流式细胞仪培训

一、流式细胞仪概述第一页，共55页。流式细胞仪种类BDFACSVantageBD-CaliburEpicsAltra第二页，共55页。EpicsAltraBeckmanCoulter第三页，共55页。流式细胞仪的定义流式细胞仪是指，使细胞（或其他粒子）以单个方式依次高速通过激发光束，采集细胞被光照时产生的各种信号，对信号进行处理，并对各参数进行关联分析的一种仪器。第四页，共55页。利用流式细胞仪通过检测荧光信号来检测细胞或其它颗粒性物质（表面或胞浆或胞核）的物理、化学特性并通过这些特性对细胞或颗粒进行定量。

检测表面标记物检测胞浆标记物检测胞核内标记物检测可溶性蛋白流式细胞术（FLOWCYTOMETRY）第五页，共55页。流式细胞仪的基本结构前向散射侧向散射第六页，共55页。流式细胞仪显微镜流动的细胞静止的细胞样本数量大数量少高速分选样本难以再利用细胞群体特征量分布可以揭示细胞内部结构信息特殊的显微镜第七页，共55页。高速测定细胞，大样本计数检测稀有细胞多参数分析自动化细胞分选流式细胞仪的主要特点第八页，共55页。二、流式细胞仪工作原理第九页，共55页。流式细胞仪工作原理流式细胞仪通常以激光作为激发光源，经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。这两种信号被光电二极管和光电倍增管接收，之后转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号，最后由计算机进行计算处理。第十页，共55页。仪器基本组成流路流动室 鞘液SHEATH样本流SAMPLE单细胞悬液5105-1106个/ml光路光源滤片光电倍增管PMTHV电路放大电路HV及GAIN增益A/D转换统计

计算机第十一页，共55页。流路InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid流动室第十二页，共55页。流式细胞仪光路图Air-cooledArgonIonLaserBeamShapingLensesHighSensitivityQuartzFlowCellForwardScatterDetectorSideScatterDetector525BPFL1(FITC)575BPFL2(PE)620BP

FL3(ECD)675BPFL4(PC5)488DL488BK550DL600DL645DL流动室第十三页，共55页。激光配置488nm氩离子激光器633nm氦氖激光器大功率水冷紫外激光器第十四页，共55页。光路-滤片特性长通滤片–允许长于设定波长的光通过短通滤片–允许短于设定波长的光通过带通滤片–允许一定带宽的波长通过当以

45o

角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光，这种方式的滤片称为二向色性滤片(dichroicfilter)630nmBandPassFilterWhiteLightSource第十五页，共55页。光信号收集光信号分离，导向，各探测通道PMT接收并转化为电信号。二色镜

123带通滤波片光电倍增管激光束细胞收集透镜前向散射光侧向散射光，荧光第十六页，共55页。数据处理FSCSSC

FL1FL2FL3对数

线性线性

线性

对数脉冲处理，模数转换光信号电信号记录数据，显示结果（面积，峰高，宽度）第十七页，共55页。颗粒度细胞大小流式细胞仪产生的信号非荧光信号第十八页，共55页。FL1–FITC,GFP…(PMT2)FL2–PE(PMT3)FL3–ECD,PI…(PMT4)FL4–PC5,APC…(PMT5)荧光信号第十九页，共55页。细胞表面的抗原(或细胞膜受体)与相关的荧光抗体结合，形成带有荧光的抗原抗体复合物。通过流式细胞仪测定其荧光量，即可得到细胞群的不同抗原位点表达情况。原理第二十页，共55页。488nm空冷激光：

FITC、PE、ECD、PC5、PI、7AAD、

PerCP、EGFP、EYFP、AO、TO、Fluo3633nm空冷激光：

APC、APC-CY7、CY590-4水冷激光：UV（333-364nm）

HOECHST33342、DAPI…第二十一页，共55页。三、流式细胞仪应用第二十二页，共55页。流式细胞仪应用淋巴细胞免疫功能测定干细胞研究细胞增殖与凋亡检测细胞周期及倍体分析细胞活性分析细胞分选

