工业微生物的学习课件

工业微生物的学习课件第1页/共45页微生物遗传变异与育种第五节工业微生物育种第2页/共45页

微生物育种的目的就是利用微生物遗传学的原理和方法，人为地在DNA水平解除或突破微生物的代谢调节控制，使某种代谢产物过量积累，把生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导，或者促使细胞内发生基因的重新组合优化遗传性状，实现人为控制微生物，获得我们所需要的高产、优质和低耗的菌种。微生物育种的方法目前主要是利用诱变、杂交、原生质体融合技术以及基因工程等方法改造或构建我们所需要的菌株。第3页/共45页

主要内容工业微生物的诱变育种工业微生物代谢调节控制育种工业微生物杂交育种原生质体融合育种基因工程第4页/共45页1工业微生物的诱变育种诱变育种：是指利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变频率大幅度提高，然后设法采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学实验之用。当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎都是通过诱变育种而大大提高了生产性能的。故诱变育种仍是目前使用最广泛的育种手段之一。第5页/共45页选择合适的出发菌株制备待处理的菌悬液诱变处理筛选保藏和扩大试验诱变育种的基本过程如下第6页/共45页1.1出发菌株的选择出发菌株就是用于育种的原始菌株。合适的出发菌株具有特定生产性状的能力或潜力。出发菌株选择目前主要依据如下实际经验：1）以单倍体纯种为出发菌株，可排除异核体和异质体的影响。2）采用具有优良性状的菌株，如生长速度快、营养要求低下以及产孢子早而多的菌株。3）选择对诱变剂敏感的菌株。由于有些菌株在发生某一变异后，会提高对其他诱变因素的敏感性，故可考虑选择已发生其他变异的菌株为出发菌株。4）许多高产突变往往要经过逐步累积的过程，才变得明显，所以有必要多挑选一些已经过诱变的菌株为出发菌株，进行多步育种，确保高产菌株的获得。第7页/共45页1.2制备单孢子（或单细胞）悬液诱变育种要求所处理的细胞必须是处于对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液。首先是细胞的生理状态对诱变处理也会产生很大的影响。如细菌在对数期诱变处理效果较好。其次是分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落。由于在许多微生物的细胞内同时含有几个核，所以即使用单细胞悬浮液处理，还是容易出现不纯的菌落。由于不同种类的微生物形态特性差别，获得的单细胞悬液的方法也需具有针对性。在实际工作中，要得到均匀分散的细胞悬液，通常可用无菌的玻璃珠来打散成团的细胞，然后再用脱脂棉或滤纸过滤。第8页/共45页1.3诱变处理诱变处理主要采用物理诱变剂和化学诱变剂。目前常用的诱变剂主要有紫外线、硫酸二乙酯、N-甲基-N，-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）和亚硝基甲基脲（NMU）等。后两种因有突出的诱变效果，所以被誉为“超诱变剂”。各种诱变剂有不同的剂量表示方法，如紫外线的强度是尔格，化学诱变剂的剂量则以在一定温度下诱变剂的浓度和处理时间来表示。但是仅采用诱变剂理化指标控制诱变剂的用量常会造成偏差，不利于重复操作。在育种实践中，常采用致死率来作各种诱变剂的相对剂量。致死率表示诱变剂造成菌悬液中死亡菌体数占菌体总数的比率。它是最好的诱变剂相对剂量的表示方法，因为它不仅反应了诱变剂的物理强度或化学浓度，也反映了诱变剂的生物学效应。第9页/共45页诱变剂的作用：1）提高诱变的频率2）扩大产量变异的幅度3）使产量变异向正变（即提高产量的变异）或负变（即降低产量的变异）凡在高诱变率的基础上既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变范围的剂量，就是合适的剂量。要确定一个合适的剂量，通常要进行多次试验。在诱变育种工作中，目前比较倾向采用较低的剂量。诱变育种中还常常采取诱变剂复合处理，使它们产生协同效应。诱变剂的复合处理常呈现一定的协同效应，复合处理方式可以灵活多变，可以是两种或多种诱变剂的先后使用，或是同一种诱变剂的重复使用，或是两种或多种诱变剂的同时使用。第10页/共45页2工业微生物代谢调节控制育种

随着生物合成代谢途径、代谢调节控制的的基础理论以及分子遗传学的研究深入，人们可以通过突变或分子生物学方法，定向选育某种特定的突变型，以达到大量积累有益产物的目的，即所谓代谢控制育种。控制代谢的有效途径往往就是改变微生物的遗传型，代谢控制育种可以大大减少传统育种的盲目性，提高了效率。代谢调节控制育种主要是通过特定突变型的选育，达到改变代谢通路、降低支路代谢终产物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜的透性，使代谢流向目的产物积累方向进行。如下表列出微生物代谢控制育种措施。第11页/共45页

调节体系

育种设施诱导组成型突变株反馈阻遏反馈抑制营养缺陷型突变株渗漏缺陷型突变株抗终产物结构类似物突变株细胞膜渗透性生物素缺陷型突变株油酸缺陷型突变株甘油缺陷型突变株微生物代谢调控育种设施第12页/共45页3工业微生物杂交育种杂交（hybridization）育种包括常规杂交、控制杂交和原生质体融合等方法。进行体内基因重组育种的其他方法包括接合、转化、转导等。杂交育种的优点：

1）不同遗传性状菌株的杂交，使两亲株的优良性状集中于重组体内，获得新品种。

2）杂交获得的新遗传特性重组体，可克服因长期诱变造成的活力下降、代谢缓慢等缺陷，提高对诱变剂的敏感性。微生物杂交的本质是基因重组，但是不同类群微生物生物导致基因重组的过程不完全相同。细菌和放线菌由于细胞核结构大致相同，基因重组过程也相似，杂交过程是两个亲本菌株细胞间接合，染色体部分转移，形成部分结合子，经交换、重组产生重组体；真菌是通过有性生殖或准性生殖来完成的，真菌中半知菌纲是微生物准性生殖中最典型的一类微生物。第13页/共45页

微生物杂交育种一般程序：

选择原始亲本诱变筛选标记亲本

双亲本杂交

筛选重组体重组体分析鉴定第14页/共45页AB标记亲和力A[A+B-]标记亲和力B[A-B+]双亲本杂交AB[A+B+]AB

微生物杂交程序第15页/共45页3.1亲本菌株的选择原始亲本是微生物杂交育种中具有不同遗传背景的优质出发菌株，主要根据杂交的目的来选择。从育种角度出发，通常选择具有优良性状如产量高、代谢快、产孢子能力强、无色素、泡沫少、粘性小等发酵性能好的菌株为原始亲本。它们可以来自生产用菌或诱变过程中的某些符合要求的菌株，也可以是自然分离的野生型菌株。原始亲本还应该具有野生型遗传标记，如具有一定的孢子颜色、可溶性色素或抗性标记等明显不同的性状。第16页/共45页3.2标记亲本菌株由于杂交于育种重组频率极低，为10-7左右，杂交后的混合体系中除了极少数重组体外，还存在大量的为杂交亲本及无效杂交后代，增加重组体筛选难度。一般杂交本用营养缺陷型或抗药性突变型等遗传标记，作为选择重组体的标准和依据。第17页/共45页3.3杂交育种的方法常规杂交主要包括接合、转化、转导、溶原转换和转染等技术，它们的特点如下表：微生物类别杂交方式供体与受体细胞关系参与交换的遗传物质原核微生物接合转化转导体细胞间暂时沟通细胞不接触，吸收游离DNA片段细胞间不接触，质粒、噬菌体介导部分染色体杂合个别或少数基因杂合个别或少数基因杂合真核微生物有性生殖准性生殖生殖细胞融合或接合体细胞接合整套染色体高频率重组整套染色体低频率重组第18页/共45页

微生物杂交育种尤其在酵母的育种中广泛应用。酵母菌中具有单倍体和二倍体的生活史，存在孟德尔式分离现象，以及α和a交配型。因此通过杂交达到重组的目的。在有些真菌中常用准性生殖获得优良菌株，即将具有不同优良性状的二种菌株进行杂交，首先获得异核体，然后通过诱变剂（如UV、亚硝酸等）处理提高其形成杂合二倍体的频率，并进而用低浓度的对氟苯丙氨酸或多菌灵等处理，促进单元化过程，最后在平板中挑取扇形角变得菌落孢子，即为单倍体分离子，经进一步筛选，从中获得所需要的优良菌株。第19页/共45页原生质体融合定义：通过人工的方法，使遗传性状不同的两个细胞的细胞壁去除，采用物理、化学或生物学方法诱导它们的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的重组子的过程。能进行原生质体融合的细胞是极其广泛的，不仅包括原核生物，而且还包括各种真核细胞。此外原生质体融合技术还可用于研究细胞质遗传、核质关系等问题，因此原生质体融合技术在生产实践及理论研究上均有具有重要意义。第20页/共45页原生质体融合的优越性在于：

1）它打破了微生物的种属界限，可以实现远缘菌株的基因重组。1981年Yamada有PEG诱导酵母原生质体与细菌细胞成功的融合，并使其固氮作用或光合作用实现了不稳定的表达。

2）原生质融合可使遗传物质传递更为完整、获得更多基因重组体的机会，有利于提高育种速度。

3）重组频率较高由于原生质体没有细胞壁的阻碍，而且在原生质体融合时又加入了融合促进剂PEG或采用电融合技术，所以微生物原生质体间的杂交频率都明显高于常规杂交方法。

4）受接合型或致育性的限制小由于两亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。

不足之处是原生质体融合后DNA交换和重组随机发生，增加重组体分离筛选的难度。此外细胞对异体染色体的降解和排斥作用以及遗传物的非同源性等影响原生质体融合的重组频率，使远缘杂交存在较大难度。第21页/共45页原生质体融合的一般原理和过程选择亲株制备原生质体原生质体融合原生质体再生筛选优良性状的融合子第22页/共45页4.1亲本及其遗传标记的选择在原生质体融合的过程中，通常所用的亲株均要有一定的遗传标记以便于筛选。融合亲株获得遗传标记的方法可采用常规的诱变育种的方法，一般可以以营养缺陷和抗药性等遗传性状为标记。注意标记必须稳定。每个亲株都各带有两个隐性性状的营养缺陷标记就可以排除融合子回复突变的可能。当然，最好选择对菌株生产性能没有影响的标记。特别是对于工业生产菌来说，用诱变方法获得标记，往往对该菌株的生产性能影响甚大。因此，在选择标记时，尽可能采用该菌株自身已带的各种遗传标记。第23页/共45页4.2原生质体的制备制备原生质体是保证实现原生质融合技术的关键。而要获得有活力和去壁较为完全的原生质体是原生质体融合育种技术的先决条件。根据微生物细胞组成和结构的不同，需要分别采用不同的酶，如在细菌和放线菌中制备原生体主要采用溶菌酶，在酵母菌和霉菌中一般可用蜗牛酶和纤维素酶。有时需要结合其他一些措施，如在生长培养基中添加甘氨酸、蔗糖或抗生素等，以提高细胞壁对酶解的敏感性。第24页/共45页微生物细胞壁主要成分去壁方法革兰氏阳性菌芽孢杆菌葡萄球菌链霉菌小单孢菌肽聚糖溶菌酶处理溶葡萄球菌素处理溶菌酶处理（菌丝生长时补充0.5%-5.0%甘氨酸或10%-34%蔗糖）溶菌酶处理（菌丝生长时补充0.2%-0.5%甘氨酸革兰氏阴性菌大肠杆菌碱性普罗委登斯菌黄色短杆菌肽聚糖和脂多糖溶菌酶和EDTA处理溶菌酶和EDTA处理溶菌酶处理（生长时补充0.41mol/L蔗糖及0.3U/ml青霉素）霉菌纤维素和几丁质纤维素酶或真菌中分离的溶壁酶酵母菌葡聚糖和几丁质蜗牛酶工业微生物的去壁方法第25页/共45页影响原生质体制备的因素有很多，主要有以下几方面：1）菌体的前处理：为了使酶的作用效果更好，可对菌体作一些前处理2）菌体培养时间：为了使菌体细胞易于原生质化，一般选择对数生长期的菌体。3）酶浓度：对于不同种属的微生物来说，不仅对酶的种类要求不同，就是酶的浓度也有差异。4）酶解温度：在选择最佳酶解温度时，除了要考虑酶的最适温度外，还要对原生质体再生率加以校正。5）酶解时间：选择合适的酶解时间6）渗透压稳定剂：渗透压在原生质体制备中，不仅起到保护原生质体免于膨胀作用，而且还有助于酶和底物的结合。此外，破壁时的pH、培养基成分、培养方式、离子强度和种类等对原生质体的形成亦有一定的影响。第26页/共45页细胞壁溶解后，原生质体即以球状体的形态开始释放。由于原生质体比菌体细胞对渗透压更为敏感，所以在蒸馏水这样的低渗溶液中即可立即破裂，在一般培养基平板中也无法形成菌落。根据这一原理，原生质体形成率可按下式进行计算：原生质体形成率=破壁前菌数-剩余菌数

破壁前菌数×100%第27页/共45页4.3原生质体融合原生质体融合方法

主要有生物助融（通过病毒聚合剂如仙台病毒等病毒和某些生物提取物等使原生质体融合）、物理助融（离心沉淀、电脉冲等）、化学助融（通过化学助融剂如PEG加Ca2+）。影响原生质体融合的因素主要有融合剂的浓度、作用时间、阳离子浓度及pH等，更为重要的是亲株本身特性的选择以及原生质体的活力。一般使用25%--40%的PEG。另外，紫外线照射或脉冲电场等物理因素处理也能促进原生质体融合。第28页/共45页4.4原生质体再生是指去壁后的原生质体能重建细胞壁，恢复细胞完整形态，并能生长、分裂的过程。这是原生质融合育种的必要条件。通常在原生质体融合前要测定原生质体的再生率，以此分析其融合率不高是由于双亲株原生质体本来就没有活性或再生率低，还是由于融合条件不适所致。因此测定原生质体形成率和再生率不仅可作为检查、改善原生质体形成和再生条件的指标，也是分析融合实验结果，改善融合条件的一个重要指标。第29页/共45页

