活态雪旺细胞信号转导通路的分子构成[J】．中华手外科杂志，2023，24(1)：45．47．[13]蒋良福，劳杰，何继银，等．几丁糖胶原复合膜及激活态雪旺细胞修复周围神经缺损的实验研究[J】．中华手外科杂志，2023，21(3)：172-174．[14】HaynesLW，RushtonJA，Pert'insMF，eta1．DiploidandhyperdiploidratSchwanncellstrainsdisplayingnegativeauthoregulationofgrowthinvitroandmyelinsheathformationinvivo[J]．JournalofNeuroscienceMethods，1994，52(2)：119-127．[15】HaastertK，SeefP，SteinVM，eta1．AnewcellcultureprotocolforenrichmentandgeneticmodificationofadultcanineSchwanncellssuitableforperipheralnervetissueengineering．[J】．ResVetSci，2023，87(1)：140-142．[16】MauritzC，G-rotheC，HaastertK．ComparativestudyofcellcultureandpurificationmethodstoobtainhighlyenrichedculturesofproliferatingadultratSchwanncells[J]．Journalofneuroscienceresearch，2023，77(3)：453-461．[17】LiRH，SliwkowskiMX，LoJ，eta1．EstablishmentofSchwanncelllinesfromnormaladultandembryonicratdorsalrootganglia[J]．Journalofneurosciencemethods，1996，67(1)：57-69．[18]PorterS，GlaserL，BungeRP．ReleaseofautocrinegrowthfactorbyprimaryandimmortalizedSchwanncells．【J】．ProcNatlAcadSciUSA，1987，84(21)：7768—7772．[19]LangfordLA，PorterS，BungeRP．ImmortalizedratSchwanncellsproducetUlTIOUrSinvivo．阴．JNeurocytol，1988，17(4)：521-529．第一局部第一局部培养成年大鼠雪旺细胞的关键技术的比拟研究雪旺细胞(Schwanncell，SC)是周围神经中唯一的胶质细胞，在周围神经发育、再生中有着非常重要的作用n1。周围神经新鲜断裂后，神经远断端发生华勒氏变性，轴突、髓鞘崩解，SC吞噬轴突和髓鞘的碎片后增殖，排列成Bungner带，引导再生的轴突长入，并重新包绕再生轴突形成髓鞘，此过程为周围神经的再生过程。如周围神经损伤严重或延迟吻合修复那么容易导致神经缺损(两断端问距离>神经直径的4倍)，周围神经两断端不能直接缝合修复。目前在临床上，自体神经移植仍然是修复周围神经缺损的金标准。然而，由于自体神经移植存在来源有限、供体损伤等缺点，使许多学者尝试了多种替代物来修复周围神经缺损，如应用不可吸收材料制备的硅胶管、聚四氟乙烯管等作替代物，及应用生物衍生材料，如静脉、骨骼肌、羊膜、异体神经、动脉、筋膜等作替代物Ⅲ。前者由于不能被人体吸收，需二次手术取出而不适合临床应用；后者或管壁易塌陷、或引起纤维瘢痕增生及粘连，亦或存在强抗原性，大大限制了其临床应用的可能n3。