分子生物学与临床课件

分子生物学与临床

随着分子生物学技术的发展，聚合酶链反应（PCR）技术已逐渐应用于遗传性疾病、肿瘤及感染性疾病等方面的诊断。

1.检测临床标本中病原体核酸序列。

2.肿瘤基因突变情况。

3.遗传性疾病的基因序列。

4.人类白细胞表面抗原（HLA）配型。

5.法医学方面的鉴定工作。PCR技术在临床实验室应用的价值优点：1.灵敏度高，理论上，只要标本中含有一个分子的DNA或RNA就可以作出诊断。2.特异性强，对于一个19核苷酸的引物来说，非特异性配对的概率为419=2.75*1011这表示要与这19个碱基的排列顺序完全相同时需要的基因组DNA片段的最小长度，而人的基因组长度为3*109碱基对，以克服血清学诊断有交叉反应的缺陷。3.可以早期诊断，如在HCV的感染中，第一周内就可以检测出HCVRNA，而抗体的产生一般在第二周以后。PCR在诊断病原体感染时的优缺点不足之处:

1.操作复杂，技术不易被熟练掌握。2.价格昂贵。3.出于敏感性太高，操作步骤多而复杂，即使有极少量的污染也会造成假阳性。4.由于操作复杂，对试剂及实验条件要求严格，稍有差错就会出现假阴性。几点认识一.今后仪器和试剂的发展方向：封管、定量及自动化；二.样品采集方式对PCR很重要，比操作更重要。三.内标作用：操作过程的监控、控制假阴性。四.从核酸提取、扩增到检测，对照与待测标本同步进行；五.禁用产物的电泳分析技术。六.探针杂交技术和防污染技术的采用是一大进步。二.标本的稳定化处理用于DNA扩增检测的标本，采集后一般不需特殊的稳定化处理，但标本应及时送至实验室。由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA测定的标本有时必须进行稳定化处理，如流行病学调查的现场采样。异硫氰酸胍盐（Guanidinethiocyanate,GITC）可使

DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆按1∶4的比例加至含有5mol/LGITC的试管内中，从而使血清（浆）中的RNA酶不可逆失活。经上述稳定化处理后，标本一般不需要冷藏即可邮寄。对于特定的检测项目，上述稳定化处理方法的效果究竟如何，要使用相应的逆转录PCR测定方法来评价。三.标本的运送标本采集后必须尽快送至实验室。经过适当稳定化处理的标本可在常温下通过邮寄运送。如用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血标本及用于RNA扩增检测的经GITC稳定化处理的标本，通常在运送时，应采用不易破碎的容器装载标本。用于RNA检测的标本，如果未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。四.标本的贮存临床体液标本如血清/血浆等可于-70℃下长时间贮存。用于DNA测定的已纯化核酸样本可在10mmol/LTris-1mmol/LEDTA缓冲液（pH7.5-8.0）中4℃保存，用于RNA测定的已纯化核酸样本应在缓冲液中-80℃或液氮中贮存。用乙醇沉淀的核酸样本贮存在-20℃即可。用GITC处理的RNA标本在室温可保存7天。一.内源性物质(影响因子）1.类风湿因子2.补体3.嗜异性抗体4.嗜靶抗原的自身抗体5.医源性诱导的抗鼠Ig(s)抗体6.交叉反应物质7.标本中其它成分的影响二.外源性物质1.标本溶血2.标本受细菌污染3.标本保存不当4.标本凝集不全5.标本管中添加物质的影响PCR测定的临床应用及

测定结果的临床意义结核分支杆菌病原学：结核分支杆菌复合群（MTBC）：人型结核分支杆菌、牛型结核分支杆菌、非洲型结核分支杆菌和田鼠型结核分支杆菌，后者无致病性。对人有致病性的主要是人型结核分支杆菌，牛型引起人类发病已很少见。此外分支杆菌报道有100余种，1994年国际公认有56种，常用非结核分支杆菌（NTM）或其他分支杆菌（MOTT）的名称。培养：15-20小时一代，2-4周看到培养基上的菌落。抗菌治疗后需4-8周或20周才出现菌落。临床应用评价：Tb与其他分支杆菌区别：AIDS鸟分支杆菌，龟分支杆菌TB耐药基因含菌量较低标本分离TB敏感性：远高于直接涂片和培养涂片镜检：10000-100000菌/ml，培养：10-100个活菌PCR：1-20个结核杆菌，但不能鉴别死菌和活菌，不能反映抗结核治疗的效果；还可见临床无结核病证据涂片和培养均阴性而PCR阳性的情况，这在理论上可诊断结核，但临床上很难被医师认同，这涉及所谓金标准的问题，目前还远不能就此情况下PCR阳性的生物学意义和价值作出评价。沙眼衣原体ChlamydeatrachomatisCt病原学：三个生物变种：沙眼生物变种—A-K12个血清型性病淋巴肉牙肿变种LGV—3个血清型，人是天然宿主鼠生物变种—鼠是天然宿主，不侵犯人，与鼠肺炎有关病原学检验：涂片、抗原抗体检测、核酸检测四种衣原体的性状比较特别要注意的问题:取材:一定要取到细胞临床评价：金标准—培养免疫学：荧光—主观判定

EIA—金葡、链球菌、淋球菌-交叉反应

PCR：假阴阳性人类组织相容性抗原(HLA)组织相容性（主要组织相容性复合体—MHC）系统的概念：有I、II、III类I类：HLA-A，HLA-B，HLA-C，HLA-E，HLA-F，HLA-G，HLA-H…L等II类:HLA-DR，HLA-DQ，HLA-DP，HLA-DO，HLA-DN，HLA-M,…等位点III类:为补体系统C2，C4，Bf等。HLA抗原的分类:I类和II类抗原多态性、共显性遗传：已发现的HLA基因位点(等位基因数)约400左右HLA分型的基本方法血清学方法:基本原理—活的淋巴细胞表面有大量的HLA-A,HLA-B,HLA-CHLA-DR抗原,在与特异性的同型抗体结合后,有补体存在时会被杀死,经过染色，根据淋巴细胞被杀死的百分率,可以决定待测淋巴细胞是否具有某一特异性的抗原.细胞学方法:基本原理—检测的抗原属于HLA-DP，HLA-DQ两个位点，如果两种淋巴细胞表面抗原不同,在一起培养，不同抗原互相刺激，淋巴细胞增殖并向母细胞转化；否则，这两种细胞会保持不变。HLA抗原：一.HLA—ABC抗原:与疾病相关HLA—A,B与器官移植的关联没有D的配型意义显著,C无意义.二.HLA—D抗原:与器官移植配型相关DR座位上的等位基因数比AB座位上的少,在随机人群中挑选到DR抗原配合的供体要比选择AB抗原配合的供体容易,所以目前器官移植主要做DR配型.遗传病检测遗传病是由基因在性细胞的突变引起的一。PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针法对已知突变热点基因检测：PCR-目的基因-膜杂交发现突变位点合成正常及突变寡核苷酸探针一个等位基因有一种ASO探针,要证明待测标本是否属于这一等位基因,要进行一次杂交显示信号的操作,这对于致病基因有多个突变可能性的诊断(地中海贫血在中国有18种突变类型,全球有100多种),操作繁杂甚至不可能.二。PCR扩增特异等位基因在3’末端设计突变位点,根据特异性PCR产物出现与否判断突变的存在.UNG酶/dUTP防污染系统

