免疫组织化学免疫组化技术

免疫组织化学（免疫组化）技术运用抗原抗体的特异性结合反映来检测和定位组织或细胞中的某种化学物质的一门技术，它是免疫学和传统的组织化学相结合而形成的，这种技术称免疫组织化学（immunohistochemistryIHC）或免疫细胞化学（immunocytochemistry）。其特点是将形态学改变与功能，代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质或多肽物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚焦显微术等技术，可对被检物质进行定量分析。第一节免疫组化的发展史及应用自1941年Coons及其同事首创免疫组织化学技术以来，拌随免疫学和组织化学理论与技术的发展，免疫组织化学已发生了日新月异的变化。如下表免疫组化的发展过程年代研究者事件1941Coons实用免疫萤光技术1948Fagraeus进一步发展免疫萤光技术1970Sternberger抗体酶标技术1974Taylor证实组织中浆细胞免疫组化1975KohlerMilstein单克隆抗体技术（被成为免疫学上的一场革命，也使人类第一次获得了能按照人的意志在体外产生抗体的杂交瘤细胞）。1981HsuABC法1990至今SP法、原位杂交免疫组化技术由于免疫组化具有特异性强、灵敏度高等显著特点，且能将形态与功能研究有机的结合在一起，所以，这门技术从一诞生起就显示出了强大的生命力和广阔的应用前景，现今它已被广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域，推动了学科的发展，取得了令人瞩目的成就。免疫组织化学染色技术的应用随着大量商品化的单克隆和多可隆抗体出现，配套试剂盒的使用及方法的不断完善，使免疫组化染色已经成为医学基础研究和病理外检中应用最为广泛的技术手段之一。免疫组化可用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测，细胞属性的鉴定，淋巴细胞的免疫表型分析，细胞增殖和凋亡的研究，激素受体和耐药基因蛋白表达检测，以及细胞周期和信号转导的研究等。在病理学研究中，免疫组化技术的作用和意义更重要。以肿瘤研究为例，在免疫组化技术出现以前，对肿瘤的诊断和分类还局限于细胞水平，而引入免疫组化技术后，则使研究的深度提高到了生物化学水平、分子水平。近年来，拌随基因探针研究而兴起的核酸分子原位杂交技术也正在蓬勃发展，更使免疫组化如虎添翼，两者相得益彰，将研究推动到了基因水平。越来越多的癌基因与抗癌基因的发现不仅有助于对肿瘤发生机制的探讨，并且使肿瘤的防止，初期诊断，甚至治疗都向前迈进了一大步，为人类征服癌症代来了希望的曙光。在国外，病理诊断免疫组化开始于70年代，80年代发展至高峰，90年代已列入病理技术室常规工作。在国内，免疫组化到90年代才开始在病理诊断中逐渐普及。第二节免疫组化的基本原理基本原理：众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组织化学正是运用这一特性，即先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的抗原物质。反之亦然。由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反映部位显示出来，以期达成对组织或细胞中的未知抗原进行定性、定位甚至定量的研究。如前所述，免疫组化重要涉及免疫学和组织化学的有关理论和技术，其中关键在于制备高效的抗体，后者又重要取决于抗原的质量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。在抗体制备上，经历了从抗血清，纯化IgG到单克隆抗体，甚至发展到应用基因重组技术获得分子量较小的特异性片段。就单克隆抗体而言，它是在1975年由Kohler和Milstein建立了杂交瘤技术后才开始问世的，现已被广泛应用于研究中，它具有更好的特异性，大大地提高了免疫组化的技术水平。显示技术的发展也相称迅猛，初期只是简朴的将标记物结合在抗体上，以后则发展到将标记物结合在抗抗体上或与抗体具有特异亲和性的分子上，用于标记的物质有很多种，如荧光染料、放射性同位素、酶、胶体金等。借助于荧光显微镜、光学显微镜或电子显微镜，就可观测到这些标记物发出荧光、酶促反映产生的有色沉淀或高电子密度颗粒，从而观测到抗原抗体复合物所再的部位。由此可见，免疫组化技术以其特异性和灵敏度高等特点，又因其操作比较简便而得以广泛应用。