随着近些年来材料学、组织工程学等学科的开展，可吸收材料制成的组织工程神经导管作为自体神经移植的替代物已成为一个开展趋势。由可吸收材料制成的神经导管已在局部兴旺国家用于临床，来修复最细神经的短距离的缺损(指固有神经，<3cm)，并获得了接近自体神经移植的效果Ⅱq1。然而，由于导管内缺乏有活性的SC，极大地限制了长距离神经缺损的修复。临床上为防止免疫排斥反响，往往需要移植自体SC。因此，成年自体SC的体外培养、扩增成为周围神经组织工程的一个不可缺少的组成局部。虽然目前实验室培养SC的方法有很多种，其中涉及的关键步骤的技术，如取材时切取背根神经节踟或周围神经啼1等；别离细胞时用快速嘀3或慢速酶消化法口1、植块法陋1等；扩增时用预变性，添加有丝分裂剂n1或周围神经正常的营养物质阻1等；去除混杂细胞时用差速贴壁、有丝分裂抑制剂畸3、免疫磁珠分选n0。、胶原酶纯化法n¨或显微外科技术n21等；传代时用冷喷射传代口’12—31或酶消化传代H3等。虽然方法和关键技术都各不相同，但据报道最终都能获得高数量、高纯度的SC。临床应用和实验室研究相比，有更多的限制。临床上要求满足以下特点：最大限度的减少病人痛苦，减少手术次数，取材最少的自体神经，在最短的时间内扩增出足够数量和纯度的SC，并且具有较高的生物学活性，减少可能存在风险的添加物，使培养方法简单、容易重复、费用小。显然，临床上不能切取背根神经节，只能切取周围神经培养扩增SC。而各12种有丝分裂剂，如神经调节蛋白家族n种有丝分裂剂，如神经调节蛋白家族n4|(heregulin、神经胶质生长因子)、腺苷酸环化酶冲动剂n4’151(forskolin、霍乱毒素n刚等)、蛋白激酶C激活剂(佛波酯)、神经营养因子(碱性成纤维细胞生长因子n刀等)、髓磷脂碱性蛋白和髓磷脂碱性蛋白肽链n83广泛应用于SC的迅速扩增和培养。然而，除了少局部物质，如碱性成纤维细胞生长因子、髓磷脂碱性蛋白等是周围神经微环境的正常物质外，forskolin、霍乱毒素、heregulin、佛波酯等都不是周围神经微环境中的正常物质。并且有很多报道在长时间应用有丝分裂剂，如联合应用forskolin和神经胶质生长因子n4l，或长期应用霍乱毒素n印会引起SC永生，将这样的SC移植入体内会引起肿瘤形成。而佛波酯本身就是促瘤剂。同样道理，有丝分裂抑制剂，如阿糖胞苷阳1、基因素等也不能应用于培养临床上需要的SC，这些物质会影响SC的信号转导通路，并会引起SC的遗传物质发生改变∞一191。因此，有丝分裂剂／有丝分裂抑制剂都尽可能防止用于培养临床上需要的SC。免疫磁珠纯化SC虽然效果很好，但是费用昂贵，应用于临床上会大大增加本钱，进而增加患者的费用，也限制了广泛应用于临床的可能。扩增临床应用型SC的几个关键步骤如下：第一，提高取材的神经中的SC数目。周围神经体内预变性，可以明显增加神经中SC的数量啪1，是周围神经SC培养的一个平安、有效的方法，已作为培养成年自体SC的一个常规手段。然而，从体内周围神经预变性到切取神经培养、扩增SC，再Nsc自体移植需要3次手术，而有报道体外培养基中神经预变性也能促进SC数目的增加，可以减少一次手术，但体外预变性能否到达体内预变性的效果?是否和其他的关键技术匹配?第二，从周围神经中别离SC后扩增。快速酶消化和慢速酶消化在前人的文献报道中都能将神经中的SC有效别离出来，然而哪个方法获得的细胞数量更多，活力更高，纯度更高?第三，纯化、传代时降低SC的损失。常规的酶消化传代和冷喷射传代哪个效果更好，操作更简单、更容易重复?本研究中我们将比照这几个可能应用于临床上自体SC移植中的关键技术，为临床应用提供实验室根底。1．材料、试剂和仪器1．1消化酶：胶原酶(Ⅳ型，sigma—Aldrich公司)胰蛋白酶一0．01％EDTA(sigma公司)中性蛋白酶(Roch公司)1．