生物化学与分子生物学实验

实验一：基本操作与分光光度计的使用

实验二：蛋白质的两性反应与等电点测定

实验三：福林—酚试剂法测定血清总蛋白

实验四：凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高铁氰化钾

实验五：蔗糖酶与淀粉酶的专一性

实验六：醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质

实验七：聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质

实验八：酵母RNA的提取及成分鉴定（浓盐法）

实验九：葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖

实验十：聚合酶链式反应(PCR)

实验十一：琼脂糖凝胶电泳检测DNA

实验十二：微量快速质粒DNA的提取与纯化第一页，共244页。返回目录实验一基本操作与分光光度计的使用第二页，共244页。实验目的

了解实验室的一般规则，点收仪器掌握一般玻璃仪器的洗涤法和刻度吸量管的使用一、基本操作第三页，共244页。

试管

吸量管(0.1mL、0.5mL、1mL、2mL、

5mL及10mL各一支)。微量加样器（20μL、100μL、

200μL、1000μL、5000μL）实验器材及试剂第四页，共244页。点收仪器逐项清点各种仪器是否完整无缺，若有破损或缺失；应向指导老师报告并请求更换或补发。

第五页，共244页。玻璃仪器的洗涤一般玻璃仪器的洗涤分类：试管、烧杯等洗涤过程：合成洗涤水刷洗自来水冲洗干净蒸馏水润洗2-3遍沥干备用自来水冲洗第六页，共244页。容量分析仪器的洗涤分类：滴定管、移液管、刻度吸量管和容量瓶等洗涤过程：自来水冲洗铬酸洗液浸泡2-4小时自来水冲洗干净蒸馏水润洗2-3遍沥干备用第七页，共244页。吸量管吸量管的种类1、奥氏吸量管：2、移液管或移液吸量管3、刻度吸量管213333第八页，共244页。奥氏吸量管：规格：只有一个刻度线放液时最后须吹出残留在管尖的液体0.5mL、1mL、2mL、5mL及10mL同一容量的吸量管中它的内表面积最小

准确度最高常作为量取粘度较大的液体之用第九页，共244页。移液管或移液吸量管规格：只有一个刻度放液时管尖残留液体不得吹出1mL、5mL、10mL、20mL、25mL、50mL及100mL常作为容量分析、定量稀释之用第十页，共244页。刻度吸量管：规格：吸量管刻度分到尖端和不到尖端两种所标刻度有自上而下或自下而上的两种0.1mL、0.2mL、0.5mL、1mL、2mL、

5mL和10mL刻度到尖端且小于或等于2ml的吸量管，在取液时要吹出残留在尖端的液体第十一页，共244页。吸量管的使用方法拿法取液调刻度放液定量法与卸量法取液的不同第十二页，共244页。吸量管的选用原则量取整数量液体时，应尽量选用奥氏吸量管量取液体体积较大时可用移液管选用与取液量最近的吸量管在同一实验中，若几支试管中需加入不同量的同一种液体时、要根据加入液体的体积酌情选用尽量选用卸量法来量取液体第十三页，共244页。微量加样器常用规格：10μ

L、20μ

L、100μ

L、200μ

L、1000μ

L和5000μ

L第十四页，共244页。

微量移液器的使用方法设定体积套上适当的tip头

，方可吸取溶液

一档取液，二档放液第十五页，共244页。试管中液体的混匀法旋转法指弹法甩动法倒转法与玻棒搅拌法（不常用）第十六页，共244页。

二、722型分光光度计的使用

722型分光光度计能在可见光谱区域内对样品物质作定量的分析。该仪器广泛应用于医药卫生、临床检验、生物化学、石油化工、环境保护、质量控制等部门，是生物化学实验室常用分析仪器之一第十七页，共244页。基本原理溶液中的物质在光的照射激发下，产生了对光吸收的效应，物质对光的吸收是具有选择性的，各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱，因此当某单色光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系，也即符合于比色原理---朗伯-比耳定律

第十八页，共244页。朗伯比尔定律：A=εlc

ε：摩尔吸光系数

c：溶液的浓度

l：液层的厚度

A：物质的吸光度

第十九页，共244页。操作方法预热仪器

选定波长

调节T=100％

固定灵敏度档

调节“0”点

测定

关机

第二十页，共244页。注意事项该仪器应放在干燥房间内，使用温度为5℃--35℃。远离强电场、磁场每次做完实验时，应立即洗净比色皿

为了防止光电管疲劳。不测定时必须将比色皿暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命

当仪器停止工作时，切断电源，电源开关同时切断。并且用套子盖住仪器，做好使用登记

第二十一页，共244页。

比色皿的使用方法拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污

洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净

比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸干，以保护透光面

第二十二页，共244页。实验内容

利用标准对比法测定待测CuSO4的浓度

标准对比法：

A标=εlc标A待=εlc待

C待=A待A标×C标第二十三页，共244页。实验结果与讨论

登记原始数据

计算并讨论

第二十四页，共244页。思考题为什么测待测CuSO4时用蒸馏水做空白管调“0”和“100%T”？朗伯比尔定律为什么只适用于单色光？返回目录第二十五页，共244页。实验二

蛋白质的两性反应与

等电点测定返回目录第二十六页，共244页。

了解蛋白质的两性解离性质

掌握测定蛋白质等电点的方法实验目的第二十七页，共244页。PCOOHNH2PCOO-NH3+PCOO-NH2PCOOHNH3+pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI兼性离子