第三节有关的免疫学理论抗原（antigen）：抗原应具有的条件：①异物性②理化性质③特异性抗原的种类：①免疫原性与免疫反映性完全抗原不完全抗原②抗原与机体的亲缘关系异种抗原同种异型抗原自身抗原③抗原的化学结构蛋白质抗原多糖抗原核酸抗原低分子量物质抗原合成多肽抗原④抗原的理化性状颗粒性抗原可溶性抗原抗原的制备：材料的准备和预解决组织的粉碎抗原的提取抗原纯化抗原纯度的检测半抗原的免疫原制备法抗体（antibody）——是机体受抗原刺激后，由B淋巴细胞，特别是浆细胞分泌产生的一种能与相应抗原发生反映的球蛋白，称免疫球蛋白（immunolobulin,Ig）,共有五类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE,重要分布在血清或外分泌物中。抗体的分子结构抗体的理化性质抗体与抗原的特异性结合抗体的种类抗体的抗原性：同种型抗体同种异型抗体独特型抗体抗体的制备方法：多克隆抗体（血清抗体）——指机体接受抗原的积极免疫或被动免疫后，从血清中分离提纯的抗体。单克隆抗体——是1975年由Kohler和Milstein发明的一种新技术。原理是将体外培养的骨髓瘤细胞与免疫细胞融合，产生杂交细胞。这种融合的杂交细胞系既有骨髓瘤细胞无限生长的能力，又有浆细胞分泌单一抗体的能力。这种免疫细胞通过纯化，成为单克隆系，就能产生大量专一的高纯度的抗体，既单克隆抗体。这一技术被称为免疫学上的一场革命，也使人类第一次获得了能按照人的意志在体外产生抗体的杂交瘤细胞。（祥见图解）单克隆抗体与多克隆的特性比较见下表:单克隆抗体与多克隆的特性比较特性单克隆抗体多克隆抗体组成特异性亲合力交叉反映单一类的抗体高，针对单一抗原决定簇不定，较低低多种类抗体的混合物低，针对多个抗原决定簇平均亲和力较高高第四节免疫组化的基本技术根据标记物（或示踪物）不同可分为以下技术：免疫荧光组化技术免疫酶组化技术亲合免疫组化技术免疫胶体金组化技术免疫铁蛋白技术尚有双重和多重标记技术等。不同的免疫组化技术，各具有独特的试剂和方法，但其基本技术方法是相似的，都涉及抗体的制备，组织材料的解决，免疫染色，对照实验，显微镜观测等环节。(一)免疫荧光组化技术基本原理根据抗原抗体反映原理，先将已知的抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体作为探针与细胞或组织内相应抗原结合，在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上具有标记的荧光素，运用荧光显微镜观测标本（荧光素受荧光显微镜激发光的照射而发出一定波长的荧光），从而可拟定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。分类直接法间接法补体法双重免疫荧光标记法直接法——用荧光标记的特异性（对细胞或组织内抗原）抗体（第一抗体）直接与标本反映（染色），以检测标本中相应的抗原。如图特点：操作简朴，特异性高，但敏感性低，且由于一种荧光标记抗体只能检测一种特异性抗原，所以应用范围较这窄。染色环节:⒈石蜡切片常规脱蜡至水。冰冻切片、涂片、印片或培养细胞等材料经适当固定。⒉必要时用酶适当消化。⒊用PH7.4PBS洗15分钟。⒋滴加经适当稀释的荧光抗体，室温或37℃孵育箱内孵育30—⒌用PBS洗3次，5分钟/次。⒍用50%甘油（用PH9.0碳酸盐缓冲液配制）封片⒎荧光显微镜下观测。间接法——此法是直接法的重要改善，先用特异性（对细胞或组织内抗原）抗体（或称第一抗体）与细胞标本反映，随后用缓冲液洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体（也称第二抗体）与结合在抗原上的抗体（是第二抗体的抗原）结合，形成抗原—抗体—荧光抗体的复合物。如图由于结合在抗原抗体复合物上的荧光抗体显著多于直接法，从而提高了敏感性。如细胞抗原上每个分子结合3～5个分子的抗体，当此抗体作为抗原时又可结合3～5个分子的荧光抗体，所以和直接法相比荧光亮度可增强3或4倍。特点：特异性强，灵敏度高，应用更广，只需要制备荧光标记的羊抗鼠或羊抗兔即可应用于多种抗体（第一抗体）的标记显示。染色环节：⒈石蜡切片常规脱蜡至水。冰冻切片、涂片、印片或培养细胞等材料经适当固定⒉必要时用酶适当消化。⒊用PH7.4PBS洗15分钟。⒋滴加经适当稀释的未标记一抗，在室温或37℃⒌用PBS洗3次，5分钟/次。⒍滴加荧光标记二抗，在室温或37℃⒎用PBS洗3次，5分钟/次。⒏用50%甘油（用PH9.0碳酸盐缓冲液配制）封片⒐荧光显微镜下观测。补体法——大多数抗原—抗体复合物都能结合补体。因此，在染色时先将新鲜补体与第一抗体混合，同时加在抗原标本切片上，经37℃孵育后，如发生特异抗原抗体反映，补体就结合在抗原抗体复合物上，再用抗补体荧光抗体与结合的补体反映，形成抗原——抗体——补体——特点：只需一种荧光抗体，可合用于各种不同种属来源的第一抗体的检测。染色环节：石蜡切片常规脱蜡至水。冰冻切片、涂片、印片或培养细胞等材料经适当固定⒉必要时用酶适当消化。⒊用PH7.4PBS洗15分钟。⒋将抗血清60℃⒌将新鲜豚鼠血清（其中具有补体）稀释10倍⒍取等量抗血清和豚鼠血清混合，滴加在切片上，将切片置37℃⒎用PBS洗3次，5分钟/次。