本试剂盒中加入了dUTP以保证PCR只选择性地扩增临床中的靶DNA。UNG酶（尿嘧啶糖基化酶）能识别并催化酶解含有dUTP的DNA结构，但不会对含有dTTP的DNA的结构识别并催化酶解。dUTP不存在于自然的DNA中，只有运用dUTP替代dTTP的PCR反应之中产生的扩增子中存在。这种dU化的PCR产物与UNG酶一起孵育后使其失去再被扩增的能力，因UNG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖苷键，可去除dU，使无dU的位点阻止TaqDNA聚合酶的延伸。UNG酶可从单链或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无作用。

UNG酶在正常PCR循环变性一步就可被灭活，所以对含dU的新的PCR产物没有影响。肿瘤研究中的分子生物学肿瘤分为:癌,肉瘤,白血病/淋巴瘤癌:90%的人类肿瘤,起源内胚层及外胚层上皮细胞肉瘤,白血病/淋巴瘤起源中胚层细胞,包括肌肉,骨骼,血管,成纤维细胞以及血液和淋巴系统中的循环细胞肿瘤发展的多步性.病毒癌基因:肿瘤病毒:有致癌能力的DNA病毒:(

6个病毒家族)乙肝病毒,猴病毒40,多瘤病毒,乳头瘤病毒,疱疹病毒,痘病毒只有一类RNA病毒致癌—反转录病毒肿瘤抑癌基因的发现:Hanis1960年,正常细胞与肿瘤细胞融合—杂合体细胞不致瘤—正常细胞中具有肿瘤抑制基因—产生肿瘤表型的负调节物—当杂合体细胞某段染色体丢失后—细胞变为肿瘤表型---这段染色体上有重要的肿瘤抑制基因抑癌基因:P53—多种肿瘤.早期发现肿瘤中P53表达增加,认为是癌基因.正常P53基因抑制肿瘤形成,肿瘤中过量表达的是P53基因突变体—作为显性抑制物影响P53功能—致癌P16,PTP多种抑癌基因WT1—肾母细胞癌DCC—结肠癌APC—家族性腺瘤息肉癌变广义的讲,许多在细胞繁殖中起正常作用的基因,如DNA修复基因，其突变也会导致肿瘤的发生,它们的存在间接地起到抑制肿瘤的作用临床评价1、假阳性与假阴性2、阳性率与“金标准”3、临床实践是最重要的依据遗传病诊断地中海贫血：珠蛋白序列中的的十几种点突变；3’-碱基特异的PCR或ASO.地中海贫血:16号染色体珠蛋白序列中基因簇的三种大片段缺失；每条染色体上各有两个紧密连锁的基因，故一对16号染色体上共有四个珠蛋白基因（/）缺失1个基因--+珠蛋白合成障碍性贫血缺失2个基因--0珠蛋白合成障碍性贫血缺失3个基因--HbH病缺失4个基因（全部缺失）--HbBart’s胎儿水肿综合症非缺失型珠蛋白合成障碍性贫血—不终止—HBconstantspring遗传病诊断甲型血友病：X-连锁隐性遗传病，（长距离PCR技术）唐氏综合症（21三体）：三体形成—配子期；智力低下，1/800全基因组分析法:多个具有多态性的位点进行连锁分析。生物芯片：PCR技术在HLA-DRB1基因配型中的应用：序列特异性引物PCR（SSP-PCR）：基因诊断是指检测感染者体内病毒核酸的有无,或含量多少来进行病原学诊断的一类方法。病毒性肝炎基因诊断包括病毒基因种类及含量、基因分型、亚型和变异及准种等的诊断。甲型肝炎和戊型肝炎无慢性化,且有较好的血清学诊断指标,故一般不需进行基因诊断。HGV和TTV病毒性肝炎的基因诊断

定性和定量PCR：定性检测主要是用于未知感染者的诊断,确定患者是否感染了肝炎病毒,结果分别报告为"阳性"或"阴性"。定量测定：己知感染者的抗病毒治疗时动态观察疗效,结果报告需以量来表示。如高出定量范围上限，则需对标本稀释后再测,低于定量范围下限时,则报告小于××copies/ml,不能以"阴性"形式报告。

病毒性肝炎的基因诊断

肝炎病毒甲型肝炎病毒与戊型肝炎病毒由消化道传播，引起急性肝炎，不转为慢性肝炎或慢性携带者。乙型与丙型肝炎病毒主要由输血、血制品或注射器污染而传播，除引起急性肝炎外，可致慢性肝炎，并与肝硬化及肝癌相关。丁型肝炎病毒为一种缺陷病毒戊型肝炎病毒（HEV）庚型肝炎病毒（HGV）TT型肝炎病毒（TTV）SEN型肝炎病毒（HSV）甲型肝炎病毒（hepatitisAvirus，HAV）

HAV的生物学性状属小RNA病毒科，直径27nm，无包膜呈20面立体对称外面为一独立外壳，内含一个单链RNA分子

HAV的电镜照片Feinstone（1973）HAV的结构HAV的致病性粪－口途径传播口咽部或唾液腺中早期增殖肠道与局部淋巴结中大量增殖入血并形成病毒血症肝脏为最终靶器官（病毒直接损伤或免疫病理作用）通过胆汁随粪便排出体外HAV的免疫性HAV只存在单一的抗原抗体系统，即HAVAg和抗-HAV无论显性感染还是隐性感染均能诱生出高效价抗-HAV抗-HAVIgM阳性是甲肝的确诊依据IgM型抗体在感染后仅持续存于3-6个月IgG型抗体则可存在多年

TimecourseofHAVinfectionHAV的其他生物学特性培养特性原代肝细胞或恒河猴胚肾传代株细胞对HAV敏感，生长缓慢，不引起细胞裂解抵抗力比肠道病毒更耐热，60℃1h不被灭活，100oC5分钟可灭活对乙醚、酸处理（pH3）均有抵抗力氯消毒、紫外线照射、福尔马林处理均可破坏其传染性常见症状流感样症状厌食恶心黄疸（眼部及皮肤呈黄色）尿黄腹痛乏力微生物学检查感染早期可检测血清中的抗－HAVIgM流行病学调查可检测抗－HAVIgG对已接种甲肝疫苗者检测中和型抗－HAV抗体直接检测抗原或用分子生物学方法检测病毒RNA乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）HBV--DNA病原学：HBV属嗜肝DNA病毒科，部分双链DNA，3200碱基对，10个亚型，序列表明不同亚型的变异为10%，同一亚型的变异为2%。检测：病原体抗原、抗体核酸临床评价：HBV的基因组结构3.2Kb不完全双链环状DNA，含4个ORF可将微孔板包被有蛋白质（如亲和素或链霉亲和素、抗Dig-抗体、牛血清白蛋白）或已知序列的核苷酸，此为通用型活化微孔板，任何探针末端只要含有相应配体或与已知序列互补的核苷酸都可与相应的活化微化板固相化。我们设计了HBV特异探针，其-端含-段与通用板已知序列互补的核苷酸，引物5'端修饰有生物素，HBVDNAPCR产物与固相化探针杂交后，即可用酶标亲和素进行酶呈色测定，并证实其测定敏感度至少高于普通电泳法100倍。

