2011年评估gw汇整服务单位第四军医唐都医院神经内科

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original1thesusceptibilityofextraocularmuscleinmyasthenia1figuresandkey1欲投稿期1统一1投稿11摘实验的第一部分利用乙酰胆碱受体单克隆抗体Mab35杂交瘤细胞株抗体。为了获得大量诱发腹水并用硫酸铵盐析法纯化腹水中的抗体，并用SDS蛋白电泳鉴定纯度和Lorry’s法测定含量。因为Mab35可与型乙酰胆碱受体的α1、3、5亚单位结合，用提纯的抗体作一抗与具有1型乙酰胆碱受体的TE671细胞和具有α3、5型乙酰胆碱受体的大鼠脑片进行免疫组化反应。结果提示的抗体符合Mab35的特点，可以用于建立重症肌无力动物模型。实验的第二部分建立了重症肌无力转移动物模型。按照文献方法将Mab35注射于动物腹腔并维持48小时，在SD大鼠等多种品系上成功建立模型，出现和重症肌无力相似的临床症状，后，选择SD大鼠和F344大鼠用于后续研究。发现模型动物出现了眼部症状，并且眼外肌出现了一些病理改变。HE染色后肌细胞出现核以：重症肌无力，眼外肌，神经肌肉接头，转移重症肌无力模Myastheniagravis;extraocularmuscle;neuromuscular;passivelytransferredmyastheniagravis前碱受体(AChR)，导致该处乙酰胆碱传递，引起全身多种骨骼肌无力[1]。临床研究发现，70%-90%MG15%MG患者肌无力症状仅局限于眼外肌。此外，眼肌型MG患者症状波动大,对常规治疗不敏感,血中自身抗体滴度相对较低[2]Grave’s病,眼外肌也往往首先受累[3]。这些都提示，自70年代从MG患者血中检测到AChRAb后，逐渐发现MG患者神经肌肉接头处的病理改AChRMGMGAChRAb的病理作用机制、AChRAbNMJAChRMGMGMG患者最常见的眼外肌无力机制虽有既往研究表明，不同于其它骨骼肌，眼外肌中有胚胎型AChR的表达[4]。然而，后续研究并不能证实这种胚胎型AChR成为特殊的免疫靶点而引起重症肌无力患者的眼外肌受累症状。眼肌型MG患者血浆中没有针对胚胎型AChR的抗体，T细胞免疫被证实不具备胚胎型AChR特异性[5]。另一方面，利用胚胎型AChR及其抗体用主动或免疫的方法也无法引致实验动物的重症肌无力症状。还有研究发现，在一些非免疫机制介导的疾病中，如性重症肌无力，波特中NMJ终板安全系数（safetyfactor）[8]使其更加容易受累呢？HughesBW,MoroDeCasillasML,KaminskiHJ.Pathophysiologyofmyastheniagravis[J].SeminNeurol.2004;24(1):21-30.KaminskiHJ，RuffR.Ocularmuscleinvolvementbymyastheniagravis[J].AnnNeurol1997;41:419-KaminskiHJ,LiZ,Ri ondsC,RuffRL,KusnerL.Susceptibilityofoculartissuestoautoimmunediseases[J].AnnNYAcadSci.2003;998:362-374.KaminskiHJ,KusnerLL,BlockCH.Expressionofacetylcholinereceptorisoformsatextraocularmuscleendtes[J].InvestOphthalmolVisSci1996;37:345-51.WangZY,Diethelm-OkitaB,OkitaDK,KaminskiHJ,HowardJF,Conti-FineBM.Tcellrecognitionofmuscleacetylcholinereceptorinocularmyastheniagravis[J].JNeuroimmunol.2000;108(1):29-39.StahlJ,Averbuch-erL,RemlerBF,LeighRJ.Clinicalevidenceofextraocularmusclefiber-typespecificityofbotulinumtoxin[J].Neurology1998;51:1093-1099.KaminskiHJ,al-HakimM,LeighRJ,KatirjiMB,RuffRL.ExtraocularmusclesaresparedinadvancedDuchennedystrophy[J].AnnNeurol.1992;32(4):586-8.WoodS,SlaterC.Thecontributionofpostsynapticfoldstothesafetyfactorforneuromusculartransmissioninratfast-andslow-twitchmuscles[J].JPhysiol1997;500:165-176.备注：KaminskiHJ一直作眼外肌易感机制研究，可能有新文献。但他偏重于眼外肌与补体超净工作 苏州净化设备 超速低温离心 Eppendof公 DU530紫外分光光度计 CM1900恒冷箱切片机 Leica公司 TIB175ATCCTE671细胞株：伦敦神经病理馈赠，本室保存。鼠：购自本校实验动物中心并在SPF饲养。 GIBCO胎牛GIBCO公小牛GIBCO公 硫酸 西安化学试剂 考马斯亮 化学试剂 多聚西安化学试剂厂FITC标记羊抗小鼠IgG Sigma公司生物素标记羊抗小鼠IgG Sigma公司ABC复合物 Sigma公司完全培养液：含10%胎牛的DMEM160g1.2.1腹挑选雌性6周龄健康鼠，腹腔注射无菌降植烷0.3ml，1周后腹腔注射1×106处于对数生长期的TIB175杂交瘤细胞，接种7-10天后可产生腹水。密切观察鼠健康情况和腹水征象，待腹水尽腹水4℃3000rpm离心10min,去除杂质。在冰浴中缓慢滴加腹水等体积饱和硫酸铵溶液，按照50%30min。41小时后，4℃14000rpm20min收集上清。再次冰浴中缓慢滴加饱和硫酸铵溶液，按照40%硫酸铵浓度行盐析30min。4℃静置1小时后，14000rpm离心20min40%硫酸铵盐析步骤，最后收集沉淀并用腹水等体积的0.02MPBS冲溶沉淀置于蛋白透析袋中，4℃换液透析48小时后分装冻存。Lorry’s法检测蛋白含量，SDS准备用4%多聚固定后的TE671细胞爬片和大鼠皮层脑片，用透析后样品作一抗行免疫组用标准蛋白对照后，紫外分光光度计测OD280计算腹水中所提蛋白含量约为15.21mg/ml。15%SDSKD25KDGel-Protein97%1.3.1nAChRTE671nAChR的大鼠脑片均出现阳性免疫反应，说明所的抗体为AChR单抗MAb35，可与α1、α3、α5结合。脑片中阳性神经元位置也符合脑内胆碱能神经元分布。（图1.3.2）