2培养基及添加剂等：高糖DMEM培养基(Gibco公司)；黑素细胞培养基(Medium254及添加物，CascadeBiologics公司)胎牛血清(Fetal胎牛血清(Fetalbovineserum，FBS，Gibco公司)青霉素100U／ml(Hyclone公司)链霉素100U／ml(Hyclone公司)D-Hanks液(Gibeo公司)层粘蛋白(Chemicon公司)1．3抗体及染料等：兔抗大鼠S—100多克隆抗体(Abeam公司)兔抗大鼠GFAP多克隆抗体(Abcam公司)小鼠抗大鼠GFAP多克隆抗体(Abeam公司)小鼠抗大鼠P75一单克隆抗体(Abeam公司)抗体稀释液(Abeam公司)FITC一羊抗兔多克隆抗体(Jackson公司)罗达明一羊抗小鼠多克隆抗体(Jackson公司)4，6-diamidino一2一phenylindole(DAPI，0．2ug／ml，Sigma—Aldrich么≥司)1．4其他试剂，如牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，Sigma公司)，预防切口感染的青霉素粉剂为国产，冲洗用的磷酸盐缓冲液等为国产分析纯。1．4细胞培养皿(30mm、60ram)、培养板(6孔、12孔、24孔、965L)、培养瓶(25cm2、75cm2) (Corning公司)1．5仪器：超净台(上海上净净化设备有限公司)细胞培养箱(Heraeus)IMT-2倒置显微镜(OLYPUS)荧光倒置显微镜(Zeiss)及AxioVisionRel．4．6软件(USA)手术显微镜(上海医用光学仪器厂)手术缝线(爱惜康公司)显微器械(宁波市成和显微器械厂)离心机(上海医用分析仪器厂)恒温水浴锅(上海精宏实验仪器设备有限公司)2．动物与分组2．1实验动物：SPF级Sprague—Dawley雄性大鼠，体重2209--2509(复旦大学上海医学院实验动物部提供)。2．2实验分组：分A、B、C、D四组，每组10只大鼠。A组采用体内预变性法十快速酶消化法；B组采用体内预变性法+慢速酶消化法；C组采用体外预变性法+快速酶14消化法：D组采用体外预变性法+慢速酶消化法。消化法：D组采用体外预变性法+慢速酶消化法。3．实验方法3．1动物及神经处理3．1．1体内预变性及组织处理瞳：将大鼠以1％戊巴比妥钠按照35—50mg／kg腹腔注射，全麻完成后，通过背部的切口暴露双侧的坐骨神经，用显微剪刀在背根神经节以远剪断坐骨神经。切口缝合前用青霉素喷洒抗感染(图1)。1周体内预变性后，大鼠过量麻醉处死，75o／／0酒精浸泡3分钟后在超净台中取材，切取双俱lJ2cm长坐骨神经。可见神经水肿明显，在显微镜下剥掉外膜(图2A)，称重20--30mg，将神经内膜管从神经束膜管中抽出(图2B、C、D)，弃掉神经束膜管(图2E)。然后将所有的内膜管都用显微剪刀剪成最小的片段备用(图2F)。3．1．2体外预变性及组织处理：将大鼠以1％戊巴比妥钠2—3ml过量麻醉处死后，75％酒精浸泡3分钟，无菌条件下迅速切取双侧坐骨神经(均为2．Ocm)。将神经置D-Hanks液冲洗两遍，在放大10倍的显微镜下剥除神经外膜，称重20--30mg。将无外膜的神经放入培养皿，参加含10％胎牛血清、1％青霉素、1％链霉素的DMEM培养基5ml在37"C、5％C02培养箱中预变性1周。1周后在显微镜下，将神经束膜剥除，将神经内膜剪成最小的片段备用。3．2酶消化和SC原代培养3．2．1快速酶消化：将处理好的组织参加终浓度为0．125％胰酶、0．05％胶原酶2ml混合物在37"C恒温水浴锅消化30分钟后，参加含10％胎牛血清的DMEM3ml终止消化，1000转离,b5分钟，弃上清后，再参加0．05％胶原酶2ml，用吸管轻轻吹打使组织尽可能分散，再次消化30分钟，lOmlD—Hanks液稀释中和后，1000转离心5分钟，弃上清。