非粮淀粉免蒸煮酒精发酵工艺的基础技术研究

第一章绪论第二章传统酒精发酵工艺研究2.1淀粉液化工艺2.1.1α-淀粉酶活测定l)酶活定义lg固体酶在70℃即为1个酶活力单位以U·g-1表示。2)试剂配制a.碘原液:称取碘11g，碘化钾22g于200mL烧杯中，加少量蒸馏水溶解，再移入500mL棕色容量瓶中加水定容至刻度。b.稀碘液:取碘原液1.00mL，碘化钾10g，加水定容至250mL；试剂随配随用。c.2%淀粉液:称取烘至恒重的可溶性淀粉5g，移入250mL烧杯，用少量蒸馏水调匀，用100mL沸水冲入250mL烧杯中，再加热煮沸至透明为止，冷却，加水定容至250mL，配制后在室温保存条件下不超过48h。d.磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲溶液(pH=6.0):称取磷酸氢二钠45.23g、柠檬酸8.57g，用水溶解并定容至1000mL，配好后用pH计校正。3)酶活测定称取酶1~2g，先用少量pH=6.0的磷酸缓冲液溶解，并用玻棒捣研，将上清液小心倒入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此研磨3~4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀，通过4层纱布过滤，滤液供测定使用。取20mL2%的可溶性淀粉和5mLpH=6.0的磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液，放于25mm×200mm大试管中，在的酶液0.5mL，立即记录时间。充分摇匀，定时用滴管取出反应液0.5mL，滴于预先充满比色稀碘液的白磁板空穴内。当颜色反应由紫色逐渐变为红棕色时，即为反应终点，并记录时间。4)酶活计算(取20mL2％的可溶性淀粉和5mLpH=5．5的磷酸氢二钠．柠檬酸缓冲液，放于25mmx20mm大试管中，在50℃恒温水浴中预热10min，然后加稀释好的酶液1．0mL，立即记录时间，准确反应5min。立即吸取反应液1.0mL加入到5mL稀碘液中，以稀碘液作空白，在660nm波长下比色，迅速测定吸光度值，根据吸光度值查表，求得测试酶液的浓度(Ce)，通过公式计算出样品的酶活力。酶活计算X=Ce×式中，X——样品的酶活力(U·mL-1)；Ce一测试酶液的浓度(g·mL-1)；n—样品稀释倍数。）2.1.2液化反应终点测定测定液化反应终点(碘反应)取淀粉液化液数滴，滴加碘液进行检测。淀粉在α-淀粉酶的作用下，随着水解程度的加深，其碘色反应发生如下变化：蓝→紫→红→浅红→不显色(即碘原色)。2.1.3淀粉液化称取50.0g薯干粉，按料水比1（g）:3.0（mL）与水均匀混合于500mL的三角瓶中，盐酸调节pH到5.5~6.9，加入10U/gα—淀粉酶，0.5gCaCl2，于沸水浴中液化1h（碘液检测反应终点）。2.2淀粉糖化工艺2.2.1葡萄糖淀粉酶活测定糖化酶活力定义：1g干曲在35℃2.2.2糖化反应终点测定糖化终点测定(无水乙醇检验)取糖化液数滴，滴入无水乙醇中，看是否生成白色絮状物。若无白色絮状物生成，表明糖化比较彻底。2.2.3淀粉糖化盐酸调节淀粉液化溶液pH到4.0~4.5，自然冷却至60℃后，加入150U/g糖化酶，602.3淀粉糖化液酒精发酵2.3.1酵母培养1）菌种与培养基菌种：酿酒酵母(实验室保藏)。平板保藏及活化培养基(g/L)：蛋白胨20，酵母膏10，葡萄糖20，琼脂20。种子培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10，自然pH。(葡萄糖分开灭菌后再加入)2）种子活化方法接一环生长良好的斜面酵母至50mL/250mL的培养基中，30℃3）种子培养基的摇瓶培养法将活化后的种子液以10%的接种量接入到50mL/250mL的种子培养基中，30℃2.3.2酒精发酵盐酸调节pH到4.8~5.0，加入0.5﹪尿素，其它营养因子，（高压灭菌）。待糖化醪液冷却至30℃，加入10﹪酵母种子液和塞上发酵栓于30第三章球磨机械活化对酒精发酵的影响3.1球磨处理对淀粉颗粒性质的影响3.1.1淀粉颗粒表面形貌观察将处理后淀粉样品置于105℃为进一步研究辐照对淀粉内部分子结构的影响，将处理后的淀粉用水浸泡后再进行扫描电镜观察。具体操作过程:称取10g处理后的淀粉，加入到90mL蒸馏水中，室温下浸泡1h后离心收集沉淀物，室温晾干后按上述步骤进行颗粒形貌分析。3.1.2晶体特性测定和晶度计算3.1.3淀粉颗粒偏光性的测定3.2球磨处理对淀粉微观结构的影响3.2.1分子聚合度的影响称取淀粉样品20mg加入0.5mL无水乙醇润湿样品，加入2mol/mL的KOH溶液1mL，使样品充分溶解。加入10mL去离子水，用0.1mol/mL的HCl溶液将pH值调至6.0～7.0，加水定容至50mL。