各种生信入门及进阶诺禾的微生物测序指南

号。然而微小、简单，并不代表它们不重要。恰恰相反，我们周围的这些“小东西”，往往起千万的细菌存活，而共生微生物细胞数目更是高达细胞数的10倍。尽管很多时候不被它虽简，相重。些生，过染主，或动物病有微或刃剑，趋利避害，让微生物为我们所用。科研人员已经在这个领域进行了多年的探索，甚至还带一加，最的RRas编技，是胎细领的随着通术发展，成逐步低，通量速提，今我可用的成本，对微生物进行更深入和更广泛的研究。大规模的微生物因此应运而生，比如人类的NHanee）和eaesfemansalra），就是其中典型的例子。不论是人类环境、自然环境，还是病原研究、功能微生物，基于高通量 的研究成果不断涌现于各大期，其中不乏Nat，ee期。由于到术条的制我们难观整个境系组的同，每个生物进行精细的解析。而具体课题研究中，我们也往往会偏重其中一个领域，使微生物研究区分出了两个截然不同的视角：微生物群落多样性研究，及微生物和功能研究。目前，前者主的究术括增宏，者要用离养合学录学的策略。不同研究视角，让我们从微观和宏观两个方向，深入解析微生物的结构和功能，不断示生世的。以动研用为，禾物息技 于1年3月5在立了。企业组建了一支高水平的队伍，专注于开前沿分生物学技术和高性能计算技术在生命科学研究和人健康的用致于为球先的组产和务供。诺禾致源总部位于市海淀区学清路38号金码，办公面积4,500m2。技术中心位于市武清区，办公面积11,200m2，其中洁净面积约5,000m2，通过认证获批国家医疗机构执业证和医疗器械生产企业证。截止目前，我们已经拥有一个接近900人的强大服务团队，业务网络遍布国内主要城市，并设立有、和英国等海2012年起，诺禾致源通过CSPro认证，成为Illumina认可的提供商，迄今为止，我们已配置10台HiSeqX，10台HiSeq2500/2000，4台MiSeq，1台NextSeq5001台HiSeq4000，可 IlluminaCSPro认除了强大的平台，我们也建立了一套高性能的计算平台，以保证信息分析的需求。高达17TB的运行内存，73Tflops的浮点运算能力，3.2PB的资源，给我们及时、快速、稳定的信息分析服务提供了坚实的基础。自有分析平目 16S/18S/ITS扩增子产 宏组产 细菌 真菌 小 原核转录 宏转录 多组学结合研 附根据不同的研究目的和需求，诺禾致源提供4种扩增子产品：16SrDNA、18SrDNA、ITS及功能116SrDNA序18SrDNA：18SrDNA为编码真核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列。对18SrDNA某个高变区进序，218SrDNA序ITS：ITS分为两个区域：ITS1和ITS2，ITS1位于真核生物rDNA序列18S和5.8S之间，ITS2位于真核生rDNA序列5.8S和28S之间。对ITS1或ITS2进序，用于研究环境微生物中真菌群落结构多样性3ITSrDNA产品策指标周期目标区域扩增HiSeq25003w/5w/10w条36个自然备备DNA提取与PC扩化文 及HiSe上原原始数数据质Reads拼Tags过去嵌合OTU聚类及过物种注物种注释统物种多样性系统进化关物种丰度热物种累积曲Venn物种分类样品聚类分组间差异分多元统计分环境因子关联分T-test分MetastatLEfSe分※环境因子相关性分水体送样为过滤后的滤膜(最适滤膜直径3-4cm)；产物DNA5ng/μl；总量150ng；DNA明显主带，无降解，无RNA、蛋白质等杂质污染；产＜引物名引物序列（5’→ V3-10.1007/s00300-013-1410-V4-V4-10.1111/1758-真核生物10.1128/AEM.00057-ITS5-ITS2-ITS3-ITS4-图1门水平上各样本物种相对丰度柱形 图2各样品间共有和特有OTU分析图3丰度聚类热 图4多样品特定物种分类 图5PCA分 图6组间显著差异物种分图7CCA分析（群落结构分布相关环境因子 