HBVDNA定量测定的临床意义

为临床诊断提供更全面、精确的资料真实、全面地反映HBV感染、复制及病情变化过程抗病毒治疗的分子水平监测用HBVDNA的血清浓度的变化来评价抗病毒药物的疗效①：荧光探针1 ②：荧光探针2 ③：引物 ④：PCR扩增产物 ⑤：Taq酶扩增及检测原理a：变性，双链模板裂解成两条单链b：退火，引物、荧光探针分别结合到单链模板的相应位点，探针①3’端激发基团和探针②5’端的发光基团紧靠在一起，发出640nm的荧光c：延伸，随聚合反应的进行，结合在模板上的2条荧光探针被替换下来。d：一个循环结束，生成2条双链模板

阳性率（％）

上海瑞金医院上海市传染病医院浙医大附属第一医院合计“大三阳”标志100（42/42）100(38/38）100(28/28）100（108/108）“小三阳”标志43.9(18/41）78.9(30/38）46.4(13/28）57.0(61/107）其它HBV血清学标志阳性7.5（3/40）38.0(19/50）23.8（5/21）24.3(27/111）非乙肝肝病0（0/20）0（0/18）0（0/18）0（0/56）献血员0（0/40）0（0/36）0（0/28）0（0/104）不同临床标本组中的HBVDNA检出率不同临床标本组中HBVDNA阳性的定量结果临床组平均病毒载量考核医院“大三阳”标志“小三阳”标志瑞金医院2.83×1078.80×105上海传染病医院1.00×1071.85×105浙一医院1.93×1071.70×105合计1.78×1076.85×105电镜下的HBVDane颗粒HBV的小球形颗粒HBV的管形颗粒

HBV的复制HBV的抗原组成表面抗原HBsAg核心抗原HBcAg

e抗原HBeAg表面抗原HBsAg存在于三型颗粒中是HBV感染的主要标志分亚型（a,d/y,w/r,adr）产生抗-HBsPreS1、PreS2及抗-PreS1和抗-PreS2核心抗原HBcAg仅存在于Dane颗粒中不易在血液中检出可在感染的肝细胞表面存在刺激机体产生抗HBc（IgG、IgM）表明病毒在复制e抗原HBeAg仅存在于Dane颗粒中游离存在于血液中为病毒复制及强传染性的指标产生抗－HBe，是预后良好的征象HBV的其它生物学性状培养黑猩猩动物模型、鸭动物模型用分子生物学技术的细胞培养成功抵抗力抵抗力强于HAV

对低温干燥紫外线耐受不被70％乙醇灭活

100℃10分钟可灭活HBV的致病机制免疫低下：HBsAg无症状携带者病毒变异：逃逸免疫细胞介导的免疫损伤：为主免疫复合物性的免疫损伤：肝外损伤自身免疫反应的免疫损伤：肝特异性脂蛋白抗原HBV的传染机制传染源主要传染源是患者或无症状HBsAg携带者传播途径密切接触血液及体液母婴传播不严格集体预防接种、药物注射针刺、文身等乙型肝炎的特点我国约有40%-60%人群曾受到过HBV的感染表现急性乙肝的仅占0.1%-1%，亚临床30%-75%，慢性乙肝1%-5%，乙肝病毒携带7%-20%)急性乙肝如治疗不彻底，10%患者可转为慢性乙肝乙肝五项及HBVDNA的临床意义

HBsAg、抗HBsHBeAg、抗HBe抗HBc（HBcAg）HBVDNA乙型肝炎病毒抗原,特别是表面抗原,在血液中的浓度较高,现症HBV感染——明确诊断。仅抗HBc单项阳性,也可在血清中检测到HBVDNA乙型肝炎的诊断往往不需要进行病毒核酸的检测。抗病毒治疗时,血清中的病毒核酸含量是反映病毒数量和复制活跃程度最可靠的直接指标、动态观察药物疗效的确切指标,特别是对于HBeAg阴性患者。预防及免疫控制传染源，切断传播途径人工自动免疫：疫苗（血源性、基因工程)人工被动免疫：高效价人血清球蛋白（HBIg）丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus）HCV的生物学性状40～60nm球形有包膜单正链RNAHCV的基因结构丙型肝炎的特点我国丙肝病毒携带者的比例在2%-5%随着年龄的增长，丙肝病毒携带率亦增高易感人群感染HCV后，慢性化的比例高达50%以上乙肝患者容易重叠HCV感染HCV的诊断及预防检查病毒RNA检测抗HCV因HCV免疫原性不强及变异，目前尚无可用疫苗HCV-RNA

HCV是引起输血后肝炎主要致病因子，因为血中HCV含量仅为HBV的千分之一，加之其免疫学标志仅有抗-HCV一项，至今HCV分离尚不成功，其检测较HBV困难得多，因此分子生物学方法在此应用显得格外重要。

丙型肝炎基因诊断及意义

结果判断抗HCV(+)伴ALT，或已排除其他肝炎的慢性肝炎，可诊断为丙肝。抗HCV(+)，ALTN。必须检测到HCV-RNA(+)（定性）才诊断丙肝。丙型肝炎基因诊断及意义