图1.3.1提纯后蛋白样品的SDS电泳分析 ysisofpurifiedproteinsamplebySDS:Purifiedproteinsample2:ProteinmarkerTE671细胞 大鼠脑片1.3.2TE671Fig1.3.2ImmunoreactionofpurifiedantibodyonTE671cellandratbrain海神号肌电图 WellscanMK2酶标 Labsystems Nova超薄切片机 LKB瑞典 10-12SD大鼠、Wistar大鼠、BALB\CC57\BL65只，购自本校实验动物中心。5只雌性10周龄F344大鼠购自斯莱克实验动物。 本室 注射用新斯的 信谊制药 多聚西安化学试剂厂戊二 西安化学试剂生物素标记羊抗小鼠IgG Sigma公司四甲基联苯 西安化学试剂Ringer’s液：140mMNaCl,5.4mMKCl,1mMCaCl,2.4mMNaHCO3，Ph7.4电镜固定液：0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)配制,其中含有4%多聚、0.25%戊二醛15%饱和PTMG320.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg注射含mAb35的Ringer’s液1ml，对照组每只仅注射Ringer’s液1ml。饲养环境相同，每日给予12小时光照。6h12h测量体重。肌力根据文献所用的国际标准以它们抓握、悬吊和行走的情况予以分级[9]：1级，3-5次抓握和悬吊实验后肌力减弱；2级，后肢不完全瘫痪；3级，后肢瘫痪不能站立；4级，垂死状态；5级，。体重资料用SPSS软件进行重复测量的方差分析进行统计，肌力资料行t检验进行分析。PTMGAChRAb滴度的检每12小时从鼠尾采血并分离，用AChRAb酶标板行ELISA检测。具体步骤是：每孔加入各组100μl4℃过夜；洗涤后加入生物素标记羊抗小鼠IgG室温作用2h；洗涤后加入ABC复合物室温作用2h；DAB显色10min，同时终止后用酶标仪在470nm波长下测定吸光度值，设立空48PTMG分别注射抗胆碱酯酶抑制剂新斯的明和非去极化肌松药仙林观察动物症状，新斯的明给药剂量为0.02mg/kg，仙林给药剂量为0.05mg/kg。1min10.1mv的电刺激共记录10个波形，用第5波对第一波的电位变化百分比D5表示衰减值。NMJ模型建立48h后按40mg/kg注射戊巴比妥钠腹腔麻醉后，经灌注100ml生理盐水后再以含40g/L多聚和1g/L戊二醛的磷酸盐缓冲液灌注固定30min，迅速取下胫前肌并在含25g/L戊二醛的后固定液中固定2h，按常规电镜脱水、包埋程序制成超薄切片，行透射电镜观察NMJ。PoulasK.,TsouloufisT.,TzartosSJ.Treatmentofpassivelytransferredexperimentalautoimmunemyastheniagravisusingpapain[J].ClinExpImmunol,2000(120)：363-368.实验组BALB/C小鼠无任何症状，实验组其他鼠种都出现不同程度的肌无力症状，Wistar大鼠症状相对较轻。F344、SDC57BL/66h开始出现活动减少，毛皱，精神差，摄食减少。F344、SD大鼠较C57BL/6小鼠肌无力症状更为明显，这两种大鼠从12h起体重开始下降，24-48h症状迅速加重，其症状轻重与发展速度与注射剂量呈正相关。其中F344最为敏感，体重下降非常明显，率高，全部死于呼吸肌麻痹。SD大鼠体重下降程度较F344轻，但24h后也迅速加重，率较F344低。对照组无明显无力症状。以下为部分观察结果。图为实验组和对照组SD大鼠，实验组PTMG呈现出运动减少，精神萎靡，低头弓背，竖毛气短，四肢无法站立，趾蜷缩外撇的典型PTMG姿态[10]。Lennon,V.,Lindstrom,J.,andSeybold,M.E.,Experimentalautoimmunemyasthenia(EAMG):Amodelofmyastheniagravisinratsandguineapigs[J].J.Exp.Med，1975;141:1365–1375.SDMGPremkumarChristadoss,MathildePoussin,andCaishuDeng.Shortyticalreview:animalmodelsofmyastheniagravis[J].ClinicalImmunology,2000;94(2):75–87. SD大鼠PTMGFigDifferentgesturebetweenPTMGandcontrolofSD48C57BL/6小鼠的肌力变化曲线。可见实验组动物在48小时内肌无力症状逐渐加重，其中以F344和SD大鼠肌无力症状最明显。5ClinicalClinical3210 C57BL/6FigClinicalcourseondifferenttimepointofthreestrainsofratsandC57BL/6miceinExp2.3.1F344F3442.3.1F344大鼠各处理组体重变化的比较（xTab2.3.1ComparisonofweightchangebetweenexperimentalgroupsandcontrolgroupsinF344ConExp Exp *p=0.000<0.01comparedwithcontrol用重复测量资料的方差分析方法检验：实验组和对照组比较差异显著,F=341.548p=0.000<0.01Thedifferencebetweentheexperimentalgroupandcontrolgroupwasfoundtobestatisticallysignificantprovedbymultivariatetests:F=341.548，p=0.000<0.01.PTMGAChRAb滴度的检从注射后12h起，所有实验组动物中均可检测到AChRAb，滴度水平与注射剂量呈正相关。