图8LEfSe分析（寻找显著差异研究热点涉及或动物生态及其疾病关联如肠道菌，皮肤菌群，腔菌群，胖、、等者肠性生化/的品在表1不同环境扩增子研究代表性文类文章信名时研究内低纤维饮食对肠道微生物的影通过控制人类肠道微生物的产物治疗动脉硬溃疡性结肠炎菌群动态变10.1136/gutjnl-2014-Cancer小鼠肠道微生物与肺癌的关Sci獭兔便型及体重与其细菌群落的关Sci墨西哥I型儿童患者肠道菌群失衡研草原微生物多样性及功能分玉米根系土壤微生物的群落多样性和遗传水稻根系微生物群落结南极下的微生物群落分Water饮用水细菌群落ISME活性污泥系统中微生物群落结构分微生物电池污泥的16S乳酸发酵液微生物群落结构分Food意大利腊肠中细菌结构研人类皮肤微生物多样哺乳动物尸体降解过程中微生物群落结构变AmJRespCritHIV者口腔和肺部微生物群 CellHost猕猴肠道黏膜微生物特酿酒葡萄表面微生物群Sci普洱茶内生菌多 本文利用16SV4研究了低纤维饮食和高纤维饮食的小鼠肠道微生物，研究发现低纤维饮食的小鼠肠道微生物群落丰富度较低，且转换为高纤维饮食后，仍有约1/3的菌种不能完全恢复，证实了饮食可以改变肠道微生物菌群。肠道微生物依赖于膳食纤维，随着纤维摄入量的减少，在肠道中生存的菌群也会减少，进行与微生物相关联的疾1小鼠肠道菌群PCA2两组小1小鼠肠道菌群PCAScientific ：I型；肠道菌群；16S本研究通过对墨西哥29例7-18岁青少年肠道菌群的研究，揭示了儿童I型人肠道内菌群的变化，并阐释了肠道内菌群变化可能诱发I型，此研究为治疗I型提供指导。通过对8例健康儿童，8例初发I型患者，以及13例已治疗两年的I型患者的肠道菌群做16S的V4区，研究发现，在初发患者中，Bacteroide丰度相对于其他两组要高的多，正常儿童中，Prevola为优势属，而治疗两年的I型患者的Bacteroide和Prevola的丰度介于两者之间。图3三类样本的细菌组成与丰图4三类样本物种的显著性差异分3、玉米根系土壤微生物的群落多样性和遗传性 735SVVVVVVVV8了通据示VV4过VV4区究因玉土微群多性二要因；同米之的物种异是别著。5不同引物片段对根系微生物多样性的影注：门水平上的根系微生物相对丰度柱形图（左）和样品聚类图（右图6不同因素对根系微生物多样性的影注：以上4图依次为不同地域、玉米根际和非根际土壤、不同地域玉米根际 ：南极冰川；细菌；古菌；南极冰川下湖泊中是否有微生物生命一直存在争议，因为当发现在钻探过程中可能发生了污染时，早期获得的结果就受到了质疑。本文采用maeq平台，对SSUrNAV4区进序及系统发育分析，研究了南极冰湖acalLeWas)湖水及其湖底沉积物的微生物群落的多样性。结果显示：SW湖水比地表水具有样性的微生物群落，TU1释到细菌的有520个T2不同类型的细菌和古菌中，大部分为变形菌门和放线菌，其中包括与氧化亚硝酸盐密切相关的β活性微生物，主要从融化的冰水、冰下岩度较高的物种都是以N、、S为营养物质的自养菌。

图7SLW水、湖水表面沉积物(0-2cm)和钻孔水微生物SSU进化分析注：SLW湖水及其沉积物中细菌和古菌物种相对丰度注释及样品聚类分析（左）和SLW水和沉积物中细菌和古菌OTUs进化分析（右）5、獭兔便型及体重与其细菌群落的关系ScientificReports ：獭兔；肠道微生物；16S本文研究了来自不同獭兔同日产下的80只幼崽，第70天分别挑选体重最重和最轻的10只兔子，第90天再测定这20只兔子的体重并收集他们的硬粪和软粪，用于研究兔子体重和便型与肠道微生物的关系。利用16SV4区结合α多样性、β多样性、LEfSe分析对肠道微生物进行了研究。结果显示，獭兔硬粪菌群在高低体重组间差异显著，而软粪个微生物群落与低体重獭兔的有差异，然而在软粪中未表现出微生物群落差异。Ruminococcaceae和Akkermansiaspp.在软粪中为优势物种；LEfSe分析寻找显著性差异物种：獭兔硬粪显著性差异物种较软粪中多。图8不同体重獭兔细菌群落结构及丰度分獭兔不同体重和便型的微生物群落结构及丰度（左上）兔不同体重和便型的细菌组成结构PCoA析（右上）、兔硬粪中微生物群落PCoA分析（左下）和獭兔软粪中微生物群落PCoA分析（右下