阳离子阴离子实验原理第二十八页，共244页。

在等电点时蛋白质颗粒上的静电荷为零，缺乏同电相斥的因素，蛋白质溶解度最小，最容易析出沉淀第二十九页，共244页。

本实验配制了各种不同pH值的缓冲液，沉淀出现最多的缓冲液pH值即为酪蛋白的等电点第三十页，共244页。实验器材与试剂

小试管、大试管、滴管、刻度吸量管

0.5％酪蛋白醋酸钠溶液

0.01％溴甲酚绿指示剂(指示范围:

)

0.02MHCL溶液、0.02MNaOH溶液

0.01M醋酸溶液、0.10M醋酸溶液、

1.00M醋酸溶液第三十一页，共244页。

蛋白质的两性反应（1）实验步骤取一干净试管酪蛋白液10滴溴甲酚绿指示剂3滴观察溶液颜色并解释现象第三十二页，共244页。

蛋白质的两性反应（2）滴加0.02MHCL溶液边滴加边混匀有最大沉淀产生，观察溶液颜色变化至沉淀消失，观察溶液颜色并解释现象继续滴加0.02MHCL溶液边滴加边混匀第三十三页，共244页。

蛋白质的两性反应（3）继续滴加0.02MNaOH溶液边滴加边混匀有最大沉淀产生，观察溶液颜色变化至沉淀消失，观察溶液颜色并解释现象继续滴加0.02MNaOH溶液边滴加边混匀第三十四页，共244页。

取7支同样规格的干燥试管，精确加入各试剂试管号码1234567蒸馏水2.43.2—3.01.52.753.381.00M醋酸1.60.8—————0.1M醋酸——4.01.0———0.01M醋酸————2.51.250.62pH3.53.84.14.75.35.65.9

酪蛋白等电点的测定注：单位均为mL第三十五页，共244页。

向每个试管中各加0.5%酪蛋白溶液20滴，加一管，立即混匀一管静置30分钟后，以0、+、++、+++、++++表示各管的混浊度，并指出哪一pH是酪蛋白的等电点第三十六页，共244页。

溶液呈蓝色

蛋白质的两性反应(1)实验结果酪蛋白溶液呈碱性(pH﹥5.4)，使溴甲酚绿指示剂显蓝色第三十七页，共244页。

[H+]，沉淀

蛋白质的两性反应(2)出现最大量沉淀时,说明到达了酪蛋白的等电点溶液由蓝色变成浅绿色（3.8﹤pH﹤5.4）第三十八页，共244页。

继续加酸，[H+]继续增大，pH＜pI。酪蛋白所带正电荷不断增加，同电相斥，沉淀溶解沉淀完全溶解时，溶液显黄色(pH﹤3.8)第三十九页，共244页。

[OH-]，沉淀

蛋白质的两性反应(3)出现最大量沉淀时,说明到达了酪蛋白的等电点溶液由黄色变成浅绿色（3.8﹤pH﹤5.4）第四十页，共244页。

继续加碱，[OH-]继续增大，pH﹥pI。酪蛋白所带负电荷不断增加，同电相斥，沉淀溶解沉淀完全溶解时，溶液显蓝色(pH﹥5.4)第四十一页，共244页。结论1：酪蛋白等电点在之间

pH=pI时，酪蛋白溶解度最小酪蛋白是两性电解质第四十二页，共244页。1234567沉淀量0++++++++++00酪蛋白等电点的测定1234567第四十三页，共244页。结论2：

4号试管沉淀量最多说明4号管溶液的pH值为酪蛋白的等电点，即pI=4.7第四十四页，共244页。什么是蛋白质的等电点？在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生沉淀？思考题第四十五页，共244页。实验目的实验原理试剂和器材操作方法（主要步骤）实验结果讨论思考题请按时交实验报告！！第四十六页，共244页。

实验三福林—酚试剂法测定血清总蛋白预习返回目录第四十七页，共244页。实验三

福林—酚试剂法测定血清总蛋白返回目录第四十八页，共244页。学习测定蛋白酶活力的方法掌握分光光度计的原理和使用方法实验目的第四十九页，共244页。蛋白质浓度测定微量凯氏定氮法

Folin-酚试剂法紫外光吸收法实验原理

第五十页，共244页。

Folin—酚试剂法(Lowry法)Step1碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质－铜复合物蛋白质－铜复合物使磷钨酸—磷钼酸还原蛋白质中含有酚基的酪氨酸，可使酚试剂中的磷钨酸—

磷钼酸还原而呈蓝色显色反应(蓝色)。在一定条件下，蓝色强度(A660)与蛋白质的量成正比例Step2第五十一页，共244页。优点:

缺点:操作简便灵敏度高有蛋白质特异性的影响；标准曲线不是严格的直线形式可检测的最低蛋白质量达5µg/ml，通常测定范围是25-250µg/ml

第五十二页，共244页。干扰物质蔗糖Tris缓冲液硫酸胺酚类尿素柠檬酸胍硫酸钠三氯乙酸乙醇丙酮CHAPSEDTAEGTAHEPESTritonX-100dithiothreitol第五十三页，共244页。实验器材与试剂大试管、刻度吸量管、恒温水浴箱

