【课件】DNA重组技术的基本工具课件高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

专题1基因工程1.1DNA重组技术的基本工具抗虫棉普通棉基因工程的产物转基因抗虫棉基因工程的产物基因工程的产物基因工程的产物奇思妙想奇思妙想什么叫基因工程？

基因工程，又叫DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传特性。基因工程概念解析操作环境：操作对象：操作水平：操作技术：操作原理：意义：生物体外基因DNA分子水平基因重组（定向）

克服了远缘杂交不亲和障碍；定向改造了生物的遗传性状DNA重组和转基因技术问题探讨：苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。

想一想需要做哪些关键工作？苏云金芽孢杆菌毒蛋白普通棉花抗虫棉基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与载体“缝合”关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞“分子手术刀”——限制性核酸内切酶“分子缝合针”——DNA连接酶一、“分子手术刀”——限制性核酸内切酶1.来源:主要从原核生物中分离纯化

原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中能切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。2.作用:识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。磷酸二酯键1234512345限制酶的种类与命名

现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。EcoRⅠ大肠杆菌（EscherichiacoliR）SmaⅠ粘质沙雷氏杆菌（Serratiamarcesens）限制酶的识别序列…GAATTC……CTTAAG……CCCGGG……GGGCCC…EcoRⅠSmaⅠ

限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中轴线（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称、重复排列的。当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，产生的是黏性末端。3.限制酶的作用结果：

被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。

EcoRⅠ黏性末端黏性末端AATTCGTTAAGCSmaⅠ平末端平末端

拓展

不同限制酶识别的序列和切割的位点不同，但产生的黏性末端可相同

例如BamHI识别切割—GGATCC—

—CCTAGG—

Sau3AI识别并切割—GATC—

—CTAG—

二、“分子缝合针”

——DNA连接酶1、作用:

把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.2、作用原理：催化磷酸二酯键形成3、种类：E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶

可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，E·coliDNA连接酶或T4DNA连接酶即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键

T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低T4DNA连接酶类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别（二）“分子缝合针”——DNA连接酶DNA聚合酶DNA连接酶区别1区别2作用结果相同点DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板将两个DNA片段连接成重组DNA分子合成新的DNA分子常用的载体：质粒能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别三、“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体质粒是一种裸露的、结构简单独立于细菌拟核之外、具有自我复制能力的很小双链环状DNA分子。⒈载体需要的条件：

（1）有1至多个限制酶切点（供目的基因插入）（2）能在受体细胞中稳定存在并自主复制（3）有某些标记基因，便于筛选（4）对受体细胞无害（5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。三、“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。⒉常用运载体：

（1）细菌的质粒（2）λ噬菌体的衍生物

（3）动植物病毒……ATAGCATGCTATCCATG……TATCGTACGATAGGTACTTAAAATTCGGCATAC……GCCGTATG…………TCCTAG……AGGATCTTAAAATTCCATAC……GGTATG……AATTCTCGGTATGGAGCCATACTTAA思考：目的基因两侧用同种限制酶切割后，用DNA连接酶连接可能会出现什么结果？会出现自身环化及目的基因反向连接如何防止这种现象出现?同时用两种限制酶切割质粒和含目的基因的DNA片段继续思考：用两种限制酶切后，用DNA连接酶连接，会出现什么现象？

限制酶I—GAATTC—

限制酶II—GTGCAC—

1、AATTC...........GG………CACGT2、AATTC………GG……...CACGT3、AATTC……….GG……….CACGT4、AATTC……….GG……….CACGT目的基因质粒目的基因质粒若只考虑两个片段连接则有几种可能？1、质粒—目的基因2、质粒—质粒3、目的基因—目的基因这些由两个DNA片段连接后也可环化例：限制酶MunI和限制酶EcoRI的识别序列及切割位点分别是-C↓TTAAG-和-G↓AATTC-。如图表示四种质粒和目的基因，其中，箭头所指部位为酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因运载体的质粒是[

]A．B．

C．D．A27483615思考与探究P7思考与探究P72、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？

通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：思考与探究P71）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外