重复D-Hanks液洗细胞一次，去除残留的胶原酶。参加黑素细胞培养基(及对应的添加物)，调整细胞数目为5×105／ml，接种到培养皿、瓶(按每5cm2参加lml培养基接种)，放入37。C、5％C02培养箱中培养。3．2．2缓慢酶消化法：消化酶由添加了终浓度为0．125％胶原酶、1．25U／ml中性蛋白酶、IO％FBS的DMEM混合物构成。按照每条神经)Jl：12ml混合物，在5％C0。、37。C培养箱中消化24dx时。第二天，用吸管轻轻吹打组织，直到无明显肉眼可见的组织残渣。1000转离,b5分钟后，参加DMEM5ml，重新混匀后再次1000转离心5分钟。参加黑素细胞培养基(及对应的添加物)，调整细胞数目为5×105／ml，接种到培养皿、瓶(按每5cm2参加lml培养基接种)，放入37。C、5％C02培养箱中培养。3．3培养瓶、皿底预处理将层粘蛋白溶于DMEM培养基中，终浓度为51-tg／ml，按照每0．1ml／cm2参加培养皿、瓶中，在37。C培养箱孵育1小时或4"C冰箱内24小时。细胞接种前将层粘蛋白溶液吸出，用黑素细胞培养基冲洗皿(瓶)底1次。3．4细胞传代方法3．4．1冷喷射传代法乜¨：简言之，根据细胞受到冷刺激后，细胞会收缩，从皿(或3．4细胞传代方法3．4．1冷喷射传代法乜¨：简言之，根据细胞受到冷刺激后，细胞会收缩，从皿(或瓶)底脱落的原理。具体方法：在细胞生长约80％llIt底面积时传代，先吸出培养基，缓慢参加lml的4"C0．01mol／LPBS后，立即吸出。然后参加iml的4℃黑素细胞培养基，轻轻地反复吹打皿底数次，特别在细胞密度较大处多吹打几次。在相差显微镜下观察，绝大局部的细胞浮起后，将上清(悬浮的细胞)吸出离心，调整细胞数目为5×106／ml，接种到培养皿、瓶(按每5cm2参加lml培养基接种)。3．4．2胰酶消化传代法：简言之，根据胰酶催化蛋白分解的原理使贴壁细胞的粘附分子水解后细胞脱落。具体方法：用D-Hanks液将0．25％胰酶稀释成0．05％胰酶，在细胞生长约80％11II．底面积时传代，先吸出培养基，然后参加0．05％胰酶lml，放入37"C培养箱中1-2分钟，然后在显微镜下观察，待细胞突起回缩、变圆时参加含10％胎牛血清的黑素细胞培养基中和(血清中的钙离子、镁离子可以使胰酶失活)。将脱落的细胞在1000转离心5分钟，参加黑素细胞培养基3-5ml洗2次，洗掉残留的胰酶后，调整细胞数目为5×105／m1，接种到培养皿、瓶(按每5cm2参加lml培养基接种)。3．5SC免疫学鉴定SC鉴定采取间接免疫荧光染色法。程序如下：(1)在细胞生长良好的3cm培养皿中，吸出培养基，用0．01M磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersolution，PBS)浸泡冲洗3次后，参加含4％多聚甲醛的PBS，固定20—30分钟。(2)吸出多聚甲醛后，用PBS冲洗3次，参加含0．03％TritonX-100的PBS透化处理15分钟。(3)吸出Triton后，参加含IO％BSA的PBS在室温下封闭1小时。(4)参加l：100的一抗(GFAP、$100或p75惭8，可同时参加两个不同来源的一抗双染)，4"C冰箱过夜或37。C孵育l小时。(5)用含0．01％Tween的PBS清洗培养皿底3次，每次5分钟。参加二抗(FITC或罗达明标记)，室温下孵育1小时。(6)参加O．2ug／mlDAPIO．5ml，孵育5分钟。(7)用含0．3％Tween的PBS清洗培养皿底3次，每次5分钟。最后洗完后，用绸布擦净培养皿下方，皿内保存约lmlPBS。(8)将皿固定在倒置荧光显微镜下观察并拍摄同一视野的光镜照片、对应的荧光照片，图像用AxioViSionRel．4．6(USA)软件处理。3．