722E型分光光度计试剂甲，试剂乙标准蛋白溶液（250μg/ml）待测血清（稀释500倍）第五十四页，共244页。空白(1)(2)(3)(4)(5)(6)待测管（7）标准蛋白溶液(250µg/ml)--0.20.40.60.81.0—待测血清——————1.0蒸馏水1.00.80.60.40.20--试剂甲3.03.03.03.03.03.03.0取7支洁净试管，按下表加入试剂

实验步骤第五十五页，共244页。混匀后室温放置10分钟在各试管中分别加入试剂乙0.3mL30分钟后以空白管为对照测其吸光值(660nm)立即摇匀第五十六页，共244页。标准曲线法标准管对照法

计算及绘制标准曲线第五十七页，共244页。标准曲线法

以吸光度值为纵坐标，1-6管标准蛋白的浓度为横坐标在坐标纸上作图,得到一条过原点的直线，即标准曲线第五十八页，共244页。＊＊＊＊CA标准曲线CXAX

CX为根据待测样品的吸光值查标准曲线所得的蛋白质浓度0＊第五十九页，共244页。在图上查出待测管的浓度后，按下列公式进行计算：待测血清蛋白含量=C7×4.31.0（μg/mL）×500M7（μg）×5001.0或者=第六十页，共244页。注意事项

作一条标准曲线至少要5个点被测物与标准物应在相同条件下测定标准曲线中标准物浓度有一定的线性范围，应使标准曲线范围在被测物质浓度的1/2～2倍之间，并使吸光度在0.05～1.0范围为宜第六十一页，共244页。待测血清蛋白含量=A7An×C标准×500VnV7×（μg/mL）注：Vn为标准管加入标准蛋白质的体积

V7为待测管加入的待测血清的体积

选一管与待测管吸光度相近的作为标准管，根据公式计算：标准管对照法第六十二页，共244页。标准管待测管实验结果第六十三页，共244页。管号1234567OD660nm00.1510.2300.3630.4100.4980.376MXAXM7（μg）×5001000C血清=149（μg）=74.5（g/L）第六十四页，共244页。管号1234567OD660nm00.1510.2300.3630.4100.4980.376C血清=?人血清中蛋白质的正常范围为60-80g/L0.3760.363×0.250.61A7An×C标准×500VnV7×=77.7g/L第六十五页，共244页。思考题什么叫标准曲线？绘制标准曲线有何实用意义？第六十六页，共244页。实验项目实验原理试剂和器材操作方法（主要步骤）结果分析思考题请按时交实验报告！！第六十七页，共244页。实验四凝胶过滤分离高铁血红蛋白高铁氰化钾预习返回目录第六十八页，共244页。实验四

凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高铁氰化钾返回目录第六十九页，共244页。了解凝胶层析的原理及应用通过血红蛋白脱盐实验，初步掌握凝胶层析技术实验目的第七十页，共244页。凝胶过滤层析：

是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离，也称分子筛层析、排阻层析实验原理第七十一页，共244页。

单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。交联葡聚糖的凝胶颗粒第七十二页，共244页。带网孔的葡聚糖珠小分子进入葡聚糖珠内大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出凝胶过滤层析过程示意图第七十三页，共244页。交联葡聚糖高铁血红蛋白与高铁氰化钾混合物高铁血红蛋白高铁氰化钾第七十四页，共244页。

高铁血红蛋白分子量大(MetHb，红褐色，Mw=64500)，完全排阻Hb﹢K3Fe(CN)6MetHb

高铁氰化钾分子量小(K3Fe(CN)6，黄色，Mw=327.25)

，可完全进入凝胶颗粒网孔内，从而达到分离的目的

第七十五页，共244页。

利用特制的半透膜把大小分子分开的方法，截止分子量一般为一万临床应用：血液透析

透析液浓缩的蛋白混合样品透析袋开始透析处于平衡状态透析法：第七十六页，共244页。

钼酸铵

+

氨基萘酚磺酸

+

磷酸盐钼蓝（蓝色）

15%三氯醋酸+蛋白质变性、沉淀第七十七页，共244页。实验器材与试剂

层析管、分液漏斗、吸管、透析袋、磁力搅拌器

血红蛋白溶液交联葡聚糖G-25

0.4%K3Fe(CN)6

氨基萘酚磺酸试剂

钼酸铵试剂

15%三氯醋酸第七十八页，共244页。实验步骤凝胶的处理G-25颗粒(5g)蒸馏水室温溶胀去除杂质10倍体积的磷酸缓冲液浸泡(过夜)第七十九页，共244页。装柱加入缓冲液(或蒸馏水)排出管中气泡将凝胶缓缓注入管内自然沉降至柱床高度达20cm层析管洗净、固定在铁架上关闭出口打开出口关闭出口打开出口第八十页，共244页。装柱加入缓冲液排出管中气泡将凝胶缓缓注入管内自然沉降至柱床高度达20cm层析管洗净、固定在铁架上关闭出口打开出口关闭出口打开出口第八十一页，共244页。装柱要求:连续均匀无气泡无分层第八十二页，共244页。