图9不同体重的獭兔粪便微生物物种注SonnenburgED,SmitsSA,TikhonovM,etal.Diet-inducedextinctionsinthegutmicrobiotacompoundovergenerations[J].Nature,2016,529(7585):212-215.Mejía-LeónME,PetrosinoJF,AjamiNJ,etal.FecalmicrobiotaimbalanceinMexicanchildrenwithtype1diabetes[J].Scientificreports,2014,4:3814.PeifferJA,SporA,KorenO,etal.Diversityandheritabilityofthemaizerhizospheremicrobiomeunderfieldconditions[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2013,110(16):6548-6553.ChristnerBC,PriscuJC,AchbergerAM,etal.AmicrobialecosystembeneaththeWestAntarcticicesheet[J].Nature,2014,512(7514):310-313.ZengB,HanS,WangP,etal.Thebacterialcommunitiesassociatedwithfecaltypesandbodyweightofrexrabbits[J].Scientificreports,2015,5:9342.组摆脱了传统研究中微生物分离培养的技术限制，直接提取环境样本DNA进序，具有通量高、速度快、信息全等产平策指周宏HiSeq4000300bp小片段文6Grawdata12Graw35-75水体送样为过滤后的滤膜（最适滤膜直径3-4拭子样本2样品浓度≥50ng/μl样品总，无样样取组组建数据质组组预 物种注蛋白预丰度聚OG

图1core-pan稀释曲图2物种相对丰度柱形 图3物种聚类图4多样品代谢通路比较分析示例注：代谢通路图中黄色背景标注为差异（左）和特定差异丰度分布箱图（右图5KEGG数据库注释数目统计6差异OG进化验;宏组研究是对微生物群落全组进行高深度，在鉴定微生物群落的同时，主要注重挖掘功能及其代谢途径。目前涉及的研究热点主要集中在两个方面：一是或经济动物微生态及其与疾病关联，其中以最为广泛，如人肠道、皮肤、口腔等部位菌群分析，胖、、等患者肠道微生物研究；二是自然环境生态如重要土壤或水体资源的微生物结构分析。此外，在业酵、污染废物处理等方面也有应用，如食品发酵液、空表1宏组典型文献列类名时研究内人2-型与肠道菌肝硬化人群中肠道菌群的改4.74皮肤表面宏组分2.27微生物生物合成簇解3.5CellHost婴儿肠道微生物宏3.99动奶牛瘤胃宏268饮食习惯对小鼠肠道微生物的影8.54砷和铁的小鼠的肠道宏>1环冻土、活土层、沼泽微生物研6.4全球海洋微生物结构与功29.6ISME天然土壤微生物宏4.88Sci三峡水体宏组分7其乳酪表皮及内部宏1.88J牛呼吸道疾病宏23010.1128/JVI.00064-1、肝硬化人群中肠道菌群的改变 包括98例肝硬化患者和83例健康 集，包括269万个非冗余 的集，其中36.1%的为首次发现。通过标记物的聚类分析，发现了28种细菌与肝硬化密切相关，其中多个细菌是肝硬化患者中首次发现，38种与健康人密切相关，可以作为肝硬化的生物标记物。本研究发现了13,970个NOG功能分类与疾病相关，其中肝硬化特异同源的主要为膜转运相关，这与II型的类似，健康菌群的则多与糖代谢、氨基酸代谢、维生素代谢、能2、婴儿肠道微生物 组