结果判断抗HCV(-)，临床怀疑丙肝。应做HCV-RNA二次定性或有一次定量(+)，可诊断为丙肝。常见于免疫功能低下或缺陷、少数儿童和老人。急性丙肝抗HCV检出率为50%--90%，应检测HCV-RNA。抗病毒药用治疗必须用定量PCR检测反映药物疗效。HCV--RNA病原学：单链正股RNA病毒基因组长度10KB，为一个连续的ORF，包含多个结构区和非结构区的蛋白基因。HCV变异及其亚型：序列变异率在3.2-28%之间,不同国家和地区分离的毒株基因差异很大,同一患者在不同时期分离的毒株也有变异.HCV基因组分为I-IV型和若干亚型.定量检测HCV—RNA:1.可用于急性丙肝的早期诊断,在HCV阳性之前2.可作为HCV感染有无传染性的指标3.作为抗病毒疗效的指标HCV的生物学性状40～60nm球形有包膜单正链RNAHCV的致病性与免疫性传播途径似HBV是引起输血后慢性肝炎和肝硬化的主要原因潜伏期：4-8周无症状HCV携带者和慢性丙肝者多见诱发肝外损伤：肾小球肾炎免疫力不牢固丙型肝炎的特点我国丙肝病毒携带者的比例在2%-5%随着年龄的增长，丙肝病毒携带率亦增高易感人群感染HCV后，慢性化的比例高达50%以上乙肝患者容易重叠HCV感染HCV的诊断及预防检查病毒RNA检测抗HCV因HCV免疫原性不强及变异，目前尚无可用疫苗HCV的诊断及预防丙型肝炎病毒：中国普通人群抗ＨＣＶ抗体的阳性率为32%全世界约17亿人感染了ＨＣＶ目前除了干扰素α(ＩＦＮα)或其与利巴韦林联合应用对部分患者有一定疗效疫苗研究：由于ＨＣＶ包膜糖蛋白Ｅ2中和性抗原位点存在高变区1(ＨＶＲ1)进展甚微ＨＣＶ抗原表位：线性表位、空间表位。如果以ＨＣＶ特异性抗体对化学合成的随机噬菌体多肽库进行筛选,则很难筛选到与原始的抗原序列完全一致的序列,而是获得大量与原始抗原序列完全不同的多肽片段。这种一级结构序列与原始抗原不同,又保留其抗原反应性的抗原表位,称为模拟表位(ｍｉｍｏｔｏｐｅ)。从其结构而言,模拟表位多数是构象表位(ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｅｐｉｔｏｐｅ),即空间表位。噬菌体表面展示技术的建立和应用促进了ＨＣＶ抗原模拟表位的研究。国外学者应用噬菌体表面展示技术筛选获得了ＨＣＶ不同的结构和非结构蛋白抗原的模拟表位。这些研究结果首先在免疫学理论上阐明了抗原抗体分子之间相互对应的多样性的问题,同时由于模拟表位的抗原性较强,且具有广谱性,因此,在新型诊断试剂和广谱疫苗的研究中具有重要的应用前景。HCV的诊断及预防丙型肝炎病毒感染的诊断,第三代血清学检测试剂——较好的敏感性和特异性,但20%患者可不出现抗体,或有的患者抗体存在时间可以很长现行感染，早期诊断——因此,核酸检测在HCV感染的诊断中要比HBV感染的诊断重要得多。

丁型肝炎病毒（hepatitisDvirus，HDV）HDV是一种缺陷病毒由HBsAg构成其外壳HDV定位于肝细胞核内，在血液中由HBsAg包被，形成35-37nm颗粒单负链环状RNAHDV的结构Rizzetto于1977年首先发现，又称抗原35-37nm球形颗粒；1.7Kb-ssRNA含9个ORF丁型肝炎的特点只能感染HBsAg阳性的病人我国丁肝感染率在1.6%-5%，西南地区感染率高患者可不定期隔离，或隔离至肝功能正常，或HBsAg阴转。病原学检查为HDAg、抗HD及HDV-RNA，持续高滴度IgG型抗HD是慢性HDV感染的主要血清学标志。一旦乙肝患者感染了HDV，尤其是在慢性乙肝的基础上感染，容易发展成为重度慢性乙肝、重型肝炎，甚至肝硬化。微生物学检查及预防诊断为检测抗-HDHDV-RNA丁型肝炎传播途经与乙型肝炎相似。传播途径和防治原则似HBV。戊型肝炎病毒（hepatitisEvirus，HEV）球形，无包膜直径32～34nm单正链RNA，3个ORF两个血清型致病性及免疫主要为粪－口途径传播由胆汁经粪便排出体外对肝细胞的直接损伤及免疫病理作用多表现为急性戊型肝炎孕妇感染常致流产戊型肝炎的特点与甲型肝炎相比，患者黄疸前期症状重，病程持续时间较长，病死率较高，特别是孕妇感染HEV后。青壮年是HEV最喜欢攻击的人群。戊型肝炎分两种：“流行性”多发生在雨季和洪水后，“散发性”在秋冬季呈现高峰。传染性强的时间在患者将要出现症状前(潜伏末期)至发病初期，患者的隔离期为起病后3周。尚末发现有2次发病者。微生物学检查及预防检测HEV：EM或IEM检测抗-HEVIgMHEVRNA预防与甲肝类似TLMV病毒（TTV-likedminivirus,TLMV）：2000年TakahashiTTV-DNA引物作PCR，检测抗-HCV阳性血浆，10份TTVDNA滴度>105拷贝/ml，其中3份（分别为CBD231、279和203）血浆PCR产物的长度较预期为短（约1.2kb），该病毒的全长DNA序列较TTV为短，分别为2860nt（CBD231株）、2856nt–BD279株）和2897nt（CBD203株），证明是一种新病毒，命名为TTV样微小病毒（TTV-likeminivirus，TLMV）.准种的研究：集中在RNA病毒（RNA病毒变异大，复制快，短时间内感染个体中即可形成一个彼此密切相关的异质性病毒群体.）HCV和HIV病毒的准种特性：实质是进化的一种生存优势，病毒最大限度地"制造"自己的大量变异序列，这些序列中可能包括了潜在有用的变异体，对抗病毒制剂有抵抗能力能逃避CTL攻击和诱导免疫耐受的突变体.这样当环境改变后病毒可以快速的作出反应，从而保证其在宿主体内的生存最近的研究还发现病毒准种象人体免疫系统一样具有记忆能力，当准种再次遇到经历过的环境作用时，保存在突变谱内的少量病毒株将迅速大量复制成为准种的主导序列.因此如果病毒准种的复杂性越大，治疗难度就可能越大.

在HCV的研究中已发现，病毒准种的异质性越大，对IFN-α的应答性就越差DNA病毒的HBV也存在准种特性.已有少量的研究报道证实了这种假说，有关HBV准种复杂性与IFN-α应答性之间相关性研究尚未见报道.HBV不仅存在准种特性，且在慢性乙型肝炎中准种的复杂性和异质性还很大.同时也发现，在IFN-α应答的患者中，准种的复杂性明显小于非应答患者，这与在HCV的研究发现相一致.肝脏天然免疫系统的研究意义：肝脏NK细胞研究NK细胞是天然免疫的核心细胞,在肿瘤及病毒的免疫监视中十分重要,国内该领域研究十分薄弱。肝脏是机体天然免疫的核心器官,近3年才形成此概念,国际上研究亦十分薄弱,有望形成自有学科优势。

DLC-1基因表达与肝细胞癌复发转移的关系应用实时定量聚合酶链反应(RQPCR)研究位于8P的DLCl基因mRNA表达与肝细胞癌侵袭转移的关系。收集5l例复旦大学中山医院外科手术切除的肝细胞癌(HCC)及癌旁正常组织标本，根据临床病理学指标，分为高低侵袭性两组，用RQ—PCR对不同侵袭性HCC之间的DLCl基因表达进行分析。对不同侵袭转移潜能MttCC97一L．MHCC97一H、HCCLM3、Hep3B及HepG2肝癌细胞系用同样方法分析DLC—l基因的表达差异。结果非转移细胞系Hep3B和HepG2与转移细胞系MHCC97一L、MHCC97H和ttCCLM3之间DLCl基因表达差异有统计学意义(尸<0．01)，并随着侵袭与转移潜能的逐步提高DlJCl表达水下也相应逐步降低；HCCLM3细胞系显著低于MHCC97L细胞系(P<0．01)。HCC组织中，高侵袭忡HCC组DLC—l基因表达明显低于低侵袭性HCC组(P<0．05)。结论DIC—l基因表达与肝癌的侵袭转移的抑制相关，其表达可能在抑制肝癌的侵袭转移中发挥重要作用。