流程图：第八十三页，共244页。

层析柱稳定5-10min后接储液瓶，打开出口，用约20ml的缓冲液洗脱平衡，关闭出口平衡第八十四页，共244页。加样准备血红蛋白(3滴)与K3Fe(CN)6(8滴)混合液自距床面1mm高处靠壁缓慢加入至液面降至与凝胶面相平放掉多余缓冲液至刚露出床面打开出口关闭出口第八十五页，共244页。洗脱与收集至少量洗脱液流入床面再加洗脱液至3-4cm高连接储液瓶洗脱（1滴/3秒）沿壁加入加1-2倍样品量体积的洗脱液打开出口关闭出口收集红褐色的MetHb色带第八十六页，共244页。带网孔的葡聚糖珠小分子进入葡聚糖珠内大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出凝胶过滤层析过程示意图第八十七页，共244页。用洗耳球从层析柱下口慢慢将柱中的凝胶吹至小烧杯中回收洗脱与收集将黄色的K3Fe(CN)6色带完全洗脱后，用2~3倍柱床体积的洗脱液冲洗凝胶第八十八页，共244页。将MetHb洗脱液装入透析袋将透析袋扎紧

打开磁力搅拌器，透析30分钟

将透析袋悬入装有蒸馏水的烧杯中透析第八十九页，共244页。

磷酸盐的鉴定试剂量钼酸铵试剂氨基萘酚磺酸试剂反应结果透析前杯内蒸馏水15滴2滴3滴？透析后杯内蒸馏水10滴2滴3滴？鉴定第九十页，共244页。

蛋白质的鉴定试液量15%三氯醋酸反应结果透析前杯内水40滴20滴？透析后杯内水40滴20滴？透析袋内溶液10滴5滴？第九十一页，共244页。

装柱后检查凝胶是否均匀，若有气泡或分层时需重新装柱，柱床面平整；洗脱时流速不可太快或太慢；透析袋中的液体不可装满，否则会将透析袋胀破。注意事项第九十二页，共244页。磷酸盐的鉴定试剂量钼酸铵试剂氨基萘酚磺酸试剂反应结果透析前杯内蒸馏水15滴2滴3滴透析后杯内蒸馏水10滴2滴3滴无蓝色实验结果第九十三页，共244页。

蛋白质的鉴定试液量15%三氯醋酸反应结果透析前杯内蒸馏水40滴20滴透析后杯内蒸馏水40滴20滴透析袋内溶液10滴5滴无无有沉淀第九十四页，共244页。

MetHb的相对分子量较大，直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，流程较短，移动速度快，首先流出实验讨论与分析第九十五页，共244页。

K3Fe(CN)6的相对分子质量较小，直径小于凝胶网孔可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中流程较长，移动速度慢，最后流出第九十六页，共244页。磷酸盐是小分子，小于透析袋孔径的小，能够穿过透析袋；而蛋白质是大分子，不能透过透析袋，只能保留在袋中第九十七页，共244页。向凝胶柱中加入样品时，为什么必须保持胶面平整？上样体积为什么不能太大？请解释为什么在洗脱样品时，流速不能太快或太慢？思考题第九十八页，共244页。

实验项目实验原理试剂和器材操作方法（主要步骤）结果分析思考题请按时交实验报告！！第九十九页，共244页。实验五醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质预习返回目录第一百页，共244页。返回目录实验五

蔗糖酶与淀粉酶的专一性第一百零一页，共244页。实验目的了解酶的专一性掌握检验酶的专一性的原理和方法第一百零二页，共244页。实验原理酶与一般催化剂最主要的区别之一是它具有高度的专一性。所谓专一性指的是一种酶只能对一种化合物或一类化合物（通常在这些化合物的结构中具有相同的化学键）起一定的催化作用，而不能对别的物质发生催化反应第一百零三页，共244页。蔗糖棉子糖淀粉Bedenict试剂阴性反应第一百零四页，共244页。蔗糖棉子糖淀粉蔗糖酶红棕色氧化亚铜沉淀蔗糖酶蔗糖酶Bedenict试剂Bedenict试剂Bedenict试剂阴性反应红棕色氧化亚铜沉淀第一百零五页，共244页。蔗糖棉子糖淀粉淀粉酶阴性反应淀粉酶淀粉酶Bedenict试剂Bedenict试剂Bedenict试剂红棕色氧化亚铜沉淀阴性反应第一百零六页，共244页。实验器材试管1.5×15cm（×12）、试管架、竹试管夹烧杯100mL（×1），200mL（×1）量筒100mL（×1），10mL（×1）恒温水浴箱、水浴锅、电炉玻璃漏斗、铁架台、圆形滤纸、滴管离心机、离心管第一百零七页，共244页。实验试剂

1％蔗糖溶液、1％棉子糖溶液、1％淀粉溶液

Benedict试剂：柠檬酸钠173克和无水碳酸钠

100克溶于蒸馏水约800mL中，冷后慢慢倾入

17.5克结晶硫酸铜100mL，边加边摇，然后加蒸馏水至1000mL。混匀备用。若浑浊可过滤试剂可长期保存。鲜酵母、甲苯、硅藻土、5%氨水第一百零八页，共244页。实验操作

酵母蔗糖酶提出液制备鲜酵母1.2克甲苯3000转/min保留沉淀加蒸馏水1.5ml,甲苯0.2ml混匀30℃水浴过夜混匀醋酸调pH3.5～4.53000转/min取上清液加硅藻土混匀、过滤氨水调pH到5，置4℃冰箱备用1-2ml取滤液酵母液化离心10min离心10min第一百零九页，共244页。

准备稀释唾液（淀粉酶的来源）提取：用蒸馏水漱口然后含约5ml蒸馏水轻漱1-2min过滤：稀释：将口腔中的酶提取液用一层脱脂棉过滤取滤液1mL，用水定容至100mL。作为淀粉酶的样品液第一百一十页，共244页。