取10mL于100mL容量瓶，加入80mL去离子水和2mLI2-KI溶液(I22mg/mL和KI20mg/mL)，定容至100mL，立即混匀。用紫外分光光度计扫描，波长450～800nm。采用紫外-可见分光光度计进行扫描波长范围为450~800nm，测定最大吸收峰；淀粉是不同分子质量同系的混合物，所以表示时用平均聚合度（DP）。根据Banks[]公式⑷：⑷3.2.2分子基团的影响（1）红外光谱分析法称取约0.008g淀粉样品，与0.8g光谱纯KBr研磨均匀，105℃（2）核磁共振分析法称取约0.01g淀粉样品，溶于D2O(重水)中，置于核磁共振仪，得到相应的氢谱(1HNMR)和碳谱(13CNMR)。（3）基团含量羟基含量测定采用羟胺法(高嘉安，2001)测定羟基含量。1)羟胺试剂的配制将25.00g盐酸羟胺(分析纯)溶于蒸馏水中，加入0.5mol/LNaoH溶液100mL，加蒸馏水稀释到500mL。此溶液不稳定，过2天应重新配制。2)测定步骤称取过60目筛的淀粉样品5.000g(绝干)，放入烧杯中，加100mL蒸馏水煮沸，使淀粉完全糊化。冷却至40℃，调pH至3.2，无损地移入500mL带玻璃塞三角瓶中，精确加入60mL羟胺试剂，加塞，在40羧基含量测定参照国际标准ISO11214(1996)测定羧基含量。称取约5.00g样品，加入25mL0.lmol/LHCI溶液，搅拌20min后用多孔漏斗过滤，经蒸馏水洗至无氯离子的淀粉转至500mL烧杯中，加300mL蒸馏水，在沸水浴中加热煮沸20min，趁热以酚酞作为指示剂，用0.05mol/LNa0H标准溶液进行滴定至酚酞终点，记下消耗的体积Vl。用原淀粉作空白试样，不需抽滤和洗涤，经糊化后用碱滴定，消耗的体积为V2。根据下式计算羧基含量：3.2.3直链分子含量的影响（1）试剂及仪器：2mol/LHCl,100mL:16.716mL,37%浓HCl；无水乙醇；0.1mol/LHCl,100mL:5mL2mol/LHCl；0.1mol/LNaOH,100mL:0.4gNaOH；0.5mol/LNaOH,100mL:2gNaOH；I2-KI（碘试剂），100mL：2gKI溶于水中后，加0.2gI2。标准品：直链淀粉、支链淀粉标准品购于Fluka公司。仪器：pH计；分光光度计；分析天平；（2）步骤：标准曲线的绘制：取50mg支链淀粉标准样品，加入50ml容量瓶中，加入1mL无水乙醇润湿，再加10mL0.1MNaOH，沸水浴振荡加热10min溶解淀粉，用蒸馏水定容摇匀。用同样方法配制直链淀粉标准溶液。精确吸取标准溶液于50mL容量瓶中，按表所示比例混合：编号12345678直链淀粉/mL00.20.30.40.50.60.70.8支链淀粉/mL2.52.32.22.121.91.80直链淀粉含量/%081216202428100向各容量瓶加20mL蒸馏水，用0.1MHCL调pH值为3.0。再加入0.5mLI2-KI（碘试剂），定容摇匀，静置10min，在620nm下，测吸光度（以蒸馏水作参比溶液），绘制标准曲线。样品测定：准确称取样品100mg,加1mL无水乙醇，润湿振荡，再加10mL0.5MNaOH，沸水浴加热溶解10min，冷却后用蒸馏水定容摇匀得样品液。吸取2.5mL样品液于50mL容量瓶中，加20mL蒸馏水后用0.1MHCl调pH值为3.0，加0.5mLI2-KI，定容摇匀，静置10min。在620nm下，测吸光度。并用标准曲线计算直链淀粉含量。3.3球磨处理对淀粉理化性质的影响3.3.1颜色的影响3.3.2溶解度和膨胀度的影响精确称取淀粉1.0000g(干基，记做m)于l00mL容量瓶中，在25℃和水浴锅中预热，再加入50mL对应温度的蒸馏水，快速振荡混匀并持续30min。然后用流水快速冷却至室温，立即以3000r/min离心20min。小心将上清液倒出，取上清液水浴蒸干，于105℃出其溶解度。由离心管中膨胀淀粉的重量计算其膨胀度，溶解度和膨胀度计算公式如下:3.3.3酸度的影响称取6.0g样品，放入400mL烧杯中，加入194mL蒸馏水，搅拌使样品分散，并把烧杯置于沸水浴中，搅拌淀粉乳直至糊化在冷水浴中立即冷却到室温(大约25℃单位(张燕萍，2001)。3.3.4总糖、还原糖含量的影响1）称1g处理后淀粉样品，加蒸馏水15mL，再加6mol/L盐酸，沸水浴加热30min后，加碱中和，定容至100mL，离心，取上清液用DNS法测总糖(董晓燕，2003)。2）取处理后淀粉溶液/水解液，8000r/min下离心15min，取上清液，利用生物传感分析仪测定上清液中葡萄糖的浓度。3.3.5糊化特性的影响采用粘度计进行快速测定，用TCW软件分析。根据中华人民共和国粮食行业标准(2002)操作规程，淀粉样品含水量为14%时，样品量为3.00g，蒸馏水25.00mL。具体加温过程如下：50℃下保持1min，以12℃/min的速度上升到95℃(3.75min)；95℃下保持2.5min；以12℃3.3.6热力学特性的测定用差示量热扫描法测量不同淀粉的热特性。具体方法:用样品铝盒称取约4.