为了获得较高的再生率，在实验过程中应避免因强力使原生质体破裂。再生平板培养基在涂布原生质体悬液前，宜预先去除培养基表面的冷凝水。涂布时，原生质体悬液的浓度不宜过高。因为若有残存的菌体存在，它们将会率先在再生培养基中长成菌落，并抑制周围原生质体的再生。原生质体再生率如下进行计算：原生质体再生率=再生菌数–剩余菌数破壁前菌数–剩余菌数×100%第30页/共45页微生物种类再生培养基主要成分枯草芽孢杆菌蔗糖0.5mol/L，顺丁烯二酸0.02mol/L，

MCl2·6H2O0.02%mol/L钝齿棒杆菌丁二酸钠135g，MgCl2·6H2O2g，EDTA1.9g弗氏链霉菌

蔗糖12.5%，CaCl2·2H2O0.368%，

MgCl2·6H2O0.51%霉菌蔗糖0.3—0.5mol/L（或琥珀酸钠0.55mol/L），MgCl2·6H2O0.05mol/L，CaCl2·2H2O0.025mol/L，KCl0.4--0.8mol/L，NaCl0.3—1.0mol/L酵母菌多种糖及糖醇

常用的微生物再生培养基主要成分第31页/共45页4.5融合子的检出与鉴定

原生质体融合育种的主要目的在于迅速准确地检出各种类型的融合子，并通过鉴定、筛选等步骤，及时选出稳定高产的融合子。①融合子的检出直接检出法

将融合液涂布于无双亲株生长所必要的营养物或存在抑制双亲生长的抑制物的再生平皿上，直接筛选出原养型重组子。间接法

用影印法②融合子的鉴定

经过传代选出稳定融合子，可从形态学、生理生化、遗传学及生物学等几方面进行鉴定。如菌落形态和颜色变化，代谢产物的产量，DNA含量分析等。第32页/共45页融合重组的频率可用下式表示：融合重组频率=

融合重组子两亲株原生质体再生菌落的总数×100%

原生质体融合技术的实际应用，其关键环节是准确地选出优良性能的融合子，而这个选择往往是上述几种方法相互配合使用。第33页/共45页5基因工程基因工程：指通过人工方法将目的基因与载体DNA分子连接起来，然后导入受体细胞，从而使受体细胞获得新的遗传性状的一种崭新的育种措施。第34页/共45页技术上的三大发明为基因工程提供了可能1、DNA的特异切割

1970年Smith和Wilcox等人从流感嗜血杆菌中分离出特异切割DNA的限制酶。从而为人们随意切割DNA提供了一把利剪。2、DNA连接酶的发现

1967年，世界上有五个实验室几乎同时发现了DNA连接酶，这种酶能够参与DNA裂口的修复。

3、基因工程的载体（质粒）的发现：从1946年起，LEDERBERG开始研究细菌的性因子--F因子，经过50年代和60年代，相继发现其它质粒，如抗药因子（R因子），到1973年COHEN将质粒作为基因工程的载体使用第35页/共45页5.1基因工程工具酶——限制性内切酶1)定义：是指能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割DNA的一类内切酶。2)命名和分类

命名是根据分离出此酶的微生物学名而定的。即取微生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成三个斜体字母加以表示。

如：E.coli中的E表示大肠杆菌属名第一个字母，co表示种名头两个字母，l表示株名，i表示该菌中第一个被分离出的酶。3)限制性内切酶的基本特性（1）形成粘性末端

（2）形成平末端常用限制酶的种类及切割方式切点出现的频率及片断大小第36页/共45页5.2核酸的提取操作和检测技术1）质粒DNA的提取

2）电泳和DNA紫外检测5.3基因工程的基本操作步骤1)目的基因的取得2)载体的选择3)目的基因与载体DNA的体外重组4)重组载体引入受体细胞5)表达筛选第37页/共45页染色体DNA或化学合成DNA酶切和连接克隆载体或表达载体重组载体宿主细胞转化扩增筛选重组体克隆定位诱变寡核苷酸鉴定、测序工程菌工程动物工程植物表达产物后处理优良品种选育

基因工程基本操作过程示意图第38页/共45页

目的基因的取得选择目的基因的途径有3种：1）

从适当的供体