取大试管6支按表加入试剂管号试剂1234561％蔗糖溶液10滴－－10滴－－1％棉子糖溶液－10滴－－10滴－1％淀粉溶液－－10滴－－10滴蔗糖酶液5滴5滴5滴－－－稀释唾液－－－5滴5滴5滴第一百一十一页，共244页。每管混匀后置于38℃恒温水浴中保温30钟，另取大试管6支，每支试管中加Benedict试剂1mL加热煮沸后，分别将保温后的试管中液体加入之，继续煮沸2分钟，放试管架上冷却第一百一十二页，共244页。注意事项

电炉使用注意安全添加Benedict试剂时要缓慢加入，不能搅动酶解溶液液面

调pH值时要准确无误，酸、碱都要逐滴加入

要规范操作离心机第一百一十三页，共244页。实验结果与讨论解释实验结果观察并记录结果第一百一十四页，共244页。思考题

实验中待测酶液和底物为什么要预先保温？将酶煮沸10分钟，然后分别加入相应的蔗糖溶液、棉子糖溶液和淀粉溶液会有什么结果？返回目录第一百一十五页，共244页。返回目录实验六

醋酸纤维薄膜电泳分离

血清蛋白质第一百一十六页，共244页。实验目的

学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理第一百一十七页，共244页。实验原理电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。在一定pH条件下，不同的质点由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可使它们分离。第一百一十八页，共244页。实验器材稳压电源卧式电泳槽

DYY-2型电泳仪第一百一十九页，共244页。醋酸纤维薄膜（2cm×8cm）：1片/人。培养皿：共4套，包括染色各用1套，漂洗用3套。点样器：2人公用1个。滤纸：公用。表面皿：公用镊子：1个/组。第一百二十页，共244页。脱色摇床第一百二十一页，共244页。实验试剂

巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.07）染色液（氨基黑10B）漂洗液第一百二十二页，共244页。浸泡：将2×8cm醋酸纤维薄膜迎着光辨别光泽面和无光泽面。将之置于盛有缓冲液的平皿中，浸泡30min方可用于点样实验操作第一百二十三页，共244页。点样：用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液，然后平铺在桌子上（毛面朝上）。在表面皿上滴一滴血清，点样器在血清上蘸一下，再将点样器轻印在距离膜边缘1.5cm处，使血清渗透到薄膜内，形成均匀的直线第一百二十四页，共244页。电泳装置的准备

电泳仪由电泳槽和稳压电源两部分组成，两者之间有专门的连线连接。

电泳槽的正负极各有一个装缓冲液的槽，红色为正极，黑色为负极。根据电泳槽膜支架的宽度，裁剪尺寸合适的滤纸条制作滤纸桥第一百二十五页，共244页。上样电泳：时间45min

染色：时间3min

漂洗：漂洗三次（每次10min第一百二十六页，共244页。上样电泳：时间45min

染色：时间3min

漂洗：漂洗三次（每次10min)第一百二十七页，共244页。上样电泳：时间45min

染色：时间3min

漂洗：漂洗三次（每次10min)第一百二十八页，共244页。实验结果第一百二十九页，共244页。薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一选择何种浓度与样品和薄膜的厚薄有关点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，但不宜太干点样时，动作要轻、稳，用力不能太大电泳时应选择合适的电压，一般稳压在为110V注意事项第一百三十页，共244页。正常参考值清蛋白 57.45-71.73%a1-球蛋白 1.76-4.48%a2-球蛋白 4.04-8.28%β-球蛋白 6.79-11.39%γ-球蛋白 11.85-22.97%第一百三十一页，共244页。临床意义急慢性肾炎、肾病综合症、肾功能衰竭时，清蛋白降低，a1、a2和β球蛋白升高；慢性活动性肝炎、肝硬化时清蛋白降低，β、γ-球蛋白升高；慢性炎症时，清蛋白降低，a2、γ-球蛋白升高；红斑狼疮、类风湿关节炎时，清蛋白降低，γ-球蛋白显著升高；多发性骨髓瘤时，清蛋白降低，γ-球蛋白升高，于β、和γ-球蛋白区带之间出现“M”带第一百三十二页，共244页。电泳时，血清样品点在支持介质的哪一端，为什么？电泳图谱清晰的关键是什么？思考题返回目录第一百三十三页，共244页。返回目录实验七

聚丙烯酰胺凝胶电泳

分离血清蛋白质第一百三十四页，共244页。电泳是指带电粒子在电场的作用下，向与其所带电荷相反的电极泳动的现象。电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。实验原理第一百三十五页，共244页。

聚丙烯酰胺凝胶电泳采用不连续系统（即缓冲液成分、pH及凝胶孔径不连续）聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过浓缩效应、分子筛效应、电荷效应，将血清中各蛋白质成份依其分子大小、电荷多少不同而进行高效分离。第一百三十六页，共244页。以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，凝胶是单体聚丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）交联而成的，催化剂为过硫酸铵（AP），加速剂为四甲基乙二胺（TEMED）,形成三维网状凝胶聚丙烯酰胺凝胶（PAG）的聚合反应：第一百三十七页，共244页。缓冲液离子成分、PH的不连续性：电极缓冲液pH=8.3，甘氨酸为慢离子；浓缩胶中的氯离子为快离子；蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳时，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，蛋白质夹在中间而被压缩浓缩效应