RNA干扰技术用于抗乙型肝炎病毒的实验研究构建针对乙型肝炎病毒表面抗原(IIBSAg)和核心抗原的小干扰RNA(siRNA)表达载体pSUperC，观察其对HepG22．2．15细胞(简称2、2．15细胞)中HBVDNA转录和翻译相应蛋白的影响。根据RNA干扰(RNAi)作用原理设计针对IIBV核心区的相应序列，再将其克隆入含聚合酶ⅢHlRNA启动子的真核表达载体PSUPer，将此重组质粒以电转染法转入2．2．15细胞中，用酶联免疫吸附法(Abbott试剂)检测培养上清液中HBsAg和e抗原(HBeAg)的表达。结果经酶切鉴定、电泳和测序分析证明，成功构建了含作用序列的重组质粒pSUperC；但以电穿孔法转染2．2．15细胞后末能发现其对2．2．15细胞培养上清液中的HBsAg和HBeAg的表达有影响。结论RNAi在2．2．15细胞中的作用还需进一步的实验来证实。乙型肝炎病毒cccDNA检测的方法与临床意义细胞外乙型肝炎病毒(HBV)DNA是一种松弛环状的双链DNA(relaxedcircularDNA，rcDNA)分子，其两条链均不是闭合的，其中负链较长，约3200个碱基，含有HBV基因组的全长基因，在其5起始端与3末端之间有一数个碱基的“缺刻”；正链较短，有较大的“缺口”，其3木端不固定，故长度是可变的，约为负链长度的50％～100％。在HBV的复制过程中，病毒DNA进入宿主细胞核，在DNA聚合酶的作用下，两条链的缺口均被补齐，形成超螺旋的共价、闭合、环状DNA分子(covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA)。治疗前后肝细胞内HBVcccDNA~含量的变ft应该纳入到抗一HBV药物评价的指标体系中来，从一定意义上说，只有能够彻底清除HBVcccDNA的药物，才能算是真正“有效”的抗病毒药物。cccDNA不同于rcDNA，后者存在于HBV核心中，外有核衣壳蛋白保护，因而在血液中是比较稳定的；而cccDNA原本存在于肝细胞核中，不与蛋白共价结合，肝细胞被破坏释放到血液中时从理论上讲应该是裸露的核酸分子，因此在血液中是否稳定尚存疑问。但我们认为HBVcccDNA是一种不断折叠而形成的超螺旋结构的DNA分子，不同于一般的双链DNA，既然用真核质粒作载体的各种DNA疫苗能通过机体的各种屏障被机体摄取而不被破坏，我们推测类似结构的乙型肝炎cccDNA在血液中应该也是稳定的。SEN病毒：一种新近发现的肝炎病毒？1999年Primi等在1例感染人类免疫缺陷病毒的静脉毒瘾者血清中分离出一种新的可能导致急、慢性肝炎的单链DNA病毒，并以该患者姓名的首位字母暂时命名为SEN病毒（senvirus，SENV）。SENV是一种无包膜、线状单股负链DNA病毒，长度约为3800kb。SENV的开放读码框（ORF）1氨基酸残基为642～762个，N末端富含精氨酸/赖氨酸区相对保守。SENV的ORF1具有3个Rep蛋白基序。SENV的ORF2含有146～166个氨基酸。ORF3与ORF1的3′端序列部分重叠，有81～88个氨基酸组成，在ATG起始密码子上有一个TATA功能区。它与经输血传播病毒（TTV）原型株的核酸序列同源性低于50%，氨基酸序列同源性仅为3%。因此，它不是TTV亲缘关系较远的病毒变异株，而是一群不完全相同的病毒组成新的亚科的代表。目前至少可分为A～H等8个基因亚型，各型间氨基酸序列差异在15%～50%之间。在目前已知的8个基因亚型中，仅SENV－C/H和D亚型与慢性肝病关系密切。SENV两个结构区的基因位点变异频率为7.32×10-4/年病毒性肝炎药物核苷类似药为一种强的单磷酸次黄嘌呤核苷脱氢酶抑制剂，阻碍病毒核酸合成。适应证：用于肾综合征出血热和丙型肝炎治疗剂量：口服0.8～1.0/d，3～4次分服副作用：有致畸和引起溶血，可致心肌损害和引起呼吸困难。利巴韦林（病毒唑，Ribavirin,Virazole）适应证：抗疱疹病毒，VZV病毒；其单磷酸盐（Ara-MP）可抑制HBV。副作用：消化道、中枢神经系统、肝损害及骨髓抑制等毒性反应。注意：不可静脉推注，滴速应慢，配制的液体不可冷藏；不可与别嘌呤醇合用，以免增加毒性反应。阿糖腺苷（Vidarabine）三磷酸化后具抑制HIV逆转录酶活性，可口服，生物利用度达80%以上，对宿主细胞增殖作用和骨髓毒性小，易产生抗药性，与AZT伍用可减少毒性反应。适应证：HIV感染剂量：每次0.03mg/kg，6次/d；与AZT交替使用副作用：主要为末梢神经炎（灼痛、刺痛），其他有皮疹、发热等脱氧胞苷（2’,3’-dideoxycytidine,ddC）

口服吸收较好，生物利用度可达40%，其活性部分在细胞内半减期>12h，可每日两次给药。如果先予AZT治疗8周后再用ddI，可更有效地防止病情进展，提高存活期适应证：HIV感染剂量：每日3.2～9.6mg/kg副作用：外周神经痛、胰腺炎、头痛、失眠、恶心、呕吐、发热、皮疹等。脱氧肌苷（2’,3’-dideoxyinosine,ddI）最初用于HIV感染，以后发现其对HBVDNAP有抑制作用，细胞毒性作用小，动物实验无致癌性。适应证：HIV，近年主要用于HBV感染。剂量：每日一次，每次100mg口服，不能间断副作用：较小，但可引起YMDD变异等，影响疗效。拉米夫定（Lamivudine,3TC）人工合成的嘌呤类抗病毒药，抑制HSV的DNAP，对细胞的αDNAP也有轻度抑制作用。适应证：HSV-Ⅰ、HSV-Ⅱ、VZV、EBV、CMV治疗，对

HBV也有作用。剂量：口服200mg，1次/4h或每日1g，分次给予；静滴每次5mg/kg，缓慢滴注持续1h，1次/8h×7天副作用：一时性肌酐升高、皮疹、出汗、血尿、低血压、头痛、恶心等。不能与青霉素、丙磺舒、头孢菌素合用，以免增加毒性。阿昔洛韦（Aciclovir，无环鸟苷，Zivirax）