就每一AChRAb而言，48h内其滴度变化不大无统计学意义。实验组同样注射剂量的各品系AChRAb滴度之间无明显差别，而对照组酶标检测都为AChRAb。酶标检测证实了实验组接种抗体是成功的，动物中的外源性AChRAb可以与酶标板上的AChR抗生免疫结合反应PTMG症状甚至导致。图2.3.3为实验组SD大鼠和C57BL/6小鼠注射仙林后肌无力加重的表现（鼠图左为注射仙林的PTMG，图右为未注射仙林的PTMG）：动物肌无力症状加重，几乎四肢瘫痪，肌张力极低，呼吸浅快，瞳孔散大，有时甚至迅速，与临MG患者的肌无力危象极为 2.3.3SD大鼠和C57BL/6Fig2.3.3effectofvecuroniumbromideonSDratandC57BL/6miceinExp实验组三种大鼠均出现明显波幅递减，D515-55%D510%2.3.4为两只SD大鼠的波幅改变。 2.3.4Fig2.3.4DecrementalresponsesonmuscleevokedpotentialsbyrepetitivenervestimulationinSDNMJ电镜观察发现实验组PTMG胫前肌NMJ突触后膜变平坦，突触数目减少，分级数减少且PTMGNMJMG患者相似的病理改变，如图2.3.5所示。 2.3.5实验组和对照组NMJ的超微结构（N为神经末梢，MFig2.3.5TheultrastructureofNMJinexperimentalandcontrolMAb35SDF344、C57/BL6上成功PTMG模型，其临床症状、药理学特点、电生理特点和超微结构变化均与MG患者相似。由于本研究的是研究眼外肌的易感性，大鼠较小鼠易于取材操作，在下面实验中选用SDF344大鼠作实验对象。为了降低48h内PTMG率，MAb35注射剂量确定为0.25mg/kg。（本部分结果已于：刘睿,一,。用AChR单抗建立大鼠重症肌无力转移模型三PTMGEOMMGPTMG模型类似MG患者的全身型，所以有必要确定在这种PTMG模型上EOM是否也被累及。 Leica公司CM1900恒冷箱切片机 Leica公司BX60显微镜 OLYMPUS Nova超薄切片机 LKB瑞典JEM100SX透射电镜 10-12SD2010F34440只，购自 本室多聚西安化学试剂戊二 西安化学试剂TRIzo博星博星dNTPCy5-dCTPCy3-dCTP博星博星反转录酶博星DT 博星Ringer’s液：140mMNaCl,5.4mMKCl,1mMCaCl,2.4mMNaHCO3，Ph7.4Harris苏木精：苏木精1g，无水10ml，混合溶解完全。硫酸铬钾20g，溶于200ml蒸馏水。混合两液并加入HgO1g。伊红染液：伊红1g，95%100mlSDH孵育液：0.2M50ml，0.2M50ml100mg。硫酸镍胺醋酸缓冲液：硫酸镍胺5g，0.2M醋酸缓冲液100ml。DAB加强显色液：DAB15mg100ml0.01MKPBS100ml硫酸镍胺醋酸缓冲液混合后，加入2μl过氧化氢。4%多聚固定液：多聚4g，0.1mol/LPB100ml电镜固定液：0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)配制,其中含有4%多聚、0.25%戊二醛15%饱和PTMGSDF3442.2.1PTMG，48h后开48h内观察所有大鼠眼球运动情况以及眼部其他伴随症状。48h后断头处死迅速取下眼外肌并称立即称湿重，用SPSS软件作t检验统计处理。HEEOM选择症状较重的实验组和对照组SD大鼠各3只，经1%戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉后,经心脏依次灌注生理盐水150mL,4%多聚固定液500mL，取EOM后按常规方法梯度脱水、石蜡包埋，用石蜡切片机切5μm切片贴于明胶片上按常规方法行HE染色，显微镜下观SDHEOM选择实验组和对照组SD大鼠各3只，经1%戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉后,经心脏迅速灌注生理盐水150mL,迅速取下EOM后投入液氮保存，用恒冷箱切片机切25μm新鲜切片贴于SDH1h4%多聚固定液后固定30min。常规脱水透明封片，显微镜下观察。各选取10个视野并统计两组EOM各型肌纤维的数量。EOMNMJ1戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉后,150mL4%多聚固定液500mL，取出EOM后蔗糖置换至组织沉底，恒冷箱切片机切25μm冰冻切片。α-BuTx-Biotin室温孵育过夜，0.01MKPBS洗三次，ABC复合物室温下孵育3h，0.01MKPBS洗三次，DAB加强法显色。EOMNMJ选择实验组和对照组SD大鼠各1只，经1%戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉后,经心脏灌150mL500mLEOM2h50μm,25蔗糖浸泡2h,磷酸盐缓冲液，0.5%锇酸中后固定1h,经梯度脱水和环氧丙烷置换后做平板F344大鼠EOM差异的分用0.1%DEPC浸泡取材器械和所有用具，37°过夜后180°干烤过夜。MAb35注射48h后断头处死所有实验组和对照组F344大鼠。用DEPC处理后的器械迅速取下EOM并置于液氮保存。用Trizol裂解一步法分别提取各组细胞总RNA。用OligotexmRNAMidiKit(Qiagen公司)纯化mRNA，参照Schena等的方法[50]逆转录标记cDNA探针并纯化。用Cy3-dUTP标记对照组，Cy5-dUTP标记实验组。实验所用为大鼠表达谱（BioStarR-40S），上包含靶以及参照cDNA4000GeneralScanningScanArray3000扫描，用Imagene3.0软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值。经过内参照的标准化，以Cy5/Cy3值大于2或小于0.5和Cy5、Cy3值皆大于800作为判断差异表达的条件。EOMPTMGPTMG大鼠的眼球活动确有减少，PTMGPTMG大鼠，出现不同程度的眼球内陷充血现象,甚至睑裂有血性分泌物。图显示PTMG大鼠的眼部症状。EOMSPSStEOM湿重下降，与对照组相比有统计学意义。其中F344组间差异t=13.89，p<0.05；SD组间差异t=18.59，p<0.05。图显示两组大鼠EOM湿重的变化。PTMG的眼部症状（箭头所示FigEyesymptominPTMG(showedbyConGroupExpConGroupExp0RatFigComparisonofEOMWeightamongdifferent图HEEOMEOMHE染色发现，PTMGEOM肌组织有轻度萎缩征象，表现为肌细胞核。肌细胞周围间质有较多淋巴细胞浸润，泪腺中尤为明显。如图3.3.2所示。 3.3.2EOMHEFig3.3.2ComparisonofHEstaininEOMslicesbetweentwoSDHEOM琥珀酸脱氢酶（SDH）SDH染色可将骨骼肌纤维分为三种类型[51]。如图3.3.3所示：Ⅰ型肌纤维又称红肌纤维，直径最细，SDH染色呈强阳性，染成蓝黑色，颗粒密集，境界不清，性质上属于慢收缩耐疲劳肌纤维，ATP酶活性低而线粒体酶丰富，代谢类型为氧化型；ⅡA型肌纤维直径较粗，SDH染色呈阳性，染成蓝色，颗粒细小稀疏，性质上属于快收缩耐疲劳肌纤维，兼有高ATP酶活性和线粒体酶活性，相当于氧化型和酵解型的双重型；ⅡB型肌纤维又叫做白肌纤维，染色呈弱阳性，直径最粗，染成淡蓝 3.3.3各型肌纤维的SDH染色Fig3.3.3SDHstaininginvarioustypesofmuscle5ImageJ3.3.3，EOM各型肌纤维比例差异显著，Ⅰ型纤维比例下降，ⅡA3.3.3两处理组EOMTab3.3.3ComparisonofproportionofvarioustypesofmusclefibersinEOMbetweentwotreated各型肌纤维 Ⅰ ⅡB 合 Ⅰ ⅡB 合对照 实验 *p=0.000<0.01，**p=0.000<0.01，comparedwithcontrol用χ2检验：实验组和对照组比较差异显著,总χ2=44.485，p=0.000。其中*χ2=25.625，*p=0.000；**χ2**p=0.000；***χ2=2.312，***p=0.128Thedifferencebetweentheexperimentalgroupandcontrolgroupwasfoundtobestatisticallysignificantprovedbychi-square:=25.625，*p=0.000；**χ2=36.444，**p=0.000；***χ2=2.312，***pEOMNMJ利用α-BuTxAChRNMJnAChR，镜下观察发现，PTMGAChRPTMGNMJnAChR3.3.4箭头所

3.3.4实验组和对照组眼外肌NMJ的AChRFig3.3.5TheAChRofneuromuscularjunctioninEOMofexperimentalandcontrolEOMNMJPTMGNMJ突触皱折短缩，数量减少，突触间隙略增宽，证实了本研究的PTMG模型EOM的NMJ处也发生了MG患者相似的病理改变，证实了在这种类似全身型MG的动物模型上眼外肌也被累及。如图3.3.5所示。 3.3.5实验组和对照组眼外肌NMJ的超微结构,N为神经末梢，MFig3.3.5TheultrastructureofneuromuscularjunctioninEOMofexperimentalandcontrolgroup:Nrepresenttheneuronaxonterminal,Mrepresentthemusclecell,thearrowsrepresentthecleftbetweenthem.(500nm比较两组EOM的表达差F344RNA1％RNA3.3.628s、18s、5s三条带清晰完整无降解，符合RNA提取要求。（注：1、1’为实验组4、4’28s18s3.3.6总RNAFig3.3.6GelelectrophoresisofthetotalRNAofeach用大鼠表达谱（BioStarR-40S）杂交后扫描，用Imagene3.0软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值。经过内参照的标准化，以Cy5/Cy3值大于2或小于0.5和Cy5、Cy3值皆大于800作为判断差异表达的条件。分析后F344大鼠实验组眼外肌与对照组眼外肌出现差异表达，其中在出现明显差异表达的54条中，25条上调，29条下调。部分差异表达及相关主要功能见下页表3.3.6（备注：所列为有明确意义的，原始数据见原始数据4——表3.3.6）。3.3.6PTMG大鼠EOMTab3.3.6SomegenesdifferentiallyexpressedinEOMof结论：证实PTMG模型上EOM确实已被累及，不仅存在肌无力症状，也具备MG特征病理改 编码蛋 相关功

Tax丝氨酸/骨髓分化首要反应酪蛋白激酶Ⅱalpha1多肽辅酶Q6蛋白醛缩酶6信号转导分子帽蛋白alpha3Cappa3)alpha-1蛋白酶抑制剂1

PTMG模型上EOM已证实受累，那么受累的EOM与其他受累骨骼肌有无区别呢？接下EOM、膈肌和胫前肌进行比较研究。CM1900恒冷箱切片 Leica公BX60显微 振动切片 Nova超薄切片 LKB瑞 CJEOL东10-12SD16 本室多聚西安化学试剂 琥珀酸 化学试剂 FLUCA公司 TexasRed- Ringer’s液：140mMNaCl,5.4mMKCl,1mMCaCl,2.4mMNaHCO3,Ph7.4SDH孵育液：0.2M琥珀酸钠５0ml，0.2M磷酸盐缓冲液50ml，氯化硝基四氮唑兰100mg。AChE孵育液：硫代乙酰胆碱碘化物5mg，0.1M柠檬酸钠0.5ml，5mM铁化钾1ml，30mM1ml1ml，0.1MPBS6.5mlDAB显色液：DAB15mg100ml0.01MKPBS200mg40mg，葡萄糖氧化酶1mg。4%多聚固定液：多聚4g，0.1mol/LPB100ml电镜固定液：0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)配制,其中含有4%多聚、0.25%戊二醛15%饱和免疫电镜固定液：0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)配制,其中含有4%多聚、0.05%戊二醛和15%饱和。PTMGSD5mg/kgMAb35的Ringer’s液1ml，对照组每只仅注射Ringer’s液1ml。饲养环境相同，每日给予12小时光照。48h后开始以下实验内容。SD31%戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉后,经心脏迅150mLEOM25μm新鲜切片贴于明胶片上。按照文献方法将切片置于SDH孵育液中室温下孵育1h，蒸馏水迅速洗涤三次后，用4%多聚固定液后固定30min。常规脱水透明封片，显微镜下观察。各选取10个AChESD31戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉后,经心脏依次灌注生理盐水150mL,4%多聚固定液500mL，取EOM和膈肌、胫前肌后再固定2h,放入2524h25μm切片贴于明胶片上按常规方法[49]AChE染色，显微镜下观察NMJ并统计。NMJ选取多聚灌注后三种肌肉的冰冻切片，α-BuTx-Biotin室温孵育过夜，0.01MKPBS洗三次，TexasRed-avidinFITC-avidin3h，0.01MKPBS洗三次，甘油封片后荧光显微镜下观察并在同条件下图像。NMJ选择实验组和对照组SD大鼠各1只，经1%戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉后,经心脏灌150mL500mL2h50μm,切片放入25%蔗糖浸泡2h,磷酸盐缓冲液,0.5%锇酸中后固定1h,经梯度脱水和环氧丙烷置换后做NMJ免疫电镜固定液灌注动物后，取三种肌肉后固定2h后，做50μm振动切片，α-BuTx-Biotin室温孵育过夜，0.01MKPBS洗三次，ABC3h，0.01MKPBS洗三次，DAB棕色法显色。切片放入25%蔗糖浸泡2h,磷酸盐缓冲液,0.5%锇酸中后固定1h,经梯度脱水104.3.1。所有肌肉实验组Ⅰ型纤维比例下降，EOM的Ⅰ型纤维比例相对较高。4.3.1Tab4.3.1Comparisonofproportionofthreetypesofmusclefibersinmusclesindifferent各型肌纤维 组 ⅡAⅡBⅡB对照组 实验组 对照组膈 实验组膈 对照组胫前 实验组胫前 用χ2每种肌肉两组间各型肌纤维比例的比较：EOM两组各型肌纤维比例之间有显著差异，总χ2=95.387，p=0.000=50.202，Ap=0.000；Bχ2=78.031，Bp=0.000；Cχ2=8.668，Cp=0.003；膈肌两组各型肌纤维比例之间有显著差异，总χ2=107.691，p=0.000。其中Dχ2=70.968，Dp=0.000；Eχ2=68.226，Ep=0.000；Fχ2=11.964，Fp=0.001；胫前肌两组各型肌纤维比例之间有显著差异，总χ2=22.751，p=0.000。其中Gχ2=13.273，Gp=0.000；Hχ2=16.452，Hp=0.000；Iχ2=3.089，Ip=0.079。对照组三种肌肉各型肌纤维比例的两两比较：EOM和膈肌之间差异显著，χ2=91.873，p=0.000；EOM和胫前肌之间差异显著，χ2=93.581，p=0.000；膈肌和胫前肌之间无统计学差异，χ2=0.190，p=0.909。实验组三种肌肉各型肌纤维比例的两两比较：EOM和膈肌之间差异显著，χ2=135.637，p=0.000；EOM和胫前肌之间差异显著，χ2=38.333，p=0.000；膈肌和胫前肌之间差异显著，χ2=25.946，p=0.000。AChEAChE染色所示的NMJ呈棕褐色，形状为扁平或扁圆形，贴在肌纤维的边缘，其大小反映NMJ的大小，灰度反映NMJ处AChE的浓度。比较发现：实验组肌肉切片的NMJ处NMJ面积缩小，以膈肌和胫前肌为著，AChE4.3.2所示。（A为对照组眼外肌；B为实验组眼外肌；C为对照组膈肌；D为实验组膈肌；E为对照组胫前肌；F为实验组胫前肌。）4.3.2各组三种肌肉的AChE染色Fig4.3.2AChEstaininginthreekindsofmuscleslicesindifferentAChENMJ灰度以及面积的统计结果。可见实验组和对照组NMJ处AChE灰度值无显著差异，三种肌肉之间灰度值也没有统计学差异。但是，实验组NMJNMJ面积较眼外肌和胫前肌略大，实验组三种肌肉的NMJ面积无明显统计学差异。NMJ处AChE染色灰度的比较（xTabComparisonofgrayvalueinNMJbyAChEstaininthreetypesofmusclesindifferent对照组实验组28.23±2.3237.88±13.2128.70±15.75用tAt=1.525Ap=0.166，Bt=0.056**p=0.384表NMJ像素面积的比较（xTabComparisonofpixelareasinNMJofthreetypesofmusclesindifferent对照组实验组898.20±67.83908.00±211.381008.80±207.51用t检验：每种肌肉实验组和对照组NMJAt=5.401Ap=0.001，Bt=8.677Cp=0.008NMJ面积之间有显著差异，*F=25.547，*p=0.000p=0.421，膈肌与眼外肌比较p=0.000、膈肌与胫前肌比较p=0.000；实验组三种NMJ面积之间无显著差异，**F=0.609，**p=0.560。表NMJα-BuTx结合的AChR在肌纤维边缘的NMJ处发出荧光，其荧光像素密度可反映AChRAChR的分布范围。比较发现：实验组所有肌肉切片的荧光面4.3.3所示。（A为对照组眼外肌；B为实验组眼外肌；C为对照组膈肌；D为实验组膈肌；E为对照组胫前肌；F为实验组胫前肌。）4.3.3NMJ处Fig4.3.3AChRmarkedbyBuTxinNMJofthreekindsofmusclesindifferent分别为α-BuTxAChR的荧光灰度以及面积的统计结果。可见实验组NMJAChREOMAChR荧光灰度值有统计学差异。此外，实验组NMJ面积却较对照组有不同程度的缩小。对照组眼外肌AChR分布面积较膈肌和胫前肌小，实验组三种肌肉AChR分布面积无明显统计学差异。NMJ处AChR荧光灰度的比较（xTabComparisonofgrayvalueofAChRinNMJinthreetypesofmusclesofdifferent对照组实验组40.29±4.8447.81±5.3345.10±7.01用t检验：三种肌肉实验组和对照组之间AChR荧光灰度值有显著差异，其中At=9.385，Ap=0.000，Bt=9.786，Bp=0.000，Ct=8.602Cp=0.000。对照组三种肌肉灰度之间有显著差异，*F=7.757，*p=0.001p=0.020，眼外肌与胫前肌比较p=0.000，膈肌与胫前肌比较p=0.145；实验组三种肌肉AChR荧光灰度之间有显著差异，**F=6.465，**p=0.004，其中眼外肌与膈肌比较p=0.001，眼外肌与胫前肌比较p=0.028，膈肌与胫前肌比较p=0.208。表NMJ处AChR荧光像素面积的比较（xTabComparisonofpixelareasofAChRinNMJofthreetypesofmusclesindifferent对照组实验组1229.67±419.891379.47±413.241293.87±295.22用t检验：每种肌肉实验组和对照组NMJAChR分布面积有显著差异，其中At=2.394Ap=0.007，Bt=3.216Ct=5.241Cp=0.000。对照组三种肌肉AChR面积之间有显著差异，*F=6.418，*p=0.004，其中眼外肌与膈肌比较p=0.033，眼外肌与胫前肌比较p=0.001，膈肌与胫前肌比较p=0.187；实验组三种肌肉AChR面积之间无显著差异，**F=0.585，**p=0.000。表NMJ透射电镜观察三种肌肉NMJ的超微结构变化可见：三种肌肉NMJ处突触分级均明显减少，明显短缩变直，突触后膜变得平坦。其中，EOM的NMJ突触数目最少，分级最少，4.3.3所示。（A为对照组眼外肌；B为实验组眼外肌；C为对照组膈肌；D为实验组膈肌；E为对照组胫前肌；F为实验组胫前肌。）4.3.4各组三种肌肉NMJ的超微结构（N为神经末梢，MFig4.3.4TheultrastructureofNMJinthreekindsofmusclesindifferentNMJBuTx标记的AChR在NMJ处为突触后膜上表面的高电子密度物质，实验组三种肌肉的NMJ处突触膜结构破坏，其上的AChR数量也减少。其中，实验组和对照组EOM的AChR数4.3.5所示。（A为对照组眼外肌；B为实验组眼外肌；C为对照组膈肌；D为实验组膈肌；E为对照组胫前肌；F为实验组胫前肌。）4.3.5各组三种肌肉NMJBuTx标记的AChR超微结构（Fig4.3.5TheultrastructureofAChRmarkedbyBuTxinNMJofthreekindsofmusclesindifferent高，ⅡA双重型快收缩耐疲劳纤维比例略低，ⅡB酵解型快收缩易疲劳纤维比例近似。而三种肌肉各型肌纤维中，皆以ⅡB快收缩易疲劳纤维比例最高，其次为ⅡA双重型快收缩耐疲劳纤维，Ⅰ型慢收缩耐疲劳纤维最少，符合骨骼肌以快速收缩为主的生理特点。因此，根据对照组EOM和其它两种肌肉的比较，可以认为虽然EOM的Ⅰ型和ⅡA比例与膈肌、胫前肌有所不同，但由于ⅡB型维的存在，EOM的耐疲劳性还会增加。PTMG三种肌肉的SDH染色发现，EOM、膈肌和胫前肌的Ⅰ型纤维比例都不同程度下降，ⅡA型纤维比例上升，ⅡB型没有共同变化。这样的结果说明，在NMJ传递情况下引起的骨骼肌无力，主要是由于氧化型耐疲劳纤维比例的下降，也可以说Ⅰ型肌纤维是MG肌无力的易感纤维。酶多的Ⅰ型纤维转变为含琥珀酸脱氢酶少的ⅡA纤维，所以ⅡA纤维比例有所增加。并且，PTMG上三种骨骼肌的各型纤维比例也有显著差异，膈肌和胫前肌的Ⅰ型纤维比EOM更少。这种情况可能是由于EOM正常时的Ⅰ型比例相对较高，也可能与各种骨骼肌受负荷程度不同有关，例如临床上虽然EOM常为首发症状，但MG患者致命的原因却常由于呼吸肌衰竭所致。总之，SDH染色提示EOM的肌纤维比例和代谢特点与其它骨骼肌有所不同，在MG发病时由于其Ⅰ型纤维比例较高AChE阳性部位的统计结果表明，PTMGAChE阳性区域面积都缩小，灰度无显著变化。由于AChE主要存在于NMJ的突触间隙基膜上，说明在PTMG发病后，各种骨骼肌的突触间隙面积即基膜面积是缩小的，但突触间隙中的AChE密度没有明显改变。NMJ传递受累程度的近似。分析α-BuTxAChR所发出荧光的灰度和面积发现，PTMGAChR荧光灰度值和分布面积都较对照组减小，说明NMJ处AChR总体数量的下降。然而，无论实验组还是对照组，EOM的AChR灰度均比其它两种骨骼肌略低，说明EOM的AChR密度是低于其它骨骼肌的，PTMG之病后尤为明显。对比AChR荧光面积发现，对照组EOM的荧光面积均显著低于膈肌和胫前肌，实验组三种骨骼肌无显著差异。既往研究认为AChR大多集聚在NMJ的突触后膜中，尤其是二级突触最多，因此单位面积上的长度常能反映其上电压依赖性钠通道和AChR的数量[11]。观察发现，大多EOM的NMJ结构较其它两种骨骼肌更为简单，反映在突触数目较少，分级很少，长度也更短。PTMG发病后突触后膜只偶见极少的短缩突触，突触后膜几近平坦。 同。EOM的易感性主要反映在以下方面：EOM正常时慢收缩耐疲劳肌纤维比例高，但这种氧化型肌纤维却是肌无力发生后主要累及的对象；EOMNMJ突触前膜与突触后膜接触的基膜面积虽然与其它骨骼肌近似，但它的突触更少，上分级也少，其上的AChR数量也更少；受到免疫后，虽然三种肌肉肌纤维分型、AChR数量以及NMJ超微结构的变化趋势都是相同的，但由于EOM具有以上这些特点使其耐受性可能相对更差。Wood.S.J,Slater.C.R.Actionpotentialgenerationinratslow-andfast-twitchmuscles[J].JournalofPhysiologyM,1995;486:401-410.以上的研究结果说明，EOMMG病程中被累及。那么，肌纤维分型、突触分级以及AChR数量的不同又如何造成不同肌肉NMJ的易感性不同？是否影响NMJ安全CM1900恒冷箱切片 Leica公BX60显微 Nova超薄切片机 LKB瑞典JEM100SX透射电镜 10-12SD1011F34440只，购自 本室多聚西安化学试剂 琥珀酸 化学试剂 FLUCA公司 MolecularProbes TexasRed- TTRIzo博星博星dNTPCy5-dCTPCy3-dCTP博星反转录酶博星DT 博星Ringer’s液：140mMNaCl,5.4mMKCl,1mMCaCl,2.4mMNaHCO3,Ph7.4SDH孵育液：0.2M琥珀酸钠５0ml，0.2M磷酸盐缓冲液50ml，氯化硝基四氮唑兰100mg。AChE孵育液：硫代乙酰胆碱碘化物5mg，0.1M柠檬酸钠0.5ml，5mM铁化钾1ml，30mM1ml1ml，0.1MPBS6.5mlDAB显色液：DAB15mg100ml0.01MKPBS200mg40mg，葡萄糖氧化酶1mg。4%多聚固定液：多聚4g，0.1mol/LPB100ml电镜固定液：0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)配制,其中含有4%多聚、0.25%戊二醛15%饱和免疫电镜固定液：0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)配制,其中含有4%多聚、0.05%戊二醛和15%饱和。PTMGSDF345mg/kg注MAb35Ringer’s1ml，对照组每只仅注射Ringer’s1ml。饲养环境相同，每日给予12小时光照。48h后开始以下实验内容。AChESD31戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉后,经心脏依次灌注生理盐水150mL,4%多聚固定液500mL，取EOM和膈肌、胫前肌后再固定2h,放入2524h25μm切片贴于明胶片上按常规方法[49]AChE染SDHAChENMJSD31戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉后,经心脏迅150mLEOM25μm新鲜切片SDH1h，蒸馏水迅速洗涤三次后，用4%多聚固定液后固定30min。然后按照文献方法行AChE染色，常规脱水透明封片，显微NMJAChR选取多聚灌注后对照组三种肌肉的冰冻切片，α-BuTx-Biotin室温孵育过夜，0.01MKPBS洗三次，TexasRed-avidin或FITC-avidin室温孵育3h，0.01MKPBS洗三次，甘油封片后荧光显微镜下观察并在同条件下图像。显微镜下观察并统计其AChR分布区域直径与肌纤维横切面周长NMJ选择实验组和对照组SD大鼠各2只，经1%戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉后,经心脏灌150mL500mL2h50μm,切片放入25%蔗糖浸泡2h,磷酸盐缓冲液,0.5%锇酸中后固定1h,经梯度脱水和环氧丙烷置换后做平板包埋，选取适当部位并黏贴于空白包埋块上做超薄切片,铅、铀双染后电镜观察。测量NMJ突实验组和对照组F344大鼠EOM与胫前肌差异的分准备步骤同3.2.7。MAb3548hF344DEPC处理后的器械迅速取下EOM和胫前肌并置于液氮保存。用Trizol裂解一步法分别提取各组细胞总RNA。用OligotexmRNAMidiKit(Qiagen公司)纯化mRNA，参照Schena等的方法逆转录标记cDNA探针并纯化。用Cy3-dUTP标记对照组，Cy5-dUTP标记实验组。实验所用为大鼠表达谱（BioStarR-40S），上包含靶以及参照的cDNA共4000条。杂交方法按试剂盒说明进行。用GeneralScanning公司的ScanArray3000扫描，用Imagene3.0软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值。经过内参照的标准化，以Cy5/Cy3值大于2或小于0.5和Cy5、Cy3值皆大于800作为判断差异表达的条件。低倍镜下可见每种肌肉的NMJ排列在肌纤维的中段，形成一个终板带。比较三种肌肉的正常终板带发现，EOM的终板带明显较膈肌和胫前肌宽，而且其中除了有大量较大的NMJ外，还散在一些极小的NMJ。在实验组的观察可以发现，三种肌肉的终板带中的NMJ都变得稍小，但EOM的终板带明显变窄，其它两种肌肉的终板带变窄则不明显。如图5.3.1所示。（A为对照组眼外肌；B为实验组眼外肌；C为对照组膈肌；D为实验组膈肌；E为对照组胫前肌；F为实验组胫前5.3.1AChE染色显示各组三种肌肉的终板带Fig5.3.1EndteregionstainedbyAChEinthreekindsofmuscleslicesindifferentSDHAChENMJSDH和AChE联合染色可以区别三种类型肌纤维的NMJ。观察并统计发现，含琥珀酸脱氢酶NMJNMJ略小，EOM和膈肌都具有这个特点,统5.3.2。PTMGSDHNMJ面积都有所减小，但仍然是含琥珀酸脱氢酶多的相对更小。Ⅰ型纤维减少，但Ⅰ型纤维上的NMJ并没有发生不同于其它两型肌纤维的特殊变化。如图5.3.2所示。（A为对照组眼外肌；B为实验组眼外肌；C为对照组膈肌；D为实验组膈肌。）5.3.2SDHAChE联合染色Fig5.3.2SDHandAChRstaininginvarioustypesofmuscle5.3.2NMJ像素面积的比较（xTab5.3.2ComparisonofpixelareasinNMJofthreetypesofmusclesfibersindifferent眼外肌各型纤维NMJ像素面 膈肌各型纤维NMJ像素面ⅡB用方差分析：对照组眼外肌三种纤维NMJ面积之间有显著差异，F=307.964，p=0.000；实验组眼外肌三种纤维NMJ面积之间有显著差异，F=372.032，p=0.000。对照组膈肌三种纤维NMJ面积之间有显著差异，F=196.346，p=0.000；实验组膈肌三种纤维NMJ面积之间有显著差异，F=43.553，p=0.000。用t检验：每种肌肉各型纤维实验组和对照组NMJ面积有显著差异，其中At=6.645，Ap=0.000；Bt=8.688Bp=0.000；Ct=8.672Cp=0.000；Dt=1.0670Dp=0.000；Et=6.341Ep=0.000；Ft=9.502Fp=0.000。对照组眼外肌与胫前肌各型纤维比较：Ⅰ型t=–2.558p=0.016；ⅡA型t=–0.305p=0.763；ⅡB型t=0.766，p=0.45；实验组眼外肌与胫前肌各型纤维比较：Ⅰ型t=0.098，p=0.923；ⅡA型t=–1.332，p=0.194；ⅡB型t=1.346，p=0.190。表AChR每种对照组肌肉横切面选取10个高倍视野，测量其AChR荧光区域长轴与肌细胞横切面周长5.3.3EOM的比例明显高于膈肌和胫前肌，相对肌纤维直径它NMJ5.3.3所示。（A为正常眼外肌横切面；B为正常眼外肌纵切面；C为正常膈肌横切面；D为正常膈肌纵切面；E为正常胫前肌横切面；F为正常胫前肌纵切面）5.3.3AChR荧光区域比例的比较（xTab5.3.3ComparisonofproportionofAChRareaamongthreekindsof用方差分析：三种肌肉AChR荧光区域长轴与肌细胞横切面周长比例之间有显著差异，F=19.627，p=0.000。其中膈肌与胫前肌之间两两比较，p=0.649，眼外肌与膈肌之间两两比较p=0.000，眼外肌与胫前肌之间两两比较p=0.000。表图5.3.3银环蛇毒标记的正常三种肌肉NMJ处AChR（×400）Fig5.3.3AChRmarkedbyBuTxinNMJofthreekindsofnormalmusclesNMJ各组肌肉NMJ选取10000倍以下低倍视野按照文献方法[64]计算突触后膜长度与突触前膜长度比值，以及神经末端面积与突触后膜面积比值并进行统计分析。正常EOM的突触后膜/前膜长度比都发生了突触短缩、数目变少和分级变少，因此突触后膜/前膜长度比值变小，神经末端面积与突触后膜面积比值变大，如图5.3.4所示。（A为对照组眼外肌；B为实验组眼外肌；C为对照组膈肌；D为实验组膈肌；E为对照组胫前肌；F为实验组胫前肌。）5.3.4NMJ的超微结构（NFig5.3.4TheultrastructureofNMJinthreekindsofmusclesindifferent结果显示各实验组NMJ突触后膜长度与突触前膜长度比值较对照组减小，神经末端面积与突大。结果见表5.3.4，说明EOM的NMJ突触前后膜比例与其他两种骨骼肌有很大不同。5.3.4NMJ突触前后膜比例的比较（xTab5.3.4ComparisonofratiosbetweenpreandpostsynapticmembraneinNMJofdifferent突触后膜神经末端眼外肌膈肌胫前肌用方差分析：各组两种指标均有显著差异。其中突触后膜/前膜长度比值的两两比较：对照组眼外肌与对照组膈肌之间p=0.037，对照组眼外肌与对照组胫前肌之间p=0.000，对照组膈肌与对照组胫前肌之间p=0.083；实验组眼外肌与实验组膈肌之间p=0.041p=0.036，实验组膈肌与实验组胫前肌之间p=0.958；实验组眼外肌与对照组眼外肌之间p=0.000，实验组膈肌与对照组膈肌之间p=0.000，实验组胫前肌与对照组胫前肌之间p=0.000。其中神经末端/后膜面积比值的两两比较：对照组眼外肌与对照组膈肌之间p=0.040，对照组眼外肌与对照组胫前肌之间p=0.003，对照组膈肌与对照组胫前肌之间p=0.405；实验组眼外肌与实验组膈肌之间p=0.014，实验组眼外肌与实验组胫前肌之间p=0.000，实验组膈肌与实验组胫前肌之间p=0.200；实验组眼外肌与对照组眼外肌之间p=0.000，实验组膈肌与对照组膈肌之间p=0.000，实验组胫前肌与对照组胫前肌之间表实验组和对照组F344大鼠EOM与胫前肌差异的分F344RNA1％RNA5.3.5所示：可见28s、18s、5s三条带清晰完整无降解，符合RNA提取要求。（注：1、1’为实验组EOM，4、4’为对照组EOM，3、3’为实验组胫前肌，6、6’为对照组胫前肌）28s18s5.3.5总RNAFig5.3.5GelelectrophoresisofthetotalRNAofeach用大鼠表达谱（BioStarR-40S）杂交后扫描，用Imagene3.0软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值。经过内参照的标准化，以Cy5/Cy3值大于2或小于0.5和Cy5、Cy3值皆大于800作为判断差异表达的条件。分析后F344大鼠对照组眼外肌与对照组胫前肌出现差异表达725条，其中339条为下调，386条上调。同时，实验组眼外肌与实验组胫前肌出现差异表达547条，其中263条下调，284条上调。两张共同的差异有329条，其中部分差异表达的及相关主要功能见下页表5.3.5。对照组Cy5/Cy3指对照组眼外肌与对照组胫前肌比较的结果，实验组Cy5/Cy3指实验组眼外肌与实验组胫前肌比较的结果。（为部分有意义基125.3.5）5.3.5对照组与实验组大鼠EOMTab5.3.5somegenesdifferentiallyexpressedbetweenEOMandtibialisanteriormuscleoftwo对照组谷胱甘肽S补体B-factor,Ugt2bKai1:KangaiGnas:GNASCOP9Gpd1 细胞代TktSepp1UnrUnrAldoa醛缩酶SellBnip3腺结合蛋ATPMyl2Eno3ADPP4hbCd74Taldo1Adh1Gsta5谷胱甘肽SPpp2r2aRhoGTPLdha乳酸脱氢酶乙酰胆碱受体抗体kappaC1sAtp9a:ATPBpgmLdhb乳酸脱氢酶PvalbTpm1Pgk1肌球蛋白结合蛋白MGC72984LalbaPkm2酸激C2G6pc3:6Myl3Grlacs乙酰辅酶AUgt1a6:UDPTGTPCsdaPtmaSyn2B2m结论：比较三种肌肉的正常终板带发现，EOM的终板带明显较膈肌和胫前肌宽，而且其中除NMJNMJ。EOM的肌纤维长度只有其它骨骼肌的几十分之在许多较小的NMJ考虑为MIF纤维的多个小NMJ，但需要进一步实验证实。相对更宽的终板带反EOMNMJEOMNMJ数量较其他骨骼肌相对。SDH和AChE联合染色发现，含琥珀酸脱氢酶较多的纤维NMJ面积比含琥珀酸脱氢酶较少的肌纤维NMJ略小，EOM和膈肌都具有这个特点。NMJ形态的不同，应该与不同类型肌纤维功能不同有相关性。Ⅰ型纤维