6SC数量、贴壁率将每组神经消化下来的细胞用细胞计数板计数后，计算并记录消化下来的活细胞总数(台盼兰活细胞染色法)。在相同接种密度下，细胞接种24小时后大部分细胞贴壁，换液时去除未贴壁的细胞，在相差显微镜下六个不同的视野拍照，用PhotoshopCS3软件计数细胞。计算贴壁的细胞总数(贴壁细胞总数=单个视野细胞数×总贴壁面积／单个视野面积×100％)。计算贴壁率(贴壁率=贴壁细胞总16数／接种细胞总数x数／接种细胞总数x100％)。3．7SC纯度检测将每组第一代的细胞各取3个3cm培养皿的细胞，将每组用不同方法传代获得的第二代细胞各选3个3cm培养皿的细胞，做S100免疫荧光染色，DAPI复染细胞核。每个皿在200倍视野下随机选取6个不重复视野，拍照，用PhotoshopCS3软件计数细胞。胞浆为绿色、胞核为蓝色的细胞为SC，胞浆无色、胞核为蓝色的细胞为污染的细胞，多为成纤维细胞。SC纯度=SC数目／细胞总数×100％。3．8统计学处理将所得数据用GraphPadPrism5．O统计软件进行统计学处理，数据以平均值±标准误的形式(means±SEM)表示，均数间的比拟采用双向方差分析。4．结果4．1SC形态学观察和免疫学鉴定按照文献报道，SC在相差显微镜下表现为有亮晕的，纺锤形的细胞，一般为双极，也可表现为三极，胞浆少；而成纤维细胞表现为扁平状的外形，没有亮晕，胞浆丰富(图3A)。SC免疫学标志物为S100(图3)、GFAP、P75懈8(图4)等，这些标志物在周围神经系统的其他细胞(如：成纤维细胞)中不表达。4．2体内、体外预变性结果比照2条2cm长坐骨神经用慢速酶消化法获得的细胞数分别为(8．O±1．3)×106个(体内预变性)，(8．5±1．1)×106(体外预变性)，无明显统计学差异(P>O．05)。二者获得的细胞活性也接近，24小时贴壁率分别为(20．5±2．4)％(体内预变性)和(18．9±1．2)％(体外预变性)，差异没有统计学意义(P>O．05)。培养1周时细胞总数也接近，差异没有统计学意义(P>0．05)(见表1)。4．3快速酶消化法和慢速酶消化法效果比照快速酶消化法所获得的往往是散碎的组织与脱落的细胞的混合体，无法准确计数，而未被消化掉的组织块在接种后仍然有许多细胞可以从组织块中爬出贴壁；缓慢酶消化法消化得比拟完全，绝大局部细胞被消化下来，极少有大块组织残留。快速酶消化和慢速酶消化在培养1周后获得的细胞总数和纯度也没有明显的统计学差异(P>0．05)。h、B、C、D四组获得的细胞数目和纯度结果见表l。4．4冷喷射传代法和胰酶消化传代法结果比照冷喷射传代法传代可以不同程度提高纯度，SC对寒冷刺激比成纤维细胞敏感，先脱落，因此最初可获得少量纯度接近100％的SC。可在相差显微镜下反复操作，但要获得高纯度(99％以上)的SC(图5—1，2)，会损失一局部SC，因为冷喷射操作数次后，成纤维细胞也开始逐渐脱落。每个培养瓶／皿中总是有少数贴壁很牢的SC和贴壁不牢的成纤维细胞存在(图6，冷喷射全过程)。17胰酶消化法传代时，SC和成纤维细胞几乎同时将突起收缩，脱落。因此获得胰酶消化法传代时，SC和成纤维细胞几乎同时将突起收缩，脱落。因此获得的细胞纯度和细胞数目几乎不变(表2、图7)。5．讨论SC是周围神经组织工程中的重要成分之一。没有填充细胞的神经导管不能修复长距离的神经缺损，其原因是导管内缺乏促进神经再生的SC，这一点已经在周围神经组织工程研究中达成共识n’22’23I。实验研究中，填充了Sc的神经导管比不填充细胞的导管修复周围离神经缺损的效果好瞳争24‘。尽管实验室研究中，成年哺乳动物的SC培养方法很多，涉及了许多的关键技术。但是如何在临床上有效应用，还需要做效能的比照。临床应用要求最大限度减少患者的痛苦，争取缩短康复的时间，最大限度恢复患者功能，费用降至最低，平安性最高。