为第二代核苷类似药，口服后迅速吸收转化为有抗病毒活性的潘昔洛韦（Penciclovir）,生物利用度达77%，有抑制HBVDNAP的活性，但对细胞聚合酶的亲和力小。适应证：HBV感染，对HSV-Ⅰ和HSV-Ⅱ及VZV均有作用。剂量：对HBV感染每次500mg，3次/d口服×4个月；对疱疹病毒每次250mg，3次/d口服×7天副作用：乏力、恶心、头痛、腹部不适等泛昔洛韦（Famciclovir）适应证：各种病毒性感染（如HBV和HCV感染）毛细胞白血病慢性粒细胞性白血病非何杰金淋巴瘤多发性骨髓瘤其他肿瘤等α干扰素人工合成的28个多肽，为胸腺第Ⅴ组分的主要有效成份。通过对T细胞的免疫调控作用而清除病毒感染、增强免疫。适应证；HBV、HCV感染，尤其用于重型肝炎抢救。辅助治疗免疫功能低下或免疫功能缺陷患者剂量：每次1.6mg，每周2次肌注。副作用；人工合成纯度达99.9%，因此不良反应很小。胸腺肽（Thymosinα1）Nevirapine和Pyridinone

两者均可直接抑制HIV-1逆转录酶，对AZT耐药株有效；对HIV-2无作用，易产生耐药性。其他药物非核苷类逆转录酶抑制剂

RitonavirIndinavirSaquinavir

三种药物与HIV蛋白酶结合后，均可抑制HIV复制。口服生物利用度不高，易于血浆蛋白结合，影响抗病毒活性。蛋白酶抑制剂

tat（HIV调节基因的产物）抑制剂，以阻断病毒基因调节而抑制病毒的复制，且对AZT耐药株有效。正在临床试验中。基因调节抑制剂

以人工合成的寡核苷酸片段象“封条”一样与病毒的调控基因或其他功能基因牢固地互补结合，从而阻断病毒的基因复制表达。由于其技术复杂，目前正在研究中。反义寡核苷酸病原推断的一般原理传染病的病原推断最早是由Henle首先提出，后由Koch补充形成，即所谓“Koch法则”：在相应疾病患者中总是能检出该病原体在其他疾病的患者中不能检出该病原体能从相应疾病患者中分离到该病的病原体，传过几代的培养物能引起实验动物患相同疾病能从被感染的动物中分离到相同的病原体依靠临床医生和疾病监测系统，及时发现疾病发生的异常现象及病因不明疾病的发生情况，并建立专门的疾病监测报告系统，开展流行病学调查临床、现场流行病学调查和实验室研究密切配合传统微生物学方法与现代分子生物学方法相结合，发现并多方证实新病原体发现和确认新传染病的策略和方法：如PCR检测为阳性，一定要进行以下试验予以确认：(1)对同一份原始标本进行重复试验(2)扩增病毒的第二个基因组区域(3)在另一实验室对同一份标本进行检测生物信息学简介

刘树业什么是生物信息学

生命活动的调控；基因、蛋白的功能、表达，细胞活动；器官、系统、整体活动；节律、生物钟；分蘖、生长、开花、结果；营养的吸收、传输、转化；对外界信号的反应等生物电磁学与电磁生物学：生物电磁：生命活体在不同层次的活动和不同属性（包括思维、精神）活动时以及和外界环境（生命体周围直至宇宙）相互作用时反映出来的各种电磁信息。人体的电磁辐射（包括发光）。电磁生物学：电磁辐射对生物体的影响。体内电、离、细胞等分布、极化状态变化导致疾病等。什么是生物信息学

视觉系统与光信息处理：视网膜神经元回路与信息处理，彩色视觉及彩色图像的编码、变换机制，眼动成象机制及宽视场、消色差动态成象系统，视觉认知机制及其图像信息的智能模式识别，不同状态立体视觉机制和静态、动态立体视锐度等。脑和神经系统与信息：脑的感知觉信息处理及其应用，学习、记忆、思维，逻辑思维和形象思维，思维模型与信息处理系统新原理的研究，新的计算模型、新型计算机如：神经计算机等。生物体结构与微光机电系统：微光机电系统是当代科技前沿，人能制造出生物体的微细结构吗？DNA驱动的微细机器人，生物大分子到细胞基本结构体系的自组装自组织，创造新物质的分子工程学研究，分子聚集体的化学等。

什么是生物信息学生命现象是在信息控制下不同层次上的物质、能量与信息的交换与传递过程。不同层次是指核酸、蛋白质、细胞、器官、系统、整体等。生物与信息相交叉的领域是正在发展中的前沿领域。生物学与信息科学是当今世界上发展最迅速、影响最大的两门科学。而这两门科学的交叉融合形成了广义的生物信息学，正以崭新的理念吸引着科学家的注意。生物信息学(Bioinformatics)是生命科学领域中的新兴学科，面对人类基因组计划所产生的庞大的分子生物学信息，生物信息学的重要性将越来越突出，它无疑将会为生命科学的研究带来革命性的变革。什么是生物信息学广义地说，生物信息学是用数理和信息科学的观点、理论和方法去研究生命现象、组织和分析呈现指数增长的生物学数据的一门学科。生物信息学是在生命科学的研究中，以计算机为工具对生物信息进行储存、检索和分析的科学。它是当今生命科学和自然科学的重大前沿领域之一，同时也将是21世纪自然科学的核心领域之一。其研究重点主要体现在基因组学(Genomics)和蛋白组学(Proteomics)两方面，具体说，是从核酸和蛋白质序列出发，分析序列中表达的结构与功能的生物信息。生物信息学的发展为生命科学的进一步突破及药物研制过程革命性的变革提供了契机。就人类基因组来说，得到序列仅仅是第一步，后一步的工作是所谓后基因组时代(post-genomeera)的任务，即收集、整理、检索和分析序列中表达的蛋白质结构与功能的信息，找出规律。生物信息学将在其中扮演至关重要的角色。

２００３年４月１４日，国际人类基因组测序组隆重宣布：美、英、日、法、德和中国科学家历经１３年的共同努力，人类基因组序列图亦称“完成图”，提前绘制成功。

生物学：为前基因组--后基因组

人类正生活在后基因组时代。人类基因组图谱：----“人体第二张解剖图”。

第一张人体解剖图：人体的构成，器官、结构与功能、组织与细胞，----今天的现代医学。

第二张人体解剖图：生物分子水平上的一张解剖图，将成为疾病预测、预防、诊断、治疗及个体医学的参照，将奠定２１世纪生命科学、基础医学与生物产业的基础。新版人类基因组序列图在２００３年４月２４日出版的《自然》杂志上公布，以纪念ＤＮＡ双螺旋结构发现５０周年。“人类历史最神奇的一份图谱”---克林顿，“上帝创造生命所用的语言”，“流芳百世的一天”；“医学史上的重大革命，其影响效应将远胜于抗生素的发现，这也是人类在２１世纪的第一项重大科技成就。”布莱尔它是一个学科领域，包含着基因组信息的获取、处理、存储、分配、分析和解释的所有方面。