⒏滴加经适当稀释的荧光标记抗补体抗体，在室温或37℃⒐用PBS洗3次，5分钟/次。⒑用50%甘油（用PH9.0碳酸盐缓冲液配制）封片⒒荧光显微镜下观测。4）双重免疫荧光标记法——在同一细胞组织标本上需要同时检查两种抗原时要进行双重荧光染色，一般均采用直接法。将两种荧光抗体（如抗A和抗B）以适当比例混合，加在标本上孵育后，按直接法洗去未结合的荧光抗体，抗A抗体用异硫氰酸荧光素标记，发黄绿色荧光；抗B抗体用四甲基异硫氰酸罗达明荧光素标记，发红色荧光，可以明确显示两种荧光抗原的定位。3．对照实验与荧光抗体染色结果判断（1）对照实验为了保证免疫荧光组织化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次实验（新抗体初次使用）时进行以下对照实验。免疫荧光染色的对照实对照设立直接法间接法抗补体法标本自发荧光对照★★★阳性对照★★★荧光抗体对照★★克制实验★★★补体对照★自发荧光——组织不通过荧光染色，在紫外光或短光波的照射下，所呈的荧光称自发荧光。一般自发荧光较弱，多呈蓝绿色或蓝白色，容易与特异性荧光相区别。例：胶原纤维蓝绿色弹力纤维蓝绿色软骨组织黄绿色心肌黄绿色红细胞黄色标本自发荧光对照：标本只加PBS或不加PBS，缓冲甘油封片，荧光显微镜观测应呈阴性荧光。（无与特异性荧光相似的荧光）阳性对照：将以知阳性标本用免疫荧光组化技术染色（直接法、间接法、补体法）结果应呈阳性荧光。荧光抗体对照：除不加一抗外，其他染色环节相同，染色结果呈阴性荧光。（即标本只加荧光抗体染色）克制实验：在加荧光标记抗体前或同时，加入未标记的相同抗体，染色结果呈阴性或荧光减弱。补体对照：取新鲜豚鼠血器清1：10稀释，先作用标本，洗后再用补体荧光抗体染色，结果呈阴性。（2）特异性染色应具有的条件染色只限于特异性抗原。不应被荧光素结合的非免疫血清染色。用未标记的特异性免疫血清预先解决标本，则特异性染色被克制；而用未免疫的血清预先解决，则不能克制特异性染色。假如将荧光素标记抗体一方面用相应的抗原充足吸取，则特异性染色被克制；而假如使用无关的抗原进行吸取则不能克制特异性染色。4．荧光抗体的制备荧光抗体的制备方法比较复杂，现在已有各种荧光抗体出售，所以，在这我们不讲。但大家要知道荧光色素的一些种类，以便对免疫荧光染色结果的观测和判断。目前重要常用的荧光色素有：异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）呈现黄绿色荧光四已基罗达明（terraethylrodemineB200，RB200）呈现明亮橙红色荧光四甲基异硫氰酸罗达明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）呈现橙红色4）4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸氏（SITS）呈蓝色荧光5.荧光抗体的保存以0～4℃或-206．荧光显微镜：它是由超高压光源，滤板系统（涉及激发光和压制滤板）和光学系统等重要部件组成。是运用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观测标本的荧光图像。使用注意事项：严格按照荧光显微镜出厂说明书规定进行操作，不要随意改变程序。应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压贡灯5～15分钟，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适合暗室，再开始观测标本。防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源时应带上防护眼睛。检查时间每次以1～2小时为宜，超过90分钟，超高压贡灯发光强度逐渐下降，荧光减弱，标本受紫外线照射3～5分钟后，荧光也明显减弱或退色，所以最多不超过2～3小时。荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应用电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间，灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充足冷却后才干点燃。一天中应避免数次点燃光源。标本染色后立即观测，因时间久了荧光会逐渐减弱。最佳是在稍加观测后即显微摄影。将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃载玻片厚度应为0。8～1。2毫米之间，盖玻片厚度在0。17毫米左右，标本不能太厚，因太厚会使激发光大部分消耗在标本的下部，而物镜观测到的上部不能充足激发，此外细胞重叠会影响结果判断。