体内预变性尽管平安有效，但是患者从细胞培养到神经导管移植需要接受3次手术(第一次：周围神经体内预变性，第二次：切取周围神经体外培养、扩增SC，第三次：SC填充导管后植入自体)。而体外预变性从细胞培养到神经导管移植只需要接受2次手术，即免去周围神经体内预变性这一步，减少了患者的痛苦，更适合临床应用。我们的实验结果提示体外预变性和体内预变性取得相似的效果。虽然在体外预变性培养1周时的纯度在数值上略低于体内预变性，可能是由于体内预变性后神经外膜、束膜水肿明显，外膜很容易剥脱，神经内膜管也可以完整地从神经束膜管中抽出，最后获得的全部神经内膜管片段极少混入神经束膜；而体外预变性的神经在预变性前可将神经外膜完整剥脱，但在培养基中预变性1周后神经内膜管也明显水肿，相比之下别离不易，最后获得的神经内膜管中往往混入一定的神经束膜碎片，降低了原代培养的SC纯度。但是两种预变性获得的细胞纯度都到达了90％以上，统计学上没有明显的差异，说明体外预变性和体内预变性同样有效。前者较后者减少一次手术，更适合应用于临床。快速酶消化法消化时问短，理论上争取了时间，减少了酶对细胞的损伤；缓慢酶消化法理论上细胞消化完全，消化后直接贴壁，有利于细胞扩增。我们在实际操作中发现，快速酶消化所获得的往往是散碎的组织与脱落的细胞的混合体，无法准确计数，而未消化掉的组织块在接种后仍然有许多细胞不断地从组织块中爬出贴壁。慢速酶消化法消化得比拟完全，绝大局部细胞被消化下来，但是贴壁率不高。可能是细胞在酶的长时间作用下生物活性降低，导致细胞贴壁能力降低。结果两种消化法在培养1周时获得的贴壁细胞总数相似，没有明显的统计学意义。因此两种方法均可以考虑在细胞培养中应用。冷喷射传代法传代可以不同程度提高纯度，SC对寒冷刺激比成纤维细胞敏感，先脱落。这一点可以在培养SC纯度低时应用，即使污染了较多的成纤维细胞，18也可以用此方法以牺牲一局部也可以用此方法以牺牲一局部SC为代价，获取较高纯度的SC。但该操作需要有一定的经验，冷喷射操作不当，如直接快速将培养基喷射到细胞上，会导致大片细胞直接被冲下来，既影响细胞活性，又影响细胞纯度。胰酶消化法传代时，sc和成纤维细胞几乎同时将突起收缩，脱落。操作简单、可重复性高。二者可以配合使用。SC培养中另一个很关键的问题就是消除成纤维细胞的污染。由于绝大多数成纤维细胞位于神经外膜和神经束膜，而神经内膜上成纤维细胞数目缺乏3％乜5J。本研究中，由掌握了娴熟的显微外科技术的外科医生，在培养细胞前将神经外膜、束膜完全剥除，从源头上明显削减了可能污染的成纤维细胞数目，使原代培养的SC即可以平均纯度到达90％以上。而既往很多实验室研究人员由于不具备娴熟的显微外科技术，仅能剥除神经外膜n3，171，导致培养的SC纯度明显降低，而在后期应用有丝分裂抑制剂5一氟尿嘧啶、阿糖胞苷抑制成纤维细胞增殖，或用差速贴壁、免疫磁珠等方法进行SC的纯化，然而这些方法或存在影响生物活性风险(5一氟尿嘧啶、阿糖胞苷对细胞生物学活性影响大，可引起SC的DNA损伤∞’9’191)，或价格昂贵(免疫磁珠)，或损失大量的SC(差速贴壁)，均不适合在临床上广泛应用。本研究比照了体外培养SC的多种技术，检测了各自的效果，为组织工程培养应用于临床的SC奠定了实验根底。6．结论(1)体外预变性减轻患者痛苦，更适合临床应用；(2)快速、慢速酶消化法效果无明显差异，均可考虑应用；(3)冷喷射传代法可以和胰酶消化传代法有机结合使用，前者在SC纯度较低时应用，后者在SC纯度较高时应用。参考文献[1】李岩峰，劳杰．组织工程神经导管研究进展[J】．中华创伤杂志，2023，25(4)：381—384．【2]InadaY，MorimotoS，TakakuraY，eta1．Regenerationofperipheralnervegaps诵Ⅱlapolyglycolicacid—collagentube．[J】．