图1肝硬化肠道微生物相关性网络CellHost& 肠道微物对至重，本采用术对8典粪的行研出生年道微，分方喂方肠菌建的。顺儿道生比，婴肠道微生物与母亲相似性明显降低。营养对肠道微生态的组成和功能有重要影响，促使婴儿肠道微生物向成人肠道微生物群转变的主要驱动力量并不是开始喂食固体食物，而是停止喂养。微生物群落组成和生态网络在不同样本阶图2不同生产方式及不 阶段肠道菌群的差3、奶牛瘤胃 物降解相 簇 生物能源是一直是备受关注的研究热点，但由于缺乏可有效降解植物多糖的水解酶类，因此限制了生物工业化生产的进程。牛瘤胃中的微生物可以降解植物纤维，由于其中大部分微生物都很难被纯培养，该文采用宏组来降解植物纤维的，共获得约268G的数据。从这些数据中，获得27,755个与碳水化合物相关的，并挑选出了90个的图3瘤胃微生物组组装及代表性分图4CAZy数据库注释数目分4、全球海洋微生物群体的结构与功能 微生物是生物地球化学进程的主要推动力，但对它们的功能多样性、微生物种群结构以及生态因素进行总体分析还存在的本海洋8的3到B数对90群微物肠达。QinN,YangF,LiA,etal.Al tionsofthehumangutmicrobiomeinlivercirrhosis[J].Nature,2014,513(7516):59-64.BäckhedF,RoswallJ,PengY,etal.DynamicsandStabilizationoftheHumanGutMicrobiomeduringtheFirstYearofLife[J].Cellhostµbe,2015,17(5):690-703.HessM,SczyrbaA,EganR,etal.Metagenomicdiscoveryofbiomass-degradinggenesandgenomesfromcowrumen[J].Science,2011,331(6016):463-467.SunagawaS,CoelhoLP,ChaffronS,etal.Structureandfunctionoftheglobaloceanmicrobiome[J].Science,2015,348(6237): 细菌细菌组，一般采用二代或三代高通量，通过高深度和生物信息分析，获得细菌组的编码和变。是缘不信策，菌evo和菌。细菌de细菌denovo，是基于高通量数据，对细菌组进行从头组装的方法。基于组装结果，我们可以预测细组中所包含的，并通过功能数据比对获得的功信息。根据不同组装精细程度的需求我们提供细菌框架图、evo细 组；denovo组装；比 组 组组建350bp小片段文 6Kbp大片段文10KbpHiSeqHiSeq三原始始数据质高质量高质量数组初级框架精细完成组组分分岛重复深度分共线性分非编码群体进化分功能注基本功能注Core-pan分 致病性分分泌蛋白预测NRGOSwiss-protVFDBARDB产平策指周细菌框架无30个自然细菌精细350bp文库≥≤3045个自然细菌完成PacBioRS10Kb库1Scaffold,060个自然细菌重，是基于高通量数据，与近缘参考组进行比对，进行变异检测的方法。通过重可以获得目标组对于参考组的SNP、InDel、SV等一系列变异信息，从中尝试对组之间的性状差异进行解析，或作为标 变异分SNP检测及注产平策指周细菌350bp无30个自然层面的研究:一般针对具有特异性状的变异菌，或新发现的菌株，通过对该菌株的组进行精细组装，结合比群体层面的研究:一般针对长期收集的大量菌株，通过大规模和信息分析，获得这些菌株的系统进化关系。目前群体层面的系统进化研究可分为两种，一是denovo组装技术，基于菌株间 1、结核分枝杆菌临床分离株的比 组学分析BMC 结核分枝杆菌rmess）是引起结核病的病原菌，特别是多重耐药和泛耐药结核分枝杆菌菌株的出现对结核病的防治产生了。本文通过对7株抗性范围不同的临床菌株进行了全基他7。9图1 组SNP密度分括4处前过的点以及5新位，发要变源EERS的6处InDel。通过对、el及RR图1 组SNP密度分图2基于SNP和全组的菌株间进化关2、肠外致病性大肠杆菌的大规 Genome 大肠杆菌（E.coli）为菌属（Escherichia）代表菌。一般多为条件致病菌，统称致病性大肠杆菌，可导致严重腹泻和败血症等。本研究使用了IlluminaHiSeq平台对312例血液和肠外尿通路的大肠杆菌进行denovo，结果表明，转化了已知抗性的细菌会表现抗生素抗药性；来自相同祖先的不同菌株的毒力在遗传过程中会全部保留。Core-pan分析显示ExPEC大肠杆菌具有很高组多样性。