实验4乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白附件

实验4乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白附件第1页/共16页生物化学实验之－－实验四乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白第2页/共16页【实验目的】

学习乙酸纤维素薄膜电泳的原理，掌握有关操作技术。【实验原理】

电泳:带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的方向泳动的现象。由于被分离物质所带电荷的性质、数量和分子的大小以及形状不同，在同一电场作用下其移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率（μ）不同。因此，经过一定时间电泳后即可被第3页/共16页分离开来。利用此性质，将混合物中各组分进行分离分析的方法称为电泳法。

影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象。影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状。第4页/共16页血清蛋白组分蛋白质名称等电点（pI）相对分子质量白蛋白α1－球蛋白α2－球蛋白β－球蛋白γ－球蛋白4.85.065.065.126.85~7.56900020000030000090000~150000156000~300000第5页/共16页

血清中各主要蛋白质的等电点均低于pH8.6，在该缓冲液中均带负电荷，在电场中向正极移动。以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条主要区带。其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为α1-、α2-、β-及γ-球蛋白。

第6页/共16页【实验材料与试剂】（一）醋酸纤维薄膜（2×8cm）、电泳仪、电泳槽、点样器（盖玻片）、载玻片、培养皿、镊子（二）新鲜血清、巴比妥/钠缓冲液（pH8.6，离子强度0.07）、染色液（氨基黑10B）、漂洗液第7页/共16页【实验步骤】

1.薄膜的处理⑴将醋酸纤维薄膜置于盛有巴比妥/钠缓冲液的平皿中，浸泡30min以上。⑵用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸去多余的缓冲液，然后平铺在载玻片上（无光泽面朝上）。第8页/共16页

用毛细管取一滴血清，滴在另一载玻片上，用盖玻片的一侧边在血清上均匀蘸一下，再轻轻印在薄膜点样处片刻，使血清渗透到薄膜内，形成均匀的直线。2.点样第9页/共16页3.电泳⑴将薄膜平贴在电泳槽支架上，点样端在阴极。两端用已浸透缓冲液的纱布压住（引桥）。第10页/共16页⑵盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10min。连接电源、电极线。第11页/共16页⑶通电，调节电压至100V，电流强度为0.4～0.6mA/cm膜宽度，电泳时间约45~60min。第12页/共16页4.染色电泳完毕后将薄膜取下,放在氨基黑10B染色液中浸泡5~10min。5.漂洗将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱尽，条带清晰为止，可得到色带清晰的电泳图谱。+-第13页/共16页【注意事项】

1.市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的选择与浸润是电泳成败的关键之一。若浸透后的薄膜色泽均匀，深浅一致，则可用于电泳。

2.醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥－巴比妥钠缓冲液，其浓度为0.05～0.09mol/L。选择何种浓度与样品和薄膜的厚薄有关。第14页/共16页3.

点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散。但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始点参差不齐，影响分离效果。

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