第一百三十八页，共244页。成分pH值孔径电泳缓冲液甘氨酸(慢离子)8.3样品蛋白质6.7浓缩胶Cl-(快离子)6.7大分离胶Cl-(快离子)8.9小有效迁移率=迁移率解离度第一百三十九页，共244页。第一百四十页，共244页。分子筛效应分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。电荷效应 电荷量不同，迁移率不同。第一百四十一页，共244页。实验仪器

电泳装置稳压电源盘状电泳槽第一百四十二页，共244页。毛细滴管刻度吸量管第一百四十三页，共244页。灯泡瓶玻璃管和橡胶帽第一百四十四页，共244页。培养皿微量移液器第一百四十五页，共244页。脱色摇床注射器和长针头第一百四十六页，共244页。实验试剂丙烯酰胺(Acr)和甲叉双丙烯酰胺(Bis)Acr的重结晶Bis重结晶（注意固体Acr和Bis应贮存应贮存棕色瓶中，在干燥、低温和暗处保存，并注意避免超声波、γ-辐射和自然光的照射）第一百四十七页，共244页。

TEMED-四甲基乙二胺，避免冰箱保存。过硫酸铵(不能潮解，否则不能用)

染色液：用0.05NNaOH配制0.1％溴酚兰液洗脱液：7％醋酸其他试剂：见下表贮存液的配制。按表1配制各贮存液置冰箱中贮存，可放1—2月（但过硫酸铵液贮存冰箱不能超过一周）。第一百四十八页，共244页。贮存液100ml溶液中的含量pH工作溶液配制的体积比11NHCl48.OmlTris36.6克TEMED0.23ml8.9分离胶制备：1份1号，2份2号，1份水；抽气后加入4份3号凝胶浓度7％pH8.92Acr28.0克Bis0.725克3过硫酸铵0.14克41NHCl48.OmlTris5.98克TEMED0.46ml6.7浓缩胶制备：1份4号，2份5号抽气后加入4份6号凝胶浓度2.5％pH6.75Acr10.0克Bis2.5克6蔗糖40.0克7电泳槽缓冲液：Tris0.60克甘氨酸2.88克8.3用时可稀释10倍500ml可供12根电泳管第一百四十九页，共244页。实验步骤

每人取电泳管1支，标好号码，橡胶帽堵住底部，加1-2滴40％蔗糖于底端。分离胶制备：10人一组。吸取：1号2ml，2号4ml，水2ml，在桑玻氏管中混匀；用真空泵抽气至无气泡为止；抽气后加3号8ml，混匀备用（可灌胶12支）。第一百五十页，共244页。分离胶的灌制用毛细滴管灌胶于电泳管中，高约8cm，然后在距胶面约1cm处，沿玻管壁缓缓加入3-5mm高的水层，垂直静置凝胶让它进行聚合反应。聚合时可见原来加入水层出现的界面逐渐消失，继又出现界面时，表明凝胶已经聚合，再静置15分钟使之聚合完全(应在30—60分钟内聚成)。第一百五十一页，共244页。

样品液制备：血清：1-2滴40%蔗糖：1滴于一小试管中混匀备用0.05%溴酚兰：1滴待分离胶成胶后(重新出现界面15分钟)用滤纸条吸干上层覆盖水第一百五十二页，共244页。

浓缩胶制备，10人一组。

4号：1ml吸取：

5号：2ml在桑玻氏管中混匀,真空泵抽至无气泡为止。

6号；4ml

抽气后加3号1ml，混匀备用。用玻璃滴管灌浓缩胶于分离胶上，高约1～1.5cm，然后小心覆盖蒸馏水高约0.5cm，垂置放置，待其成胶第一百五十三页，共244页。待浓缩胶成胶后，用滤纸条吸干上层覆盖水，拔去底端玻棒塞，用滤纸条吸干蔗糖液，将胶管套在橡皮塞中，并装至电泳槽内，然后倒入上、下槽电泳缓冲液，并用缓冲液灌满胶管底部的空隙，排净空气上样：用微量加样器吸样品液50ul，加在浓缩胶上第一百五十四页，共244页。

电泳：上槽——负极下槽——正极注：下电极槽可设计为夹层，需要时可通入冷水降温电流：开始三分钟1.5mA/管三分钟后2.5mA/管第一百五十五页，共244页。

凝胶取出(剥胶)。电泳毕，取下电泳玻管，用一长针头注射器(针头长约6～8厘米)，吸满蒸馏水为润滑剂，将针头插入玻管内壁和凝胶柱表面之间，缓缓旋转玻管，一边注水，一边使针头慢慢呈螺旋式推进。最后可用洗耳球在玻管浓缩胶端轻加压力，就可将凝胶柱压出玻管。固定和染色：固定（可和染色同时进行）染色：0.1％溴酚兰碱性液第一百五十六页，共244页。第一百五十七页，共244页。实验结果+—观看结果，描出血清电泳区带图谱，确定清蛋白有无异常。第一百五十八页，共244页。

丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。制胶时，要充分摇匀，加速剂TEMED最后加。注意观察实验现象：分界面，浓缩效应.

氨基黑染色﹑脱色﹑染液回收。固体胶切忌倒入水池。注意事项第一百五十九页，共244页。思考题圆盘电泳的分辨率为什么比其他电泳高？圆盘电泳的分子筛效应与凝胶过滤的分子筛效应原理上有何不同？圆盘电泳灌胶时表面要加盖一层水，为什么？返回目录第一百六十页，共244页。返回目录实验八

酵母RNA的提取及

成分鉴定（浓盐法）第一百六十一页，共244页。实验目的

掌握浓盐法提纯RNA的基本原理和方法了解RNA成分鉴定的原理及其方法第一百六十二页，共244页。实验原理核酸的分类与分布DNA：主要存在于细胞核的染色体中,线粒体、叶绿体、质粒有少量

RNA：存在于细胞质中除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。第一百六十三页，共244页。

核酸制备破碎细胞提取纯化I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质

V.核酸溶解在适量缓冲液或水中第一百六十四页，共244页。RNA以可溶性钠盐的形式游离析出离心去除菌体,收集上清液部分,调至RNA的等电点（pH2～2.5）使RNA沉淀析出，离心收集沉淀乙醚洗涤沉淀、去除杂质、提纯RNA浓盐加热使酵母细胞壁破裂，蛋白质变性沉淀

RAN提取方法(浓盐法)第一百六十五页，共244页。

RNA成分鉴定RNA在强酸性条件下沸水浴加热可以水解：第一百六十六页，共244页。磷酸鉴定通过鉴定RNA的三种水解产物来鉴定RNA第一百六十七页，共244页。碱基(嘌呤)鉴定第一百六十八页，共244页。核糖鉴定第一百六十九页，共244页。仪器试剂仪器学生实验仪器一套、精密pH试纸（pH0.5～5.0），广泛pH试纸（pH1～14）、冰块、锥形瓶（100mL×1）、离心管水浴锅、天平、电炉干酵母、10％NaCl、6MHCl、乙醚、冰块、5％氨水、(NH4)2SO4试剂第一百七十页，共244页。实验操作酵母RNA提取酵母破壁：取干酵母一包（约1.2g）于100mL锥形瓶内，加入10％NaCl溶液25mL，搅匀后置沸水浴中加热40分钟。

第一百七十一页，共244页。取出锥形瓶自来水冷却后转入入离心管3000rpm离心10min取上清离心分离RNA第一百七十二页，共244页。

沉淀提纯RNA

将上清液转入50mL烧杯冰浴中冷却调pH值至2.0～2.5(RNA等电点)冰浴中静置10min3000rpm离心10min收集沉淀乙醚洗涤沉淀2～3次第一百七十三页，共244页。

RNA成分鉴定溶解RNA

水解RNA

检验RNA的各个成分

核糖鉴定嘌呤鉴定磷酸鉴定第一百七十四页，共244页。实验结果

1231号：磷酸鉴定（蓝色）2号：碱基鉴定（红棕色）3号：核糖鉴定（蓝绿色）第一百七十五页，共244页。思考题在酵母破壁时为什么只能水煮沸了以后再放入装有酵母和10%NaCl的三角瓶？本实验中两次调pH值的目的分别是什么？返回目录第一百七十六页，共244页。返回目录实验九

葡萄糖氧化酶法测定

血清葡萄糖第一百七十七页，共244页。实验目的学习和掌握葡萄糖氧化酶法测定血糖含量的方法熟悉酶法测定血液中葡萄糖糖浓度的原理掌握测定血糖的临床意义第一百七十八页，共244页。实验原理葡萄糖﹢O2H2O2葡萄糖醛酸﹢葡萄糖氧化酶（GOD）H2O2﹢4-氨基安替比林过氧化物酶（POD）H2O醌亚胺染料﹢第一百七十九页，共244页。

红色醌亚胺染料在500nm处具有吸收峰

采用标准对比法可计算得到样品中葡萄糖浓度

本法测得人血糖的正常值为

3.89～6.11mmol/L

红色醌亚胺染料的生成量与葡萄糖含量成正比第一百八十页，共244页。实验器材试管1.5×5cm（×3）、试管架吸量管2mL（×1）、洗耳球微量加样器：20μl的Pipetman恒温水浴箱离心机、离心管10ml（×2）第一百八十一页，共244页。实验试剂葡萄糖测定试剂盒：原装试剂在2～8℃避光保存，有效期15个月。混合后2～8℃可稳定1个月，室温可稳定3天葡萄糖标准液：100mg/Dl(5.55mmol/L)实验样品：新鲜无溶血血清第一百八十二页，共244页。实验操作

酶工作液配置

标本处理抽取全血5ml37℃保温10分钟3000转/min离心15min取上清液备用第一百八十三页，共244页。

取小试管3支按表加入试剂管号试剂空白管标准管待测管标准葡萄糖（μl

）－10－待测血清（μl

）－－10酶工作液（ml）1.51.51.5各管加好后，混匀，置37℃水浴10min，0.5cm光径比色杯在500nm波长下比色第一百八十四页，共244页。说明理论上空白管应再加入10μL蒸馏水才能与其它各管溶液体积一致，但是10μL体积对总体积影响很小，故不精确加入亦可

10μL液体不易精确加入，实验时要仔细检查移液枪的密封性。此外，移液枪外壁沾有的少许残留液体也要用滤纸小心吸干第一百八十五页，共244页。注意事项标准液吸取后应立即上盖，以防水分挥发液体混浊或有絮状物视为失效本法特异性高，维生素C，谷胱甘肽，左旋多巴引起负偏差

10μl液体必须全部溶于1.5ml酶工作液中第一百八十六页，共244页。实验结果与讨论计算结果记录结果A标=标准管吸光度A待=待测管吸光度

C待=A待A标×C标C待=血液中葡萄糖浓度C标=标准液中葡萄糖浓度第一百八十七页，共244页。思考题

正常人的血糖为什么能维持在一定水平?胰岛素和肾上腺素对血糖有何影响?

为什么?本试验测定血糖的基本原理是什么?在那些情况下需做血糖含量的测定?

返回目录第一百八十八页，共244页。实验十

聚合酶链式反应(PCR)返回目录第一百八十九页，共244页。实验目的

了解PCR的基本原理学习PCR的基本操作技术第一百九十页，共244页。实验原理聚合酶链式反应：

polymerasechainreaction(PCR),又称体外DNA扩增技术。近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术第一百九十一页，共244页。

PCR的基本原理产物：数量呈指数级上升的目的DNA片段模板：拟扩增的DNA分子引物：一对分别与模板5’末端和3’末端互补的寡核苷酸片段酶：DNA聚合酶遵循半保留复制的机制第一百九十二页，共244页。

PCR反应三步曲变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C第一百九十三页，共244页。5Primer15Primer2Cycle2Cycle155

55

5

5TemplateDNA55

555

5

55PCR反应流程第一百九十四页，共244页。Cycle355

555

5

555

5

55

555

525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上第一百九十五页，共244页。实验器材与试剂

待扩增的模板DNAPCR仪，电泳仪，电泳槽，台式离心机，紫外检测仪，移液器，离心管，Tip头等

dNTPs，Taq酶，引物，10×PCRReactionBuffer，ddH2O第一百九十六页，共244页。PCR仪第一百九十七页，共244页。

PCR反应体系的五要素引物酶（TaqDNApolymerase）

dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)

模板

Mg2+第一百九十八页，共244页。

PCR标准反应体系

10×扩增缓冲液 10μl

4种dNTP混合物 各200μmol/L引物 10～100pmol

模板DNA 0.1～2μg

TaqDNA聚合酶 2.5μl

(Mg2+)

1.5mmol/L加双蒸水至 100μl第一百九十九页，共244页。

PCR扩增(25l反应体系)

实验步骤

取一0.5mlEp管，依次加入下列试剂:

双蒸水 12l

10×buffer 2.5l

25mmol/LMg2+

2.5l4×dNTP 2.0l

10umol/L引物1 2.0l

10umol/L引物2 2.0l

模板DNA 1lTaqDNA多聚酶 1.0l

25.0l第二百页，共244页。设定循环程序，于PCR仪上反应：94℃30s55℃1min72℃1min

72℃5~10min

94℃3min轻弹管壁混匀液体，瞬时离心使管壁上液体沉至管底30×预变性终延伸第二百零一页，共244页。制备1.0%的琼脂糖凝胶

PCR产物的检测第二百零二页，共244页。

5μlPCR产物﹢1μl上样缓冲液点样于琼脂糖凝胶加样孔中100V电泳30~60分钟紫外灯下观察扩增结果第二百零三页，共244页。第二百零四页，共244页。一切器具均经高压灭菌，保证没有核酸和核酸酶的污染各试剂小份分装，-20℃保存，现用现取酶的取用不离开冰浴取液吸头、离心管均一次性使用，及时更换

操作注意事项第二百零五页，共244页。电泳结果有无目标条带出现，可判别+/-结果；根据条带宽度和亮度，可直观判断扩增产量；关于PCR假阴性、假阳性及非特异扩增问题。实验结果第二百零六页，共244页。ratbeta-nervegrowthfactorsequence5’-301gttctacactctgatcacagcgtttttgatcggcgtacag

gcagaaccgtacacagagat361caatgtcccagagggagactctgtccctgaagaccactggactaaacttcagcattccct421ctgacacagccctacgcagagcccgcagtgcccctgctgaaccaatagctgcccgtgtgac481agggacgacccgcaacatcactgtggaccccaaactgtttaagaaacgga

gactccgttc541

accccgcgtgctgtttagcacccagcctcccaaactgtttaagaaacggagactccgttc-3’

例如：PCR扩增NGF基因（大鼠）预期扩增长度：220bpPerim1:5’-gatcggcgtacaggcagaac-3’（328-347）Perim2:3’-cgcggggtgaacggagtctc-5’（529-548）第二百零七页，共244页。

NGF←500bp←200bp←100bp220bp→

电泳结果

空白

Mark第二百零八页，共244页。

PCR的反应特点特异性强灵敏度高简便、快速对标本的纯度要求低

实验讨论第二百零九页，共244页。关于PCR假阴性、假阳性问题每组PCR都要设立阴性对照(不加模板)，以检测有无污染每组PCR都要设立阳性对照(加肯定的DNA)，以检测PCR的效率通过重复实验、改善反应条件等排查假阴性假阳性多是模板DNA污染的问题，查实后须更换所有试剂第二百一十页，共244页。

引物特异性、纯度、Tm值模板纯度、二级结构退火温度（时间）反应体系中的dNTP、Mg2+、Taq酶浓度关于PCR非特异性扩增问题第二百一十一页，共244页。长度在15-30bp，GC含量在45-55%之间碱基分布表现出随机性，避免相同碱基连续排列3’不能与引物内部互补，以免形成二级结构两个引物各自的3’不能互补，以免形成自身扩增引物必须经GenBank查询