荧光亮度的判断标准：（质量控制和结果解释）“－”——无或可见薄弱自发荧光“＋”——仅能见明确可见荧光“＋＋”——可见明亮的荧光“＋＋＋”——可见耀眼的荧光(二)免疫酶组织化学技术（免疫酶细胞化学技术）免疫酶组织（细胞）化学是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。基本原理：先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。常用标记酶的种类：辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，AKP、ALP、AP）酸性磷酸酶（acidphosphatase，ACP）葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase，GOD）目前，用的最多的酶是HRP，AKP用于标记酶的规定：酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，所形成的产物易于光镜或电镜下观测。所形成的终产物沉淀必须稳定，即终产物不能从酶活性部位向周边组织弥散，影响组织学定位。获得的酶分子，最佳有商品出售。中性PH值时，酶应稳定，酶标记抗体后，活性不应改变，且酶的活性越高越好。酶标过程中，酶与抗体连接，不影响两者的活性。被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶其中1.,2.两点最重要。由于并非容易显示的酶均有形成不可溶性的复合物。一般认为，辣根过氧化物酶（HRP）较佳，是最常用的一种酶。酶标抗体的制备及纯化：略酶的底物及沉淀颜色：见下表酶底物沉淀颜色HRPAKPDAB（3，3--二氨基联苯胺）+H2O2AEC（3氨基--9—乙基卡巴唑）+H2O2NBT(四氮唑蓝)+5—嗅--4氯—3吲哚--磷酸盐棕色红色蓝色免疫酶技术与免疫荧光技术不同在于：①可用普通显微镜代替荧光显微镜，易于推广②切片不易退色，可长期保存③阳性细胞定位精确，较易与非特异性反映鉴别，因此判断容易，主观性少④组织结构清楚，可与HE切片对照观测⑤可作免疫电镜超微结构观测分类：直接法间接法补体法免疫酶桥法免疫酶双桥法过氧化物酶抗过氧化物酶法（PAP）双PAP法等直接法原理：用酶直接标记在特异性一抗上，与标本中的抗原结合，让酶催化底物反映产生有色产物，沉淀在抗原—抗体反映部位，即可在镜下对标本中的抗原进行检测。优点：简便，快速，特异。缺陷：敏感性差，标记一种抗体只能检测一种抗原，所以应用受限制。染色环节：切片按免疫组化常规解决0.3%H2O2甲醇。室温10～30分钟必要时，如石蜡切片用0.1%胰蛋白酶消化，37℃1∶20正常血清，室温孵育15分钟滴加适当稀释的酶标一抗，室温或37℃PBS洗3次，每次5分钟加酶的底物溶液，5～10分钟，显微镜下观测，至特异性染色清楚，背景无染色时，终止显色。苏木素衬染，脱水，透明，封片。２）间接法原理：在间接法中先用未标记的特异性一抗与标本中相应抗原结合，再用酶标记的抗球蛋白抗体（二抗）结合，然后再加酶的底物显示抗原－—抗体——抗抗体复合物存在的部位，以对抗原进行检测。优缺陷：提高了敏感性，并且用一种酶标记一种抗体就可检测多种抗原，因此较直接法使用广，但其较费时，非特异性染色较多。染色方法：⒈切片按免疫组化常规解决⒉0.3%H2O2甲醇。室温，10～30分钟⒊必要时，如石蜡切片用0.1%胰蛋白酶消化，37℃⒋1∶20正常血清，室温孵育15分钟⒌滴加适当稀释的特异性一抗于标本上，室温或37℃⒍PBS洗3次，每次5分钟⒎滴加适当稀释的酶标二抗于标本上，室温或37℃⒏PBS洗3次，每次5分钟⒐加酶的底物溶液，5～10分钟，显微镜下观测，至特异性染色清楚，背景无染色时，终止显色。⒑苏木素衬染，脱水，透明，封片。以上两种方法都是通过化学方法将酶直接标记在抗体上，所以通称为酶标抗体法。３）酶桥法在酶标记抗体过程中，酶与抗体的化学反映交联过程可影响酶的活性和抗体的效价，同时产生非特异酶标记抗体，可增长非特异性背景染色，为了避免上述缺陷，相继发展了酶桥法和PAP法。它们是以酶为抗原免疫动物，产生抗酶抗体，通过酶与抗体的特异性结合进行标记，属于非酶标记的抗体酶法。原理：先用酶作为抗原免疫动物，制备效价高，特异性强的抗酶抗体，然后以二抗为桥梁，将在组织中与抗原结合的一抗与酶抗体连接起来，再将酶结合在抗酶抗体上，经酶的底物显示出抗原的分布。如图第一抗体（假设来自种属A）孵育60分钟，37℃切片与第二抗体（桥抗，抗种属AIgG抗体）孵育1小时37℃。应用过量的桥抗体能保证一个Fab段与第一抗体结合，另一个Fab段游离。切片与抗酶抗体（来自种属A）孵育1小时37℃。因抗酶抗体和第一切片与酶（HRP）孵育30分钟，酶与抗酶抗体结合。显色优缺陷：在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了共价连接对抗体和酶活性的损害，提高方法敏感性，又能节省第一抗体的用量。但其最大的缺陷是抗酶抗体必须高度纯化。由于抗酶抗体中非特异性抗体不能与酶结合，但能与抗酶抗体竞争桥抗体的结合位点，从而减少了抗酶抗体的结合，而大幅度减少呈色能力。此外，抗酶抗体的酶结合是低亲和力的，冲洗时易丢失而减少其敏感性。染色环节：⒈切片按免疫组化常规解决⒉0.3%H2O2甲醇。室温，10～30分钟⒊必要时，如石蜡切片用0.1%胰蛋白酶消化，37℃⒋1∶20正常血清，室温孵育15分钟⒌滴加适当稀释的特异性一抗于标本上，室温或37℃⒍PBS洗3次，每次5分钟⒎加适当稀释的二抗，37℃⒏PBS洗3次，每次5～10分钟⒐加抗酶抗体，室温或37℃⒑PBS洗3次，每次5～10分钟⒒加酶溶液，37℃⒓酶的底物显色⒔衬染，脱水，透明，封片。4）PAP法原理：与酶桥法相似，都是借助桥抗体将酶连结在组织抗原结合的第一抗体上，所不同的是先将抗酶抗体与酶结合制成酶——抗酶复合物（PAP），PAP复合物中的抗酶抗体和第一抗体为同种属动物的IgG，所以桥抗体可以作为“桥”将PAP复合物连结在第一抗体上。如图PAP复合物：是离体制备的HRP抗HRP复合物，它的制备方法较多，在这不介绍。PAP复合物为五边形环状结构，这种结构极为稳定，冲洗时酶分子不会脱落，从而大大提高了PAP法的灵敏度，约比免疫荧光法敏感100～1000倍。比酶桥法灵敏20倍。优缺陷：灵敏度高，PAP背景染色低，但制备较复杂。染色环节：⒈切片按免疫组化常规解决⒉0.3%H2O2甲醇。室温，10～30分钟⒊必要时，如石蜡切片用0.1%胰蛋白酶消化，37℃⒋1∶20正常血清，室温孵育15分钟⒌滴加适当稀释的特异性一抗于标本上，室温或37℃⒍PBS洗3次，每次5分钟⒎加适当稀释的二抗，37℃⒏PBS洗3次，每次5～10分钟⒐加PAP复合物，室温或37℃⒑PBS洗3次，每次5～10分钟⒒酶的底物显色⒓衬染，脱水，透明，封片。5）双PAP法：原理：在PAP法的基础上反复滴加1次二抗和PAP复合物，结果使抗原抗体复合物上结合比PAP法更多的酶分子，从而更进一步增强了敏感性。双PAP法连结机理尚不清楚，也许是第一次PAP中还留有未完全结合的位点。优缺陷：双PAP法比PAP法更敏感，但环节较多，费时较长，故不常用。（三）免疫胶体金技术1971年，Faulk和Taylor一方面报道应用免疫胶体金技术研究细胞表面抗原的分布，从此开创了免疫组织化学研究的新领域，即免疫金技术（immunogoldtechnique）。免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白）等作为探针，就能对组织或细胞内抗原进行定性、定位、甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金自身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观测。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观测。胶体金的概念：胶体金是指由直径为1～100nm范围内的金颗粒所组成的分散系，即金以或大或小的微小粒子分散在另一种物质中所形成的体系。通常所说的胶体金是指以微小的粒子分散在水中所形成的金溶胶。胶体金的理化性质颜色：与粒子的大小有关，如15nm的胶体金为红色，而95nm的胶体金则为蓝色。一般用于免疫组化的胶体金颗粒直径范围在5～60nm，均呈红色，但颗粒越小，红色越深。稳定性：胶体金可以在相称的时间内保持其溶胶不变。胶体金的稳定性受多种因素的影响，其中最重要的是电解质，另一方面还与浓度、温度等有关。电解质：少量的电解质对胶体金的稳定性有促进作用，但过量的电解质常导致稳定性破坏而使胶体金凝聚。胶体金浓度：浓度越高，金颗粒之间的距离越近，容易导致金颗粒的凝聚。温度：一般情况下，温度对胶体金的稳定性影响不大，但长时间加热会使胶体金的稳定性稍有下降。大分子物质：大分子物质对胶体金的稳定性影响比较复杂，在一定条件下，加入大分子物质可以使胶体金的稳定性大大加强，对抗某些影响胶体金稳定因素的作用，如高浓度的电解质等。带电性：胶体金属憎水性胶体，金颗粒周边包围了大量吸附离子所形成的静电层，带负电，可在电场中泳动。3）胶体金的制备：可用多种方法制备胶体金，其中应用最多的是化学还原法。基本原理：是在氯化金水溶液中加入一定量的还原剂，使金离子还原为金原子。常用的还原剂有柠檬酸钠，鞣酸和白磷。其中，柠檬酸钠还原制备的金颗粒直径较大，为15～150nm，白磷还原制备的金颗粒直径较小，为3～12nm。4）胶体金探针的制备略5）免疫胶体金染色方法：免疫金法免疫金银法免疫金法（immunogoldstaining，IGS）免疫金法可分为直接法和间接法两种。一般多采用间接法。直接法——将胶体金标记的一抗直接对标本进行染色，然后在光镜或电镜下进行观测。这种方法非常简朴，但由于一种探针只能研究一种抗原，所以比较受局限。用胶体金标记的单克隆探针，进行双重或多重染色效果比较好。间接法——是指先将未标记的特异性一抗与标本中的抗原结合，然后用金标的二抗与一抗结合，在光镜或电镜下对抗原的分布进行定位研究。染色环节：（以人肝组织HbsAg的定位为例）⒈石蜡切片、脱蜡至水⒉1%胰蛋白酶消化10分钟⒊用双蒸馏水洗5分钟×2⒋用TBSPH8。2洗5分钟×2⒌1%卵蛋白（EA）封闭10分钟⒍稀释鼠抗HBsAg单克隆抗体，37℃1～2h,4⒎TBSPH8。2洗10分钟×2⒏1%EA封闭10分钟⒐TBSPH8。2稀释兔抗鼠金标记抗体37℃⒑TBSPH8。2洗10分钟×2⒒双蒸馏水洗5分钟×2⒓10%戊二醛，10分钟⒔双蒸馏水洗5分钟⒕苏木素衬染核，甘油封片结果：在镜下可见部分肝细胞浆内有金颗粒聚集呈红色，沿细胞膜分布，表白有HBsAg定位在细胞浆内。免疫金银法（immunogoldsliverstaining，IGSS）基本原理：1983年Holgate等人将IGH与银显影方法相结合立。通过免疫反映沉淀在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用对苯二酚还原剂将银离（Ag﹢）子还原成银原子（Ag0）。被还原的银原子于是围绕金颗粒形成一个“银壳”，“银壳”一旦形成自身也具有催化作用，从而使更多银离子还原并促使银壳越长越大，最终抗原位置得到清楚放大。染色环节：⒈石蜡切片、脱蜡至水⒉lugol液，5min⒊5%硫代硫酸钠水溶液脱碘5min⒋双蒸馏水冲洗干净⒌TBSPH7.4洗5min×2⒍1%胰蛋白酶消化10min⒎用TBSPH7.4洗5min×2⒏1%卵蛋白（EA）封闭10min⒐稀释鼠抗HBsAg单克隆抗体，37℃孵育1～2h或4⒑TBSPH7.4洗5min×2⒒1%卵蛋白（EA）封闭10min⒓TBSPH7.4稀释兔抗鼠金标记抗体37℃⒔TBSPH7.4洗5min×2⒕双蒸馏水洗5min×2⒖物理显影⒗双蒸馏水洗5min×2⒘苏木素衬染核⒙脱水、透明、封片结果：光镜下见肝细胞胞浆内有膜状或包涵体形分布的阳性黑色状颗粒，背景干净。显影液配方：乳酸银显影液的配制10%阿拉伯胶水溶液60ml柠檬酸缓冲液PH3.510ml对苯二酚1g，加双蒸水20ml溶解乳酸银水溶液（100mg加水10ml）以上四液临用前依次混合、暗处显影硝酸银显影液的配制10%阿拉伯胶水溶液60ml柠檬酸缓冲液PH3.510ml对苯二酚1.7g，加双蒸水30ml溶解硝酸银40mg，溶于蒸馏水2ml以上四液临用前依次混合、暗处显影6）免疫胶体金技术的特点胶体金制备简朴制备胶体金所需设备和试剂均易得到，制备方法也简朴、快速标记简朴抗体等生物大分子很容易通过界面物理吸附作用，与胶体颗粒相结合形成稳定的金标复合物。由于标记过程中不需要通过任何化学反映过程，因此标记后生物大分子的生物学活性仍基本保持不变。敏感性高电镜下，金颗粒的电子密度高，界线清楚，即使是单个的金颗粒也容易辨别。因此免疫金电镜的检出率远远超过免疫酶组织化学反映产物DAB，大大提高了免疫组织化学技术在电镜水平的分辨率。光镜下，金颗粒经银显影后得到放大，用于检测组织细胞抗原时，其敏感性也高于其他方法。特异性强免疫金探针的非特异性吸附作用很小，较少受组织标本背景因素的影响，在抗原抗体检测中显示出高度的特异性。定位准确由于金颗粒电子密度高，特性明显，呈散在颗粒，不存在酶反映扩散等缺陷，因此免疫金技术定位准确。适应性广胶体金既能用于普通光镜观测，也能用于透射电镜，扫描电镜，荧光显微镜观测。标本能长期保存。易于双重和多重标记通过控制条件可制备不同直径的胶体金颗粒，将不同直径的胶体金颗粒分别标记不同的抗体和抗原，可以在一张切片上同时区分两种或两种以上抗原或抗体的分布，因而特别合用于电镜水平的双重或多重标（四）亲和免疫组化技术——亲和组织化学（affinityhistochemistry）就是运用一些物质之间的高度亲特性，将酶等标记物连接到抗原抗体复合物上，以对体内的抗原（抗体）进行检测。事实上抗原抗体反映本质上也属于亲和组化这一范畴，只是近代免疫组化方法的更新更突出了亲和这一组化技术的特点。（由于抗原抗体的结合事实上是由于两者之间具有高度的亲和性）具有高度亲和的物质除了抗原——抗体，尚有植物凝集素——糖类，生物素——抗生物素，葡萄球菌A蛋白——IgG，阳离子——阴离子，激素——受体等。下面以生物素——抗生物素为例生物素（维生素H，biotin）是一种分子量244Da小分子维生素。抗生物素（卵白素，avidin）是一种糖蛋白，分子量为68KDa，由四个亚单位组成。生物素与抗生物素有很强的亲和力，两者一旦结合就很难解离。同时，生物素具有与酶和抗体结合的能力，这样抗生物素分子与多个生物素结合，生物素又可大量结合酶标记物，起到多级放大作用，因而敏感性强。