系统分析表明，不同区域内的ExPEC大肠杆图3大肠杆菌全组进化3、重追踪纽约金黄色葡萄球菌产生、多样性和 在过去的20年，区域范围的甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)菌株有巨大的变化，流行菌株以ST8、表现型USA300为主，同时金黄色葡萄球菌的增加了全球传染性疾病预防负担。本研究使用Illumina2000对387株ST8菌株进行全组重，探索其短期进化和模式，在菌株中发现了一些噬菌体信息，导致USA300耐药株的出现。通过进化分析及模型推论，找到了病原祖先菌株，并推测得到一些菌 图4致病菌株进化规律及其地域属图5模型推断重要菌株扩散及其发生时4、不同平台在合成气发酵梭菌完成图构建中的比较Biotechnologyfor 在本研究中，分别应用PacbioRSII、454GSFLX和IlluminaMiSeq平台对合成气发酵梭菌Clostridiumauto-了合成气发酵梭菌的生物合成代谢通路，同时探讨了CRISPR结构与细菌抗逆的关联性，发现具有CRISPR结构的菌图6各平台对合成气发酵梭菌组装结果比BMCgenomics,2014,15(1):469.SalipanteSJ,RoachDJ,KitzmanJO,etal.Large-scalegenomicsequencingofextraintestinalUhlemannAC,DordelJ,KnoxJR,etal.Moleculartracingoftheemergence,diversification,andtransmissionofS.aureussequencetype8inaNewYorkcommunity[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2014,111(18):6738-6743.BrownSD,NagarajuS,UtturkarS,etal.Comparisonofsingle-moleculesequencingandhybridapproachesforfinishingthegenomeofClostridiumautoethanogenumandysisofCRISPRsystemsinindustrialrelevantClostridia[J].Biotechnol.Biofuels,2014,7:40.真菌变异等信息。依照是否有近缘参考组和不同的信息分析策略，分为真菌denovo和真菌重。真菌denovo，是基于高通量数据对真菌组进行从头组装的方法。基于组装结果，我们可以预测真菌组中所包含的，并通过功能数据库比对获得的功能信息。根据不同组装精细程度的需求，分为真菌框架图、真菌精细图两种不同策略。此外我们还提供真菌Survey服务，用于评估组的基本情况，作为真菌精细图的前置及组装策组建组建HiSeq原始原始数数据质高质量高质量组初级高级组真菌框架精细深度分共线性分变异检组组分分群体进化分Core-pan分进化分功能注基本功能注致病性产平策指周无（不含注释30个自然真菌框架无（含注释45个自然真菌精细PacBioRSII350bp文库≥20XCN50≥CN50*≥75个自然*CN50：ContigN50，将组装得到的Contig按从长到短排序并依次累加，当累加长度达到组总长的50%时，最后加入的一Contig度ContigN50长度真菌重，是基于高通量数据，与近缘参考组进行比对，进行变异检测的方法。通过重可以获得目标组对于参考组的SNP、InDel、SV等一系列变异信息，从中尝试对组之间的性状差异进行解读，或作为标记组组数据质高质量数参 重InDel检测及SV检测及进化分系统发育Ka/Ks分350bp小片段文HiSeq原始建产平策指周真菌350bp无30个自然层面的研究：一般针对具有特异性状的，或新发的菌株，通过对该菌株的组进行精细组装，结合比较组的，获得该菌株的信息，以及参考序间的变异信息，解释菌株宿主侵染、抗药、毒力过程发生的1、稻瘟菌比 组解读水稻抗病机制NewPhytologist ：稻瘟菌；组de由子囊菌Magnaportheoryzae引的稳产产生了长期的。有效利用宿的重要途径。本研究选择了一株致病菌株R01-1，并选择了与其亲缘关系最近的R88-002，对两株菌株进序和组装，利用比较组学，找到了稻瘟菌致病性的关键AvrPi9，并鉴定了Magnaportheoryzae无毒性效应因子AvrPi9及其和抗稻瘟病Pi9的同源性，确认了AvrPi9应机制。

图1AvrPi9及其序列比对结注：不同菌株AvrPi9序列差异（上）、蛋白序列差异（中）和无毒基2、比 组研究担子菌门物种分类 担子门整真界知菌类的%对农、林以及医学究有着要的作。其，对木具有I类过氧化物酶（OD）,3种真菌图2木质素降解及次级代谢产物相关在不同菌株中的分布热图3基于碳水化合物代谢相关酶（CAZy）数据的主成分分析结3、重揭示裂殖酵 型及表型的多样性Nature 要模式生物之一。作者收集了从20初起100来自20个不同国家和地区的161裂殖酵母菌株，进行了大规模的重研究。研究结果显示，现代裂殖酵母的可以追溯至公元前340年前后，而一些重要的时间节点也和图4酵母时间推注：酵母时间推测模型（左上）、样品时间同根节点距离呈线性关系（右上）和酵母预期时间分布（下方图5样品间变异位点与形状间的关联热WuJ,KouY,BaoJ,etal.ComparativegenomicsidentifiestheMagnaportheoryzaeavirulenceAvrPi9thattriggersPi9‐mediatedblastinrice[J].NewPhytologist,2015,206(4):1463-RileyR,SalamovAA,BrownDW,etal.Extensivesamplingofbasidiomycetegenomesdemonstratesinadequacyofthewhite-rot/brown-rotparadigmforwooddecayfungi[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2014,111(27):9923-9928.[J].Naturegenetics,2015,47(3):235-小组de组evo括动物线粒体、植物叶体（大在K、M的NA序）,一应用于物种分类、进化分析等研究。由于这些高等生物细胞器其编码特征和组结构和蓝细菌等原核生物更类似，分析方也所同因一归微物领。组组建350bp小片HiSeq数据质高质量数组初级组框架深度分共线性分组组分分重复序群体进化分Core-pan分进化分预功能注基本功能注 NRGOSwiss-产平策指周小组de350bp30个自然*用试剂盒等提取的DNA序列，很有可能含有宿主或外源DNA污染，所以必须有组同源性80%以上的参考序列，并且有效数据量在100X以上。1、腹足动物线粒体揭示其系统发育Gene 通过古腹足目线粒体组序列研究腹足纲的关系非常重要。本文通过应用高通量得到古腹足目蝾螺科的第一个线体组序列，丰富了总科的组数量。通过对所有现腹足类的线粒体组序列作为标记构建了腹足类动物的进化树为足动的进路提了力数基。图1蝾螺科线粒体组圈 图2基于线粒体序列的腹足动物进化关2、黄羽扇豆叶绿 组揭示新的特异性重组Annalsof 当键作。羽豆是下形科一，是es群序比现科的p的p供了的。图图3豆科植物叶绿体中的50Kbp倒 图4豆科植物及其近缘种的叶绿体进化关系及其中重大变异的发生节WilliamsST,FosterPG,LittlewoodDTJ.ThecompletemitochondrialgenomeofaturbinidvetigastropodfromMiSeqIlluminasequencingofgenomicDNAandstepstowardsaresolvedgastropodphylogeny[J].Gene,2014,533(1):38-47.MartinGE,Rousseau-GueutinM,CordonnierS,etal.ThefirstcompletechlorostgenomeoftheGenistoidlegumeLupinusluteus:evidenceforanovelmajorlineage-specificrearrangementandnