转录调控-研究生教学课件

转录调控-研究生教学课件第一页，共48页。真核生物基因转录调控研究

的进展和方法周建林第二页，共48页。一、真核生物基因表达调控的特点(略)二、真核生物基因转录调控三、真核生物基因转录调控的研究方法第三页，共48页。转录水平的调控顺式作用元件(cis-actingelement)反式作用因子(trans-actingfactor)第四页，共48页。顺式作用元件是指对基因表达有调控活性的DNA序列，其活性只影响与其自身同处于一个DNA分子上的基因非编码序列分为：启动子、增强子、沉默子、绝缘子第五页，共48页。反式作用因子trans-actingfactor概念：通过识别和结合顺式作用元件的核心序列,而调控靶基因的转录效率的一类蛋白因子（转录因子），对基因表达调控可正(激活)可负(阻遏)。

类别：基本转录因子、上游转录因子和可诱导转录因子

第六页，共48页。第七页，共48页。第八页，共48页。启动子(Promoter)

概念：启动子是基因序列中决定转录起始的部位。包括核心启动子和上游启动子元件。

一个基因可同时拥有一个及以上启动子；

一般在转录起始点上游,位于(+1)及5’端上游100~200b左右，是决定转录起始点及转录频率的关键元素。

；可与增强子共同控制转录起始和强度；

发挥功能时除需RNA聚合酶外，还需转录调控因子与启动子区各种调控元件相互作用。

第九页，共48页。1.核心启动子：RNApolⅡ转录起始所必须的最少的DNA序列，作用是确定转录起始点并产生基础水平转录。第十页，共48页。2.上游启动子元件包括-70bp的CAAT盒,GC盒,其他距起始转录点更远的上游元件。与TFⅡD结合成复合物后提高转录频率。第十一页，共48页。启动子的研究方法研究内容：1、转录起始位点的确定2、启动子区域（顺式作用元件）的确定3、转录因子（反式作用元件）结合位点的确定4、反式作用元件和顺式作用元件相互作用对基因转录的影响第十二页，共48页。1、转录起始位点（TSS）的确定生物信息学预测TSS5´-RACE初步确定TSS的大概位置引物延伸、核酸酶保护或S1作图精确定位TSS↓↓第十三页，共48页。推荐使用Gene2Promoter

软件（.genomatix.de）和TSSW、TSSG（）预测转录起始位点和启动子区域的常用软件第十四页，共48页。预测CpG岛常用软件：CpGPlot

（http://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot）/第十五页，共48页。FirstChoiceRLM-RACEKit(Ambion)GeneRacerRLM-RACE

Kit(Invitrogen)第十六页，共48页。SMARTRACEcDNAAmplification(Clontech)

第十七页，共48页。Primerextension(引物延伸)第十八页，共48页。S1nucleasemappingRNA5’DNA3’*5’3’RNA5’DNA3’5’3’PAGEAnalysisAddS1nuclease第十九页，共48页。PrimerextensionandS1nucleasedigestion第二十页，共48页。2、启动子区域的确定生物信息学预测启动子区域缺失突变

荧光素酶活性分析↓↓克隆5´-flankingsequence并连接到报告基因载体上↓确定转录调控区域（启动子区域）↓第二十一页，共48页。Deletionmutagenesis(缺失诱变)第二十二页，共48页。Reportervector第二十三页，共48页。第二十四页，共48页。第二十五页，共48页。3、转录因子结合位点的确定(1)生物信息学预测转录因子结合位点(2)实验证实转录因子结合位点：EMSA/gel-shift,supershiftChIPDNaseIfootprinting

第二十六页，共48页。推荐使用MatInspector

软件（.genomatix.de）Mapper第二十七页，共48页。Searchforevolutionaryconservedtranscriptionfactorbindingsites.rVista2.0()ConSite(http://consite.)第二十八页，共48页。Gelretardation(凝胶阻滞)/electrophoreticmobilityshiftassay(EMSA,电泳迁移率变动分析)第二十九页，共48页。ChIP（染色质免疫共沉淀）第三十页，共48页。第三十一页，共48页。4、反式元件与顺式元件的相互作用对转录的影响（1）定点突变→荧光素酶活性分析（2）过表达转录因子→测定目的基因的表达（3）干扰转录因子的表达→测定目的基因的表达（4）转基因动物第三十二页，共48页。第三十三页，共48页。定点突变第三十四页，共48页。第三十五页，共48页。增强子（enhancer）基因组中能增强邻近基因启动转录的序列。最早发现于SV40的基因上游，含2个72bp的正向重复序列。增强子特性1.增强效应非常明显10~200倍。2.与其位置、取向无关（上下游、距离）3.核心序列是重复序列,是增强效应所必须4.有细胞组织特异性，需与特异蛋白因子作用5.无基因特异性6.要有启动子才能发挥作用第三十六页，共48页。BulgerandGroudine.2002.NatureGen.32:555-557ModelsforEnhancerAction第三十七页，共48页。

–consistsofseveralgoodbindingsitesofTFs–thesitesarespatiallyclusteredtogether–thepatternofsitesisconservedCharacterizationofanenhancer?第三十八页，共48页。EnhancerElementLocator第三十九页，共48页。AssaysforEnhancersTransienttransfectionDNAaseIhypersensitivityDNAaseIfootprinting/mutationanalysisTransgenicmice第四十页，共48页。TransientTransfection:PLuciferaseEPLuciferaseEPLuciferase第四十一页，共48页。Insulator(绝缘子)一种负调控元件，参与基因表达的负调控。干扰增强子与启动子的相互作用，并抑制启动子的激活活性。第四十二页，共48页。3.7InsulatorfunctioninImprintingTwolinkedImprintedGenes:Maternal[H19(on),Igf2(off)]Paternal[H19(off),Igf2(on)]H19Igf2第四十三页，共48页。Effectsofinsulatorsonenhancer–promoterinteractions第四十四页，共48页。第四十五页，共48页。CTCFBSDB:aCTCFbindingsitedatabaseforcharacterizationofvertebrategenomicinsulatorsCTCFistheonlyproteinidentifiedsofarinvertebratethatbindstoinsulatorsandshowsenhancer-blockingactivity

第四十六页，共48页。CTCFvs.BORISCTCF11个与DNA结合的锌指结构域与绝大多数的ICRs以及CpG岛结合结合是甲基化敏感的具有绝缘子功能具有边界元素的功能，例如阻断异染色质的传播保护