举例：ABC法（生物素—抗生物素—过氧化物酶复合技术，avidin-biotin-complextechnique）基本原理：运用上述生物素与抗生物素的特性，先将生物素与辣根过氧化物酶（HRP）结合，形成生物素化的辣根过氧化物酶，然后与抗生物素按一定比例混合，形成ABC复合物，用生物素化的二抗与一抗结合再与ABC复合物结合，最后用底物显色。如图优点：①敏感性高ABC法与PAP法比较要高20～40倍，这是由于生物素与抗生物素间有极强的结合力，抗生物素同生物素结合有四个结合位点，一部分同生物素化的过氧化物酶结合，另一部分同生物素标记的抗体结合。在ABC反映中，抗生物素作为桥连接与生物素标记的酶和生物素标记的抗体之间，而生物素标记的过氧化物酶分子又可作为桥连接于生物素分子之间，于是形成一个具有三个以上过氧化物酶分子（大于PAP复和物）的网络状复合物，敏感性极大提高。②特异性强，背景染色淡③方法简便，节约时间④由于生物素与抗生物素具有与多种示踪物结合的能力，可用于双重或多重免疫染色。染色环节：⒈石蜡切片脱蜡至水⒉PBS冲洗，5分钟×3次⒊0.3%过氧化氢（H2O2）甲醇溶液，20～30分钟⒋PBS冲洗，5分钟×3次⒌1%胰蛋白酶消化⒍PBS冲洗，5分钟×3次⒎正常血清孵育，30分钟⒏滴加第一抗体（特异性抗体），孵育60分钟⒐PBS冲洗，5分钟×3次⒑滴加第二抗体，孵育60分钟⒒PBS冲洗，5分钟×3次⒓滴加第三抗体（ABC复合物），孵育60分钟⒔PBS冲洗，5分钟×3次⒕DAB显色⒖自来水冲洗，复染，脱水，透明，封片SP法：目前广泛使用的亲和免疫组化法是SP法（链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶连结法）。基本原理：用链霉菌抗生物素蛋白代替ABC复合物中卵白素（抗生物素）即形成SP法。链霉菌抗生物素蛋白是从链霉菌培养物中提取的蛋白，它和亲和素（抗生物素）同样，也存有四个生物素结合点，亲和力很高（比卵白素蛋白亲和力更高），因此比ABC法更敏感。染色环节：同ABC法国外其他公司也将SP法注册为LSAB法，SABC法。二步法：之所以称做二步法是由于它是用抗体和酶形成的聚合物来代替传统“三步法”（ABC法、LSAB法或SP法）中的二抗和酶聚合物。由于省略了一种试剂和相应的操作环节，加上这种技术可以使背景染色非常干净，传统方法中的血清封闭也可去除，使得这种方法变得更加快速和易于使用。此技术的关键是在一条稳定的氨基酸骨架上将多个辣根过氧化物酶分子和抗体的Fab段（抗原结合片段）结合在一起形成多聚物。这种聚合物中的Fab段对一抗具有很强的亲和性，而多个HRP分子提供很高的灵敏度。此法之所以背景更加干净，不仅仅是由于它较少地使用了基于蛋白质的试剂，更重要的是它不含生物素和链霉卵白素，并且使用的只是抗体的抗原结合片段，这就意味着可以完全避免内源性生物素和抗体的Fc段也许导致的背景染色。第五节免疫组化染色过程中的基本技术免疫组化染色的基本原理就是抗原抗体的特异性结合。虽然染色方法有多种类型，但染色过程中都须要采用一些基本的技术方法，以增强抗原抗体特异性反映，减少或消除非特异性反映，使染色结果达成最佳效果。1、抗原修复：蛋白酶消化技术1%胰蛋白酶0．4%胃蛋白酶微波解决高压高温解决电饭煲、铝锅解决2、非特异性染色的控制正常血清作用0.3%～3%的双氧水溶液3、对照实验免疫组化染色的环节较多，因此影响染色结果的环节也很多。为了对染色结果作出对的的判断，染色中，特别是在定位一种新的抗原或建立一种新的免疫组化方法时，有必要设立阳性对照和阴性对照。用已知抗原为阳性的标本与待检测标本同时进行免疫组化染色，并呈阳性反映者为阳性对照。反之，如用拟定不含已知抗原的标本作为对照，染色结果为阴性者称阴性对照。除此以外，空白、替代、吸取和克制实验等也是属阴性对照。当染色结果所显示的是阳性对照片呈阳性，阴性对照呈阴性时，表白被检测切片的标记结果可靠。免疫组化对照实验及结果判断标本号检测标本阳性对照阴性对照替代抗体对照结论1++--受检标本含抗原2-+--受检标本不含抗3----操作错误4++++非特异性反映5++-+非特异性反映6+---阳性对照差阳性对照——用已知抗原为阳性的标本与待检测标本同时进行免疫组化染色，并呈阳性反映称阳性对照。阴性对照——确认不含已知抗原的标本作对照，染色结果为阴性者称阴性对照。空白对照、替代对照、吸取对照和克制实验也属阴性对照。空白对照：用免去第一抗体或用缓冲液替代第一抗体，染色结果为（—）。替代对照：用相同稀释制备的第一抗体的动物免疫前血清来替代第一抗体，染色结果为（—）。吸取对照：用过量的已知相应的纯化抗原与第一抗体反映，抗体结合点所有与抗原结合，这种被抗原吸取的抗体不能再与组织中的抗原反映，染色结果为（—）。克制实验：待检标本先与未标记的特异性抗体反映后再与标记的特异抗体进行染色，结果明显减弱或转阴性。一般替代对照、吸取对照、克制实验重要用于证实某抗体的特异性。在病理科的平常诊断工作及科研课题时，只要设阴性对照和阳性对照，一般不必设吸取对照和克制对照。4、抗体的分装、稀释、滴加及保存5、孵育方法及时间6、切片的洗涤7、显色8、衬染9、切片的脱水、透明、封片10、染色结果的判断细胞膜着色：例细胞核着色：例细胞浆着色：例细胞间质着色：例第六节免疫组织化学的基本技术免疫组化的染色方法虽有很多类型，但有关染色的基本技术却是相同的。它既有一般病理切片染色的基本规定，也涉及于抗原抗体特异性反映有关的特殊规定。因此，免疫组织化学染色是一种涉及多学科的综合性技术。（一）取材实验动物、人体组织细胞和体外培养细胞都可作为免疫组化研究的材料。对于所取材料不仅要保持组织细胞形态的完整，并且还要使抗原的抗原性不被破坏，一利于抗原抗体的结合。因此，在取材时规定做到准确、迅速、完整和具有代表性，以免因取材不妥导致抗原丢失或破坏，从而影响实验结果的对的性。⒈实验动物实验动物种类很多，以狗、兔、大鼠和小鼠等为常用。取材前先常规麻醉或将动物快速处死，迅速取材。注意取材用的剪刀和刀片等要，所取材料不应太大，以厚度不超过3mm为宜。在取小型实验动物材料时，如先经左心室积极脉灌注固定，使灌注液迅速到达全身，则固定更加充足。灌注固定期先用小量生理盐水快速将血液冲洗干净，紧接着用4%多聚甲醛灌注，灌注速度先快后慢。⒉人体材料在病理诊断和研究中，通过活检和手术切除的标本，以及通过各种方法所收集的细胞（如脱落细胞、血细胞）等都可用于免疫组织化学研究。对于尸体解剖标本则要视具体情况而定。假如是死亡时间过长的标本，由于组织发生自溶，抗原已变性或弥散、消失，染色结果不一定能反映其实际情况。因此，尸体解剖标本应尽早取材固定，以免对研究结果导致影响。活检标本的取材活检标本的取材于体表、空腔脏器的内壁或一些实质性器官，如：皮肤、口腔、鼻咽、喉、胃、肾和肝等。取材常用活检钳钳取，所取材料较小，并常因挤压而变形。因此，在取材时应注意：①规定活检钳的刀口锋利，以减少对组织的挤压；②所取的部位要具有代表性，特别是病变部位较大时。手术切除标本的取材应根据标本的大小采用相应的取材方法。对于小标本的解决，可先在固定液内固定一会儿，再修切成适宜大小继续固定。对于大标本的解决，鉴于抗原在组织中分布的差异，因此，所取材料要涉及以下几个部位：①重要病灶；②病灶与正常组织交界处；③病灶周边的正常组织。细胞标本的取材印片法即将载玻片轻贴于暴露的病变区，使脱落细胞粘附在玻片上，经固定后即可用于染色。此法优点是简便省时，细胞抗原也保存较好，缺陷是细胞分布不均，甚至细胞重叠在一起，影响染色结果。重要合用于活检和手术切除标本。穿刺涂片法用穿刺针抽取病变区液体成分，直接或经离心后制成细胞悬液涂于载玻片上，固定、染色。此法重要应用于实质性器官细胞的采集，如淋巴结、肝、肾、肺等。体液细胞的制备制备细胞成分较多的体液标本时，如血液、淋巴液、精液等，取少量液体直接涂片即可。对于细胞成分较少体液，如腹水、胸水、脑脊液等，方法之一是先用离心沉淀法使细胞浓缩，制成细胞悬液，然后涂片；方法之二是用细胞离心涂片器直接涂片。3．体外培养细胞标本的制备培养细胞标本的制备应根据所培养的生物学特性采用不同的方法。对于贴壁生长的细胞，如内皮细胞、成纤维细胞、神经胶质瘤细胞等，可在培养瓶或培养板的底壁放置载玻片，让细胞在其上生长，届时将载玻片取出进行固定染色即可。对于悬浮生长的细胞则可采用离心沉淀涂片的方法。为充足保存组织中的抗原，对所取标本应立即固定包埋。假如暂时不固定则应在低温下保存备用。可保存在干冰、液氮或低温冰箱中。（二）固定固定的目的在于保持组织的形态和结构的完整，并尽量保存组织中的抗原，使其不被破坏或扩散，以减少非特异性染色或假阳性、假阴性结果。假如固定不及时或固定不妥，都可使组织结构不清楚或特异性抗原不显示，使结果无法判断。由于不同抗原其稳定性不同，不同固定剂的性能也各异，因此，研究者有必要了解所要研究抗原的化学性质，并根据需要选择适当的固定剂和固定方法。选择固定方法的原则是在保持组织形态完好和被检测抗原的前提下，应采用浓度最低的固定剂和最短的固定期间。固定期间一般为1～2h。常用固定剂醛类固定剂属双功能交联固定剂，其作用是使组织之间互相交联，将抗原保存在原位。此类固定剂的特点是对组织的穿透性强，收缩性小。常用的有甲醛、多聚甲醛和戊二醛，可单种或多种固定剂联合使用。甲醛缓冲液：4%多聚甲醛磷酸缓冲液：戊二醛——多聚甲醛磷酸缓冲液：Bouin液：PLP液（过碘酸——赖氨酸——多聚甲醛固定液）丙酮及醇类固定剂丙酮和醇类的固定原理重要是使组织中的蛋白质和糖沉淀。此类固定剂的穿透力强，对抗原保存较好，但对小分子蛋白质及多肽等物质的保存效果较差。常与其他固定剂，如冰醋酸、乙醚和氯仿等混合使用。AAA液：Clzrke改良液：Carnoy液：丙酮：其他固定剂Zenker液：碳二亚酰胺——戊二醛液：四氧化鹅（鹅酸）液：固定注意事项固定液的选择用于免疫组化的固定剂种类很多，究竟如何选择，应根据理论与反复的实践来决定。选择最佳固定剂的标准是