基因工程的酶学基础

基因工程的酶学基础第1页/共83页

核酸酶(nucleases):是指通过切割相邻两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，使核酸分子发生水解断裂的酶。

按底物不同分为：

DNA酶（DNase）

RNA酶（RNase）底物非专一性核酸酶第2页/共83页

按作用部位不同分为：

5´末端外切酶

核酸外切酶

3´末端外切酶

核酸内切酶

第3页/共83页一、限制－修饰系统第一节限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。

第4页/共83页.切点：磷酸二酯键第5页/共83页2.性质内切酶主要来源于原核生物即在核酸分子链的内部制造切口的酶。形成5’-P和3’-OH末端自我保护作用3.功能1.来源第6页/共83页早在上世纪60年代Linn和Arber在研究噬菌体的寄主范围时发现如下的现象：分别在E.coli的K菌株和B菌株上生长的λ噬菌体（称λK和λ

B）能高效感染各自的宿主;但用λK感染B菌株或用λ

B去感染K菌株则感染率会大大降低，这就是限制。如果一旦λK感染B菌株成功则在B菌株中形成的后代也就能高效感染B菌株，再也没有限制现象，这个现象称为修饰。限制和修饰是由宿主控制的，故称为宿主控制的限制和修饰作用。限制-修饰系统（restriction-modificationsystem）

第7页/共83页研究发现，细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断，而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护，一起构成限制-修饰系统。十年后，搞清了细菌的限制与修饰分子机理：由三个基因位点所控制：hsdR,hsdM,hsdS

hsdR---限制性内切酶

hsdM---限制性甲基化酶

hsdS---控制两个系统的表达

1限制性核酸内切酶第8页/共83页限制（Restriction）限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。1限制性核酸内切酶第9页/共83页例：M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）的甲基转移到EcoRI识别顺序中的第三位腺嘌呤上，从而使DNA免受EcoRI的切割修饰：细菌自身的DNA碱基被甲基化酶修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。第10页/共83页现已从各种微生物中发现与鉴定出3800余种限制-修饰系统，其中有限制性内切核酸酶3819个、甲基转移酶844个。现已商品化的限制酶624个，甲基转移酶32个。二、限制性内切核酸酶的类型第11页/共83页Ⅰ型限制性内切酶（90个）

目前鉴定出四种不同类型的限制性内切酶。Ⅱ型限制性内切酶（3714个）

Ⅲ型限制性内切酶（12个）

Ⅳ型限制性内切酶（3个）

第12页/共83页1.I型限制性内切酶1968年首先由M.Meselson和R.Yuan在从大肠杆菌B株和K株分离的如EcoB和EcoK

（1）识别位点序列未甲基化修饰的特异序列

EcoB：TGA(N)8TGCT

EcoK：AAC(N)6GTGC1限制性核酸内切酶第13页/共83页（2）切割位点在距离特异性识别位点约1000—1500bp处随机切开一条单链（3）作用条件需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）1限制性核酸内切酶第14页/共83页首先由美约翰·霍布金斯大学的H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来分离的第一个酶是HindⅡ（识GTCGAC）

（1）识别位点序列未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）,与DNA的来源无关2.II类限制性内切酶1限制性核酸内切酶第15页/共83页（2）切割位点识别位点处切开双链DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）如：

EcoRI5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’

PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’

产生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’产生平齐末端1限制性核酸内切酶第16页/共83页（3）粘性末端（stickyends，cohensiveends）

含有几个核苷酸单链的末端分两种类型：

①5’端凸出（如EcoRI切点）1限制性核酸内切酶

②3’端凸出（如PstI切点）第17页/共83页3.III类限制性内切酶

在完全肯定的位点切割DNA（一般在识别位点24-26bp），但反应需要ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸）。EcoP1:AGACC——EcoP15:CAGCAG——在基因工程操作中用途不大1限制性核酸内切酶第18页/共83页核酸限制性内切酶的类型及主要特性I类内切酶II类内切酶III类内切酶限制和修饰活性双功能的酶内切酶和甲基化酶分开双功能酶内切酶的蛋白结构3种不同的亚基单一亚基2种不同的亚基限制作用所需要的辅助因子ATP、Mg2+和SAMMg2+ATP、Mg2+和SAM寄主特异性位点识别序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC回文序列（IIs型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG第19页/共83页I类内切酶II类内切酶III类内切酶切割位点离识别位点很远识别位点上识别位点下游24-26bp特异切割非特异特异特异基因工程中的应用无用广泛使用用处不大核酸限制性内切酶的类型及主要特性(表续)第20页/共83页1973年H.OSmith和D.Nathans提议的命名系统，命名原则如下：三、限制性内切核酸酶的命名用属名的第一个字母和种名的头两个字母，构成酶的基本名称。大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示第21页/共83页2.

如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。如HindⅡ：d菌株

EcoRI：抗药性R质粒

第22页/共83页3.

如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的先后次序。如HindⅡ：d菌株中发现的第二个酶4.

所有的限制酶，除以上名称外还要冠以系统名称。限制性内切酶的系统命名为R，甲基化酶为M。如R.HindⅢ表示限制性内切酶

M.HindⅢ表示相应的甲基化酶实际应用中，R常被省略。第23页/共83页首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。（一）识别序列的特异性未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（4-6bp，多数是呈典型的旋转对称型的回文结构）。与DNA的来源无关，即没有种的特异性。四.Ⅱ型限制性内切酶的基本特性分离的第一个酶是HindⅡ第24页/共83页稀有切割限制性内切核酸酶（rarecutter）可以识别6个以上的核苷酸序列的少数的限制内切酶。如Not

I

（GCGGCCGC）某些限制性内切酶的识别序列中，某一个或两个碱基并非严格专一。如HindⅡ可识别4种核苷酸序列：

Y:C或TR:A或GGTYRAC-3’5’-第25页/共83页Ⅱ型限制性内切酶不具有甲基化功能Ⅱ型酶的甲基化修饰活性由相应的甲基化酶承担。它们识别相同的DNA序列，但功能不同。如EcoRI限制性内切酶和EcoRI甲基化酶前者：5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’后者：5’-GAA*TTC-3’

3’-CTT*AAG-5作用的位点也不相同第26页/共83页（二）切割位点的特异性切开双链DNA，形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）。1.DNA分子酶切片段的末端第27页/共83页含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型：GAATTC

CTTAA

GG

AATTCCTTAAG5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’[1]粘性末端（stickyends，cohensiveends）ⅰ）5’端凸出（如EcoRI切点）第28页/共83页CTGCAG

GACGTC5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’CTGCAG

G

ACGTCⅱ）3’端凸出（如PstI切点）第29页/共83页i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。这比连接两个平齐末端容易得多。[2]粘性末端的意义①连接便利第30页/共83页第31页/共83页末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。②末端标记③补平成平齐末端第32页/共83页[3]平齐末端（bluntend）在识别序列的对称轴上同时切割5’-GATATC-3’3’--5’CTATAG如EcoRV第33页/共83页[4]平齐末端的特点连接困难，连接效率低，只有粘性末端连接效率的1%，这种连接常出现多联体连接。粘性末端与平齐末端连接的处理方法ⅰ）添补法：利用DNA聚合酶Ⅰ(klenowfragment）将碱基添补到目的基因的粘性末端上。第34页/共83页ⅱ）削除(平)法利用S1和Bal31等核酸酶将目的基因粘性末端的单链突出部分削去，使其成为平齐末端第35页/共83页不同来源的酶，识别相同的序列，切割方式相同或不同。识别位点和切点完全相同如HindⅢ

和HsuIHindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’2.同切点酶（Isoschizomer)①原型酶的同切点酶（同裂酶）：第36页/共83页XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’识别位点相同，但切点不同。如XmaI和SmaI。②新裂酶：第37页/共83页识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、Bgl

Ⅱ、BclI、XhoⅡ等5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’

5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’Xho

ⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。3.同尾酶(Isocaudamers）第38页/共83页5’-GATC----3’3’----CTAG-5’

Sau3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。5’-G3’-CCTAGGATCT-3’

A-5’BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBglⅡSau3A第39页/共83页不存在其他内切或外切核酸酶的污染。长时间酶解时不出现识别序列特异性的下降。酶解的DNA片段连接后能重新被识别和切割。1.酶的纯度五、影响限制性内切酶活性的因素第40页/共83页DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。2.DNA样品的纯度①加大酶的用量，1ugDNA用10U酶②扩大反应体积（>20l）③延长保温时间④添加阳离子亚精胺一般采取第41页/共83页DNA的浓度不宜过高，高浓度的DNA会使溶液的粘度增加从而抑制酶分子的扩散导致酶切反应不彻底。常为50ul内含1ugDNA。第42页/共83页大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：3.DNA的甲基化程度DNA腺嘌呤甲基化酶（DNAadeninemethylas,dam)（修饰GATC中的A）；DNA胞嘧啶甲基化酶（DNAcytosineethylas,dcm)（修饰CCA/TGG的C）。基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。第43页/共83页不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37oC，少数要求40-65oC。酶最适温度oC酶最适温度oC酶最适温度oCApaIBclIMaeIITaqI30505065ApyIBstEIIMaeIII306055BanIMaeISmaI5045254.酶切反应的温度第44页/共83页5.DNA分子的构型1.构型对超螺旋的质粒或病毒DNA酶切时，所需酶量大于线性状态。2.位点偏爱性EcoRⅠ酶切割噬菌体中的5个位点时，近左端的位点比分子中间的位点切割快10倍。3.对只含识别序列不具催化活性必须在两侧各延长一个或几个核苷酸。第45页/共83页是影响限制酶活性的重要因素6.缓冲液(Buffer)缓冲液的化学组成MgCl2、NaCl/CH3COOK

：提供Mg2+和离子强度Tris-HCl：维持pH,大多数为7-7.6二硫苏糖醇（DTT）：防止酶氧化,保持酶稳定性牛血清白蛋白（BSA）等：中性蛋白质,防止酶在低浓度的蛋白质溶液中变性商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液第46页/共83页限制性内切酶一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。[7]酶的星号活性星号（*）活性第47页/共83页EcoRI和BamHI等都有*活性。在低盐、高pH（>8）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：使用的时候要特别注意！第48页/共83页诱发星号（*）活性的原因酶量不宜过多，尽量遵循生产商推荐的反应条件高浓度甘油AvaI、AvaⅡ、PstI、XbaI碱性PH值AviⅡ、MstI低离子强度ApeI低盐浓度

Bst707I低PH值PshBIMn离子存在HindⅢ、SfiIβ-巯基乙醇+低离子强度AvaⅢ高浓度甘油+Mn离子存在+低离子强度BamHIEcoRI第49页/共83页六.限制性内切酶对DNA的消化内切酶与识别序列的结合模式

1986年J.A.McClarin等通过X射线晶体衍射发现II类限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合1限制性核酸内切酶第50页/共83页（一）DNA分子的双酶切消化①在相同的缓冲液中反应同时进行②若需要不同的缓冲液,采用3种方法ⅰ)先用要求低离子强度的酶切割（低盐酶）,再加NaCl调节离子强度,并用第二种酶切割（高盐酶）；ⅱ)先用最适反应温度较低的酶，升温后再加入第二种酶；ⅲ)反应体系相差大的，第一种酶切反应后回收，再切割。第51页/共83页内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开12341234（二）完全酶切消化第52页/共83页只有有限数量的酶切位点被切开通过缩短保温时间、降低反应温度、增大反应体积或减少酶量可达到局部消化的目的。123414（三）部分酶切消化第53页/共83页酶解过程

配酶解体系混匀反应终止酶解结果鉴定第54页/共83页①酶解体系一般20μl，保证酶液体积不超过反应总体积的10%前提下，尽量降低反应总体积。加样顺序一般是：ddH2ObufferDNA酶第55页/共83页大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低盐酶100mM中盐酶150mM高盐酶Volume20-100µlTT37℃1-1.5hr第56页/共83页②混匀移液枪吹打或手指轻弹管壁若底物分子很大（如基因组DNA），应避免强烈振荡。混匀后微量高速离心机进行短暂离心，使管壁液体全部下沉。第57页/共83页③反应终止三种方法：ⅰ）加乙二胺四乙酸（EDTA）至终浓度

10mmol/L;加十二烷基硫酸钠（SDS）至终浓度0.1%(W/V)ⅱ）65℃加热20min或者70℃加热10minⅲ）酚/氯仿抽提第58页/共83页④酶解结果鉴定琼脂糖凝胶电泳第59页/共83页1234Mbp200010007505002501001：pBS-T空载体（EcoRⅠ+HindⅢ）；2,3：重组质粒（EcoRⅠ+HindⅢ）；4：目的基因；M：DNAMakerDL2000第60页/共83页几种常用限制酶识别位点第61页/共83页从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。第二节DNA连接酶一、DNA连接酶（ligase)的发现DNA复制一定有断口第62页/共83页DNA连接酶:一种能够催化双链DNA片段靠在一起的3′羟基末端与5′磷酸集团末端，通过磷酸二酯键连接在一起的核酸酶。1967年，世界上数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶。

第63页/共83页第64页/共83页根据连接反应所需的能量辅助因子：一类是依赖ATP的DNA连接酶；另一类是依赖NAD的DNA连接酶。根据来源：

T4噬菌体DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶热稳定DNA连接酶第65页/共83页二、DNA连接酶的特点1.T4DNA连接酶T4DNA连接酶，可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合。同时T4

DNA连接酶可以修补双链DNA、双链RNA或DNA/RNA杂合物上的单链缺刻。

为T4噬菌体基因30编码的一条多肽链，由487个aa组成，分子量为60,000Da。市售的T4DNA连接酶是该基因在大肠杆菌中表达后纯化得到的。此酶的催化过程需要ATP辅助。第66页/共83页（1）特点：只连接双链分子，不能催化两条游离的DNA链相连接。

（2）

用途：连接粘性末端及平末端，修补缺刻。

基因工程中广泛应用。

（3）

抑制剂：

PO43->5mM,NaCl>25mM,Ca++>0.1mM3DNA连接酶第67页/共83页2.E.coliDNA连接酶由lig编码，为相对分子量75,000Da的多肽链，NAD+供能。对DNA-RNA无效。活性低，不常用。3DNA连接酶第68页/共83页3.热稳定DNA连接酶此酶都以NAD+为辅助因子。若存在聚合剂，具有催化平末端连接的功能。被用于检测哺乳类DNA突变的扩增反应中。3DNA连接酶第69页/共83页表：DNA连接酶的部分性质3DNA连接酶连接酶底物辅助因子、激活因子Temp（单位：℃）巯基试剂粘性末端平末端DNA-RNARNA-RNA大肠杆菌DNA连接酶YesYesNoNoNAD+、Mg2+粘性末端：10-15补平缺口：37不需T4DNA连接酶YesYesYesYesATP、Mg2+粘端：4平端10-25补缺口：37需DTT噬热菌连接酶YesNoNoNoNAD+、Mg2+粘性末端：24-37℃补平缺口：65-72℃需第70页/共83页DNA连接酶催化的连接反应特点：

1.需要在一条DNA链的3’-末端具有一个游离的羟基(-OH)，和在另一条DNA链的5’-末端具有一个磷酸基团(-P)。2.利用NAD或ATP作能源。3.不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋的一部分。4.只封闭缺口，不封闭裂口。第71页/共83页1.ATP（NAD+)提供能量激活的AMP。三、连接反应的机理2.AMP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi（NMN）

。3.AMP与连接酶的赖氨酸-氨基相连。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2++H3NAMPATP(NAD)PPi(NMN)第72页/共83页4.AMP