Neurosurgery，2023，55(3)：640-646，646．648．[3】WangH，LineaweaverWC．Nerveconduitsfornervereconstruction[J]．OperativeTechniquesinPlasticandReconstructiveSurgery，2023，9(2)：59-66．[4]LiRH，SliwkowskiMX，LoJ，eta1．EstablishmentofSchwanncelllinesfromnormaladultandembryonicratdorsalrootganglia[J]．Journalofneurosciencemethods，1996，67(1)：57—69．[5】WeiY，ZhouJ，ZhengZ，eta1．AnimprovedmethodforisolatingSchwanncellsfromfrompostnatalratsciaticnerves．[J】．CellTissueRes，2023，337(3)：361-369．【6]Calder6n-MartinezD，GaravitoZ，SpinelC，eta1．Schwanncell-enrichedculturesfromadulthumanperipheralnerve：atechniquecombiningshortenzymaticdissociationandtreatment谢thcytosinearabinoside(Ara-C)[J]．2023，l14(1)：1-8．[7]HaastertK，MauritzC，ChaturvediS，eta1．HumanandratadultSchwanncellcultures：fastandefficientenrichmentandhighlyeffectivenon-viraltransfectionprotoc01．[J]．NatProtoc，2023，2(1)：99-104．[8】OdaY，OkadaY，KatsudaS，eta1．AsimplemethodfortheSchwanncellpreparationfromnewbomratsciaticnerves[J]．1989，28(3)：163—169．[9】PannunzioME，JouI，LongA，eta1．AnewmethodofselectingSchwanncellsfromadultmousesciaticnerve[J]．2023，149(1)：74—81．[10】ManentJ，OguievetskaiaK，BayerJ，eta1．MagneticcellsortingforenrichingSchwanncellsfromadultmousepefipheralnerves[J]．2023，123(2)：167-173．[11】JinY，LiuW，HongT，eta1．EfficientSchwanncellpurificationbydifferentialcelldetachmentusingmultiplexcollagenasetreatment[J]．JournalofNeuroscienceMethods，2023，170(1)：140—148．【12】章少华，劳杰，李岩峰，等．应用黑素细胞培养基在成年SD大鼠雪旺细胞培养中的实验研究[J]．中华手外科杂志，2023，25(2)：110．112．【13】HaastertK，MauritzC，MatthiesC，eta1．AutologousadulthumanSchwanncellsgeneticallymodifiedtoprovidealternative 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