……第二十三页，共55页。淋巴细胞亚群活化的T淋巴细胞抗原特异性免疫细胞调控性T细胞树突状细胞先天免疫细胞细胞免疫功能测定第二十四页，共55页。细胞群CD抗原

T细胞CD2CD3CD4CD5CD7CD8CD28CD38B细胞CD10CD19CD20-CD24CD37CD72-CD75

髓系细胞CD13CD14CD15-CD17CD33CD34CD35NK细胞CD16CD56CD57CD94

血小板CD31CD41CD42aCD42bCD61CD62pCD63

激活抗原CD26CD30CD69CD95-CD97

粘附分子CD11a-cCD18CD29CD44CD49a-f

内皮细胞CD105CD106CD109

细胞因子受体CD25CD115CD117CD122CD126CD抗原及其相关细胞群第二十五页，共55页。淋巴细胞亚群数量检查项目和意义疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫病降低增高降低降低AIDS降低严重降低增高降低SARS降低降低降低降低降低慢性活动性肝炎、肝硬化降低正常或增高降低降低肿瘤降低降低增高降低降低第二十六页，共55页。用荧光标记抗体抗体特异性地结合细胞上对应的抗原表达该抗原的细胞被标记上荧光；抗原表达多的细胞荧光强度强阳性细胞百分比或浓度靶蛋白浓度第二十七页，共55页。淋巴细胞CD抗原的流式细胞检测第二十八页，共55页。造血系统干细胞肿瘤干细胞间充质干细胞神经干细胞脂肪干细胞…………干细胞研究第二十九页，共55页。热门研究－(肿瘤)干细胞肿瘤组织无限制的增殖在于肿瘤干细胞的存在目前研究的肿瘤干细胞来源于前列腺、乳腺等肿瘤肿瘤干细胞数量稀少，常规方法很难检测目前研究发现，肿瘤干细胞和正常细胞在HOECHEST33342染料摄取方面有重大差别故流式细胞仪是分析和检测肿瘤干细胞的重要工具第三十页，共55页。干细胞能表达ABCG2泵蛋白，在HOECHST33342染色时能将该染料泵出，因此分析不能被该染料染色的细胞群时可以发现一群不能染色的细胞既是干细胞，因此能够在众多肿瘤细胞中区分出肿瘤干细胞。肿瘤干细胞中的研究应用

-Hoechst33342sidepopulation第三十一页，共55页。HoechstHoechst+Vera.SidePopulationCells第三十二页，共55页。细胞凋亡研究1.鉴别凋亡与坏死:AnnexinⅤ/PI2.测定凋亡率:AnnexinⅤ、Apo2·7、TUNEL3.研究凋亡触发机制：Caspase、Fas及FasLbcl-2/bax4.多参数分析凋亡是趋势第三十三页，共55页。第三十四页，共55页。G1SphaseG2MG1121DNA含量

DNA含量细胞周期时相G0/1G2/MS细胞数细胞周期分析第三十五页，共55页。PIEthidiumBromideAcridineOrangeDAPI(UVexcitable)Hoechst33342(viable,UVexcitable)不能主动进入细胞，需要固定打孔488nm激发为脂溶性，主动进入细胞UV激发常用的DNA染料第三十六页，共55页。DNA含量及细胞周期分析细胞周期分析:在细胞周期(G0，G1，S，G2，M)的各个时期，DNA的含量随各时相呈现出周期性的变化。通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解细胞的周期分布及细胞的增殖活性。也可利用细胞周期蛋白（CYCLIN）、Ki67、核增殖抗原（PCNA）等，对细胞周期进行精确的分期：G0、G1、S、G2、M.第三十七页，共55页。G0/G1SG2/M第三十八页，共55页。流式细胞仪分选电荷式分选是当前的主流分选模式高速分选是保证结果的基本条件高纯度和高活性是分选的基本要求可选的激光要多样化（空冷、水冷、固体；不同的波长；真正的紫外）提供多种分选流动室光路稳定，紫外激光功率大流式分选和磁珠分选的差别和联系第三十九页，共55页。488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector电荷式细胞分选第四十页，共55页。细胞分选的主要技术指标分选速度：≧25000个细胞/秒分选纯度：﹥98%

分选后细胞存活率：97%第四十一页，共55页。BeforeSortingAfterSorting第四十二页，共55页。三、流式细胞仪检测的一般步骤第四十三页，共55页。设置检测方案（PROTOCOL)染色标本（同型对照，补偿管，检测抗体）同型对照管调电压电压不变，补偿管调补偿电压不变，补偿不变，上检测管检测后直接阅读结果检测的一般步骤第四十四页，共55页。电压调节－利用同型对照：设置背景电压volts增益Gain设定阴性和阳性信号强度的临界点第四十五页，共55页。荧光补偿

Needtodowhenwemeasuresignalsfrommorethan1fluorescence.FITC520BPPE575BP第四十六页，共55页。4ColorSingleLaser(488nm)

FITC/PE/ECD/PC5第四十七页，共55页。补偿PEFITCPE+cellsFITC+cellsTodocolourcompensation:ForPureFITC+cells,=PEsignal-%FITCsignalForPurePE+cells,=FITCsignal-%PEsignalAftercompensationPEFITCPE+cellsFITC+cellsGOODcompensation:Y-meanoftheFITCcell=theY-meanof-/-cell