生物信息学的研究目标是揭示“基因组信息结构的复杂性及遗传语言的根本规律”。它是当今乃至下一世纪自然科学和技术科学领域中“基因组、“信息结构”和“复杂性”这三个重大科学问题的有机结合。生物信息学是把基因组DNA序列信息分析作为源头，破译隐藏在DNA序列中的遗传语言，特别是非编码区的实质；同时在发现了新基因信息之后进行蛋白质空间结构模拟和预测。FROMSEQUENCEDATAOFDNATO3D-STRUCTUREOFPROTEINgene(codingregions,exons)primarysequenceofprotein3D-structureofproteinbiologicalfunction“JunkDNA”(uncodingregions,95%ofhumangenome)Oneofthelargestchallengesisidentifyingtheunknownfunctionsthatalmostcertainlyexistinmuchofthe“junk”DNA.若干重要科学研究内容

大规模基因组测序中的信息分析

大规模测序是基因组研究的最基本任务，它的每一个环节都与信息分析紧密相关。从测序仪的光密度采样与分析、碱基读出、载体标识与去除、拼接与组装、填补序列间隙、到重复序列标识、读框预测和基因标注的每一步都是紧密依赖基因组信息学的软件和数据库的。

获取人和各种生物的完整基因组:在基因组大规模测序的每一个环节都与信息分析紧密相关。光密度采样、分析、碱基读出、载体标识与去除、拼接、填补序列间隙，重复序列标识、读框预测和基因标注，紧密依赖生物信息学的软件和数据库。序列拼接和填补序列间隙是最为关键的首要难题。其困难不仅来自它巨大的海量数据，而且在于它含有高度重复的序列。为此，这一过程特别需要把实验设计和信息分析时刻联系在一起。另一方面，必须按照不同步骤的要求，发展适当的算法及相应的软件，以应对各种复杂的问题。国际上很多著名的基因组研究中心，都有自己的拼接和组装策略，并且这样的工作都是在超级计算机上完成的。人类对自身的认识就更为细致、更为精确：比如：发现在我们的基因组中真正编码蛋白质（称为外显子）等的部分很少，只占1．1％；外显子与外显子之间的区域（称为内含子）占了24％；而基因与基因之间的间隔序列却占了75％，也就是说在人类基因组中不编码蛋白质的区域占了绝大部分。发现人类编码蛋白的基因较之其它生物体的基因更为复杂，有更为丰富的剪接方式。发现基因组中片段重复现象很普遍，这反映了人类复杂的进化历史。发现人的第13号染色体比较稳定，而男性的第12号染色体和女性的第16号染色体是易变的，等等。

新基因和新SNPs的发现与鉴定

大部分新基因是靠理论方法预测出来的。比如啤酒酵母完整基因组(约1300万bp)所包含的6千多个基因，大约60％是通过信息分析得到的。

a)、利用EST数据库(dbEST)发现新基因和新SNPs

国际上现已出现了几个基于EST的基因索引如这些基因索引数据库(即二次数据库)构建了基因框架，极大地方便了相关研究者。超大规模计算b)、从基因组DNA序列中预测新ORF

单核苷酸多态性标记(SNP,singlenucleotidepolymorphism)96年被提出,被称为“第三代DNA遗传标记"。这种遗传标记的特点是单个碱基的置换,与第一代的RFLP及第二代的STR以长度的差异作为遗传标记的特点不同,在人类基因组中被认为有300万个以上的SNP遗传标记,这可能达到了人类基因组多态位点数目的极限。称为cSNP(codingSNP)。

每个SNP位点通常仅含两种等位基因——双等位基因(Biallelic),其变异不如STR繁多,但SNP在整个人类基因组的分布密集,数目比STR高出数十倍到近百倍,因此被认为是应用前景最好的遗传标记物。SNP的研究将帮助我们寻找新的遗传病的原因基因,认识人种、人群,个体间的遗传差异,疾病与个体差异的关系,以及个体差异对药物的耐药性存在的不同的反应能力等。

单核苷酸多态（SNP）

有的人吸烟喝酒却长寿，也有人自幼就病痛缠身；同一种治疗肿瘤的药物对一些人非常有效，对另一些人则完全无效。这是为什么？答案是他们基因组中存在的差异。这种差异很多表现为单个碱基上的变异，也就是单核苷酸的多态性（SNP）。

现在普遍认为SNP研究是人类基因组计划走向应用的重要步骤。这主要是因为SNP将提供一个强有力的工具，用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等。SNP在基因组中分布相当广泛，近来的研究表明在人类基因组中每300碱基对就出现一次。大量存在的SNP位点，使人们有机会发现与各种疾病，包括肿瘤相关的基因组突变；从实验操作来看，通过SNP发现疾病相关基因突变要比通过家系来得容易；有些SNP并不直接导致疾病基因的表达，但由于它与某些疾病基因相邻，而成为重要的标记。SNP在基础研究中也发挥了巨大的作用，近年来对Y染色体SNP的分析，使得在人类进化、人类种群的演化和迁徙领域取得了一系列重要成果。现代的检验医学在对疾病的诊断中,因为无法直接鉴定与疾病相关基因的异常或缺陷,只能通过变异基因的表达所导致的表型症状,从蛋白质、血清水平对疾病作出诊断,称为表型诊断。SNP标记的确立,将与现有的遗传标记物结合,与现有的基因诊断体系接轨,加速检验医学从表型诊断向基因型诊断的过渡。SNP标记的确立可望在基因分型为基础的治疗方面发挥巨大的作用。

比较基因组学研究

研究生命是从哪里起源的？生命是如何进化的？遗传密码是如何起源的？估计最小独立生活的生物至少需要多少基因，这些基因是如何使它们活起来的？比如，鼠和人的基因组大小相似，都含有约三十亿碱基对，基因的数目也类似。可是鼠和人差异确如此之大，这是为什么？同样，有的科学家估计不同人种间基因组的差别仅为0.1%；人猿间差别约为1%。但他们表型间的差异十分显著。这又为什么？

完整基因组序列的比较研究是解决这些问题的重要途径。一个DNA片段在人类、猴子、老鼠、鸡甚至果蝇中都差不多----DNA片段就一定会有较重要的基因。譬如引起一种X-隐性遗传物，杜氏肌萎缩症的基因，叫“迪姆迪（DMD）”-----2400千核苷酸长，DNA片段的一部分“杂交”到猴、狗、猪、鼠、鸡的基因组DNA上去，发现猴、狗、猪、鼠、鸡的基因组都存在并差不多，推论这个片段含重要的基因。----“动物园杂交法”，就是在动物园里找亲戚。

肥胖基因----小鼠中发现。有一种小鼠怎么少吃也发胖，还是“遗传”的，大胖鼠生小胖鼠，符合孟德尔定律。有异常就有正常，有“致胖”的等位基因就有“不胖”的等位基因。科学家就用“遗传分析”的方法，也用老鼠基因组的“遗传标记”。老鼠可“有序”交配，家系的“多世代，多个体”也容易做到，于是就用这个“胖小鼠”的家系，找到了这个“胖鼠”基因在小鼠基因中的位置，再根据小鼠基因组与人的基因组的对应关系，就把人的基因组中的“胖人”基因找出来啦！结构还很相似，----“致胖”的等位基因。在小鼠身上，这个“胖”基因的正常等位基因的产物注射一次，一月有效，“胖”小鼠没原先胖啦。现在，凡是在小鼠里找到一个基因，那么找到人的同一个或相似的基因就指日可待！基因组数据的生物进化研究

自1859年Darwin的物种起源(OriginofSpecies)发表以来，进化论成为对人类自然科学和自然哲学发展的最重大贡献之一。进化论研究的核心是描述生物进化的历史(系统进化树)和探索进化过程的机制。自本世纪中叶以来，随着分子生物学的不断发展，进化论的研究也进入了分子水平。当前分子进化的研究已是进化论研究的重要手段，并建立了一套依赖于核酸、蛋白质序列信息的理论方法。完整的理论分析过程必须包含以下步骤：

序列相似性比较。就是将待研究序列与DNA或蛋白质序列库进行比较，用于确定该序列的生物属性，也就是找出与此序列相似的已知序列是什么。完成这一工作只需要使用两两序列比较算法。常用的程序包有BLAST、FASTA等；l

序列同源性分析。是将待研究序列加入到一组与之同源，但来自不同物种的序列中进行多序列同时比较，以确定该序列与其它序列间的同源性大小。这是理论分析方法中最关键的一步。完成这一工作必须使用多序列比较算法。常用的程序包有CLUSTAL等；l构建系统进化树。根据序列同源性分析的结果，重建反映物种间进化关系的进化树。为完成这一工作已发展了多种软件包，象PYLIP、MEGA等；l稳定性检验。为了检验构建好的进化树的可靠性，需要进行统计可靠性检验，通常构建过程要随机地进行成百上千次，只有以大概率（70％以上）出现的分支点才是可靠的。通用的方法使用Bootstrap算法，相应的软件已包括在构建系统进化树所用的软件包当中。为便于使用者查找表三给出了进化分析相关软件的因特网地址。大规模基因功能表达谱的分析

随着人类基因组测序逐渐接近完成，人们自然会提出如下的问题：即使我们已经获得了人的完整基因图谱，那我们对人的生命活动能说明到什么程度呢？人们进一步提出了一系列由上述数据所不能说明的问题，例如：基因表达的产物是否出现与何时出现；基因表达产物的定量程度是多少；是否存在翻译后的修饰过程，若存在是如何修饰的；基因敲除（knock-out）或基因过度表达的影响是什么；多基因差异表达与表现型关系如何等等。概括这些问题，其实质应该是：知道了核酸序列和基因，我们依然不知道它们是如何发挥功能的，或者说它们是如何按照特定的时间、空间进行基因表达的，表达量有多少。

很多实验表明，在不同的组织中表达基因的数目差别是很大的，脑中基因表达的数目最多，约有3－4万个转录子。有的组织中只有几十或几百个基因表达。不确切知道每种组织中表达基因的数目，以及每个基因的表达量，就无法从分子水平上了解这一组织在生命活动中的功能。同一组织在不同的个体生长发育阶段表达基因的种类、数量也是不同的，有些基因是在幼年时期表达的，有些是中年阶段表达的，有些要到老年时期才表达；不考虑伴随着生物的生长发育，基因表达状况的变更，也无法确切地说明生命的过程。因此不少科学家认为基因组研究应当进入一个内函更丰富、更深刻的阶段。这一阶段的核心是获得基因的功能表达谱。按物理学家的观点是应将存在于人类基因组上的静的基因图谱，向时间、空间维上展开。为了得到基因表达的功能谱，国际上在核酸和蛋白质两个层次上都发展了新技术。这就是在核酸层次上的DNA芯片技术和在蛋白质层次上的大规模蛋白质分离和序列鉴定技术，也称蛋白质谱技术和蛋白质组研究。无论是生物芯片还是蛋白质组技术的发展，都更强烈地依赖于生物信息学的理论、技术与数据库。下一步，功能基因组研究将朝着复杂系统的方向发展，即：探讨生物系统中各部分、各层次的相互作用，从而进入系统生物学的领域。基因组中非编码蛋白质区域的结构与功能研究

近年来的研究表明，在细菌这样的微生物中，非编码蛋白质的区域只占整个基因组序列的10％到20％。随着生物的进化，非编码区越来越多，在高等生物和人的基因组中非编码序列已占到基因组序列的绝大部分。这表明：这些非编码序列必定具有重要的生物功能。普遍的认识是，它们与基因的表达调控有关。

对人类基因组来说，迄今为止，人们真正掌握规律的只有DNA上的编码蛋白质的区域（基因），最新资料说明这部分序列只占基因组的1．1％。仅占人类基因组1．1％的编码区的相关研究已经缔造了数十名诺贝尔奖获得者，98％非编码区蕴含的成果数量将是十分可观的，因此寻找这些区域的编码特征、信息调节与表达规律是未来相当长时间内的热点课题，是取得重要成果的源泉。

蛋白质结构模拟与药物设计蛋白的空间结构模拟和药物设计已有二三十年的历史。随着人类基因组研究的飞速发展，这一领域面临着新的态势，即：找到人类3—4万个基因的碱基序列是指日可待的事，因而确定它们表达产物的氨基酸顺序也会逐渐实现，此时预测这些蛋白的空间结构，进而实现针对性的药物设计，就成了迫在眉睫的任务。这也是大规模的计算问题。

一是构建与疾病相关的人类基因信息数据库（包括SNP数据库），二是发展有效地分析基因分型数据的生物信息学算法，特别是将SNP数据与疾病和致病因素相关的计算方法。建立与动、植物良种繁育相关的基因组数据库，发展分子标记辅助育种技术根据不同物种间的进化距离和功能基因的同源性，找到各种家畜、经济作物与其经济效益相关的基因，并进一步认识它们发育、生长和抗逆的各种途径和机制。利用相关的基因组分子标记，加快育种的速度，按照人们的愿望加以改造。人类基因组信息为药物发展提供了新的候选分子和新的候选药靶基因。同时，分子生物学常用的表达载体、PCR和杂交引物以及各种试剂盒（包括DNA芯片）的设计必须依赖于核酸的序列信息。基因组信息学提供的大量信息为这类技术的发展提供了广阔的天地。

生物信息数据库与查询

一级数据库和二级数据库:一级数据库:数据直接来源于实验的原始数据，经简单的归类整理和注释；二级数据库:在一级数据库、实验数据和理论分析的基础上针对特定目标衍生而来，是对生物学知识和信息的进一步整理。国际上著名的一级核酸数据库:Genbank、EMBL核酸库和DDBJ库