中药DNA条形码鉴定方法体系的建立与推广

中药DNA条形码鉴定方法体系的建立与推广第1页/共42页中药鉴定领域寻求变革与突破经典中药鉴定方法难以满足现代需求鉴定方法缺失导致严重安全性事件

--关木通误当木通广防己误当防己导致急性肾功能衰竭（马兜铃酸肾病事件）

--土三七误当三七服用，导致严重肝毒性Hoangetal.ScienceTranslationalMedicine,2013,5:197ra102.NortierJL,MartinezMCM,SchmeiserHH,etal.NewEnglandJournalofMedicine,2000,342(23):1686-1692.关木通百度百科木通中药材天地网第2页/共42页中药鉴定技术瓶颈

一万余种中药材物种鉴定品种混乱传统四大鉴定方法体系的局限路在何方？基原鉴定形态鉴定显微鉴定理化鉴定第3页/共42页DNAbarcodingcanachievearapidandaccurateidentificationforherbsApowerfultoolforidentifyingmedicinalplantsandtraditionalChinesemedicinalmaterialsAbruscantoniensis

Abrusprecatorius

MedicinalplantsChineseherbalmedicinesDNAbarcodingtechnologyusesashortandstandardizedgeneregiontoidentifyspeciesOnesequenceOnespecies第4页/共42页PlantWorkingGrouprecommendedrbcL+matKastheplantbarcode,successfullydiscriminateatthespecieslevel--72%.

FarfromperfectduetothelowidentificationratePNAS2009Science2009Threegenomesinplantsandcandidatebarcodesfocusedongenesandintronsofthechloroplastgenome第5页/共42页IdentificationefficiencyforITS2:92.7%and99.8%atspeciesandgenuslevel,respectivelyMarkerMethodofspeciesidentification(Rossetal.2008SystBiol57:216-230)CorrectidentificationIncorrectidentificationAmbiguousidentificationSpecieslevel%Genuslevel%Specieslevel%Genuslevel%Specieslevel%Genuslevel%ITS2BLAST92.799.8007.30.2Distance90.399.7009.70.3psbA-trnHBLAST67.695.40032.44.6Distance72.896.50027.23.5ForITS2,basedonanalysisof>6600plantsamplesbelongingto4800speciesfrom753diversegeneraof193familiesin7phylaForpsbA-trnHspacer,basedonanalysisof>2000plantsamplesbelongingto1433speciesfrom551diversegeneraof135familiesin4phylaTheITS2locusisafavorableuniversalbarcodeandpossessesaperfectprospectinauthenticatingspeciesusedforawidesetofplanttaxa.ThepsbA-trnHspacermaybeacomplementarybarcodetobeused.ShilinChen*etalPLoSONE2010,5(1):e8613IdentificationefficiencyforITS2andpsbA-trnHlociusingdifferentmethods第6页/共42页课题组首次提出并验证ITS2条形码，引起国际广泛关注

国际期刊PLoSONE关注药用植物DNA条形码。该文提出ITS2序列为药用植物通用的条形码序列，为陆地植物DNA条形码序列筛选提出了新的视角，由此引起同行的关注和讨论。被德国专业网站选为近25年来在ITS2领域最受关注的16篇文章之一http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/该文发表后3年引文319次第7页/共42页

Relativedistributionofinter-specificdivergencebetweencongenericspeciesandintra-specificvariationforfourloci.Thetwobarsineachboxrepresentinter-specific(above)andintra-specific(below)geneticdistances.IdentificationofthefamilyRosaceaeW+W-RelativeRanks,n,PvalueResultITS2matKW+=703,W-=0,n=37,P≤1.139×10-7ITS2>matKITS2rbcLW+=703,W-=0,n=37,P≤1.137×10-7ITS2>rbcLITS2rpoC1W+=703,W-=0,n=37,P≤1.133×10-7ITS2>rpoC1matKrbcLW+=620,W-=46,n=36,P≤6.479×10-6matK>rbcLmatKrpoC1W+=655,W-=11,n=36,P≤4.174×10-7matK>rpoC1rbcLrpoC1W+=359,W-=106,n=30,P≤0.009rbcL>rpoC1Wilcoxonsigned-ranktestsofinter-specificdivergenceamongloci.ITS2andrbcL,matK,rpoC1werecompared.For54samplesfrom43speciesin19diversegenera,thesuccessfulidentificationratewithITS2was100%,followedbymatK(94%)andrbcL(65%).

For1410samplesfrom893speciesin96genera

No.ofgenera(≥2species):47(1351samples)

No.ofspecies(≥2samples):297(814samples)

IdentificationratewithITS2was100%and78%at

genusandspecieslevel,respectively.XPang,ShilinChen*.Cladistics,2011,27第8页/共42页ComparativeanalysisofalargedatasetindicatesthatITSshouldbeincorporatedintothecorebarcodeforseedplants

ChinaPlantBOLGroup,LiDezhuetal.,PNAS,2011WethereforeproposethatITS/ITS2shouldbeincorporatedintothecorebarcodeforseedplants.(建议ITS/ITS2应成为种子植物的核心条形码)IncaseswhereitisdifficulttoamplifyanddirectlysequenceITSinitsentirety,justusingITS2isausefulback-upasitiseasiertoamplifyandsequencethissubsetofthemarker.(ITS难以扩增和测序时，ITS2可以有效地弥补该缺陷)第9页/共42页首次验证ITS2为药用植物鉴定通用条形码通过研究比较psbA-trnH,matK,rbcL,rpoC1,ycf5,ITS2和

ITS等七个候选DNA条形码，发现ITS2是最佳条形码序列ITS2长度约230bp，易于扩增和测序，物种鉴定能力强，适合中药材等存在DNA降解材料的鉴定人参、西洋参、羌活、宽叶羌活DNA条形码鉴定方法正在纳入国家药典第10页/共42页冬虫夏草混伪品及近缘种人造伪品：滇紫菀冬虫夏草及其混伪品/近缘种背景：分布范围狭窄，生态环境脆弱，资源蕴藏量有限（产量每年80-100吨）；

市场产不足销，价格已超黄金(Guo,2012)

混伪品泛滥，如古尼虫草，蛹虫草，人造伪品滇紫菀等

样品：冬虫夏草与13种混伪品及近缘种，冬虫夏草采自四川、青海、西藏等主产区

185

条ITS/ITS2序列

(冬虫夏草样品53份，伪品45份，GenBank序列87条)A：正品：冬虫夏草B：伪品：亚香棒虫草/古尼虫草C：人造伪品：滇紫菀D：伪品凉山虫草E：伪品：蝉花F：伪品：下垂虫草G：伪品：Cordycepsrobertsii（新西兰）结果：基于BLAST/DISTANCE的鉴定效率：100%基于NJtree的鉴定结果：所有的冬虫夏草序列单独聚为一支，

并能与所有的混伪品及近缘种区分开XiangLi,ChenShilinetal.FEMSMicrobiologyLetters,2013

DNA条形码鉴定冬虫夏草及其伪品第11页/共42页IdentificationofLyciumbarbarumanditscloselyrelatedspeciesusingITS2barcodeFoodResInt.2013,

Fig.1ComparisonofLyciumbarbarumandL.chinensecollectedfromdifferentprovinceinChina57

medicinalmaterialssamplesFig.2TheNJtreeofLyciumbarbarumanditscloselyrelatedspeciesconstructedwiththeITS2sequences.Thebootstrapscores(1000replicates)areshown(≥50%)foreachbranch.Theinter/intra-specificdivergence(Table1),NJ-tree(Fig.2),andthevariablesites(Fig.3)demonstratedthattheITS2barcodecandistinguishLyciiFructusanditsadulterantsaccuratelyandswiftly.ITS2DNAbarcoderepresentsanewtechniquefordifferentiatingLyciiFructusfromitsadulterants,thusguaranteeingclinicaldrugsafetyandensuringthevitalinterestsofpatients.Fig.3VariablesitesinthehaplotypesofthethreeLyciumspeciesTable1Analysisofinter/intra-specificdivergenceinITS2barcodeofthethreeLyciumspecies

mean±SD(range)Averageinterspecificdistance0.0535±0.0114(0.0269-0.0892)Averageintraspecificdistance0.0043±0.0064(0.0000-0.0844)IntraspecificdistancesofL.barbarum0.0038±0.0041(0.0000-0.0132)IntraspecificdistancesofL.chinense0.0085±0.0133(0.0000-0.0386)IntraspecificdistancesofL.ruthenicum0.0458±0.0263(0.0000-0.0844)第12页/共42页

Morphologicalcharacteristicsofthepowder,decoctionpieces,seed,seedling,andfibreamongtheP.ginseng,P.quinquefolius,Pnotoginsenganditscloselyrelatedspeciesaresimilar.Itisdifficulttoidentifysomanydifferentpanaxspeciesandginsengproduceinmedicinalusesbytraditionalclassificationmethods.UsingDNAbarcodetoidentifypanaxmedicinalspecies人参类及其混伪品的鉴定第13页/共42页14

15101520253035404550SN01:p.ginseng;SN03:p.quinquefolius显示人参、西洋参ITS2序列的SNPs位点信息。Position32and43为区别人参和西洋参的SNPs位点为验证该方法准确性，我们下载了GenBank所有人参、西洋参ITS2序列，表明两个SNPs位点稳定存在样品来源：采集了主产区吉林，辽宁，黑龙江，北京，山东,加拿大及上海和香港药市人参西洋参样品共计72份应用ITS2序列两个SNPs可以快速准确鉴别人参西洋参，所得组合为C-T，则确定为人参，所得组合为T-C，则确定为西洋参ITS2sequenceposition1-50ofp.ginsengandp.quinquefolius

方法结果结论基于ITS2条形码鉴定人参和西洋参XCChenGENE,2013

AFastSNPIdentificationofMedicinalPanaxSpeciesBasedonDNABarcodingAnalysis,

第14页/共42页15金银花药材及其混伪品的ITS2条形码鉴定金银花（忍冬）山银花（红腺忍冬）山银花（黄褐毛忍冬）山银花（灰毡毛忍冬）研究对象：包括24份金银花药材。M:marker1、26:阴性对照(CK)2-25:金银花27-47：混伪品DNA提取：取金银花药材约25mg，利用植物基因组DNA提取试剂盒(TiangenBiotechCo.,China)提取总DNA。ITS2序列PCR扩增程序及电泳图94℃变性5min94℃变性30sec58℃退火30sec72℃延伸45sec72℃延伸10min40个循环BLAST鉴定第15页/共42页常用中药材进行了DNA条形码研究课题组已经进行DNA条形码研究的常用中药材包括：人参，西洋参，三七，大黄，石斛，重楼，金银花，丹参，天南星，红豆蔻，肉苁蓉，京大戟，麻黄，高良姜，何首乌，吴茱萸，连翘，甘草，玉竹，冬虫夏草，羌活等第16页/共42页

创建ITS2为主体条形码的中草药鉴定体系研究一万余份药材样本（涉及数千个基原物种）70余篇相关文章发表于Cladistics、PLoSONE、PNAS、BMCEvolBiol、中国科学等杂志出版《中药DNA条形码分子鉴定》人民卫生出版社起草中国药典中药材DNA条形码分子鉴定指导原则，已获准纳入国家药典建立中药DNA条形码分子鉴定标准流程第17页/共42页《中国药典》中药材DNA条形码分子鉴定指导原则第18页/共42页建立中药材DNA条形码鉴定系统网站第19页/共42页

DNAbarcodesystemshowsstrongabilitiesinidentifyingherbcrypticspeciesBLASTPROCESS打开网址，进入中药材DNA条形码鉴定系统主页点击物种鉴定，选择植物类药材鉴定（ITS2/ITS）进入右图界面。第20页/共42页在空白处粘贴入需要校对的序列（Query）点击左下角的提交比对序列相似性信息100.0%为人参，说明该序列鉴定结果为人参Quick-and-easyDNAidentificationofherbsisunderway第21页/共42页华润三九中药材DNA条形码鉴定专用软件第22页/共42页2023/3/14第23页/共42页

七叶皂苷注射剂娑罗子药材的基原植物为七叶树Aesculus

chinensis、浙江七叶树Aesculus

chinensisvar.chekiangensis和天师栗Aesculus

wilsonii娑罗子药材DNA条形码鉴定1.材料

七叶树属10个物种42份样本采自云南、四川、陕西、湖北、浙江和北京的各个分布区域结论七叶树属候列扩增效率与测序成功率均为100%，并且物种鉴定效率最高，为95.4%，更适用于七叶树属的鉴定分析。psbA-trnH序列的种间差异最大，在区分物种上具有优势。基于psbA-trnH序列构建的NJ树，可准确鉴别其各个基原物种。七叶树属植物psbA-trnH序列比对变异位点图正品第24页/共42页

IdentificationofCortexHerbsSunZY,ChenSL*.JNatMed.2012.Theidentificationefficiencyof51samplesbelongingto19kindsof

cortexherbsinChinesePharmacopoeia

examinedwas100%usingITS2sequenceasDNAbarcode.ApplytheITS2barcodetoauthenticate

medicinalmaterials皮类药材的条形码鉴定第25页/共42页条羌N.franchetii大头羌N.franchetii蚕羌N.incisumPhylogenetictreeconstructedwiththeITS/ITS2sequencesadulterantsITSITS231medicinalmaterialssamplesStabilityandAccuracyoftheIdentificationusingITS/ITS2barcodes

(Notopterygii)羌活药材ITS/ITS2条形码鉴定及其稳定性与准确性研究TheNJtreesshowedthatQianghuoanditsadulterantscanbeeasilydifferentiatedaccordingtotheirmonophyly..ITSITS2HaplotypeVariablesitesHaplotypeVariablesitesN.incisum4433N.franchetii61045XinTChenS*,etal.ActaPharmSin.2012,8第26页/共42页UseofthepotentialDNAbarcodeITS2toidentifyherbalmaterials全草类DNA条形码鉴定

TheITS2barcodecoulddistinguishsuccessfullyallthe34herbsfromtheir111adulterants.Figure1.Thepresence/absenceofbarcodegapsbetweenherbsandtheiradulterants.

PangXH,ChenSL*etal.JNatMed.2012第27页/共42页

案例1：为侦破谋杀案提供了关键物证北京市公安局内保局刑警支队发来感谢信DNA条形码应用案例◆司法鉴定◆生物多样性保护◆得到中国中央电视台、北京电视台、新华网等媒体的广泛关注中央电视台《走近科学》2010-08-08Trichosantheskirilowii

案例2：墓地里的“人参”第28页/共42页柴胡Chaihu正品：为伞形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.、狭叶柴胡B.scorzonerifoliumWilld.的干燥根。近缘种：同属植物丽江柴胡B.rockii，小叶黑柴胡B.smithiivar.parvifolium，抱茎柴胡B.longicaulevar.amplexicaule，细茎有柄柴胡B.petiolulatumvar.tenerum和窄竹叶柴胡B.marginatumvar.stenophyllum。（三）柴胡与其近缘种的NJ树图所示：柴胡正品基原柴胡与狭叶柴胡均独立聚为一支，与其混伪品可以区别开。结果表明：基于ITS2序列能很好的区分柴胡及其近缘种（一）柴胡及其及其近缘物种ITS2序列的二级结构：（二）柴胡与其混伪品ITS2序列间存在较多变异位点柴胡不同基原ITS2条形码consensus序列柴胡ITS2序列峰图第29页/共42页

PublishedpapersonDNAbarcodeCladistics,2011,27:BMCEvol.Biol.,2010,10:324

PLoSONE,2010,5:e13102.ChinaPlantBOLGroup.PNAS,2011,108(49)FEMSMicrobiologyLetters,2013

PLoSONE,2012,7(5):e35146.JingyuanSong,ShilinChen*.PLoSONE,2012,7(8),PLoSONE,2010,5:e8613第30页/共42页在googlescholar中搜索DNAbarcode共2万条前3篇有1篇是中国发表前20篇有4篇是陈课题组DNABarcoding:ahotresearchtopic第31页/共42页中药材DNA条形码分子鉴定体系受到国内外广泛关注

国家药典委员会、国家科技部、国家濒危物种进出口管理办公室等立项研究德国、英国、美国同行对中国条形码研究给予高度肯定中国食品药品检定研究院、中国检验检疫科学研究院、国家公安部物证鉴定中心等不同系统均投入人员与资金深圳华润三九、武汉爱民制药、牡丹江友搏药业、成都新荷花药业、广东王老吉等20余家企业转让应用举办四次条形码高级研修班全国18省72家单位200人参加培训第32页/共42页AsmallDNAbarcode,agiantleapfortaxonomyandspeciesidentification

条形码一小段物种鉴定一大步AccordingtoNASAITS2:theSecondInternalTranscribedSpacerITS2:Mini-barcode第33页/共42页突破传统分子标记内在鉴定能力瓶颈，绕开核基因组的高复杂度，开发种群水平的、物种特异鉴定标记

平台技术的建立具有典型的示范效应，可推广到所有多基源和多产地用药的中药品种提出“利用叶绿体基因组进行中药材道性鉴别”的学术假设中药鉴定学与叶绿体基因组学的有机结合第34页/共42页High-throughputsequencingofcompletechloroplastgenomes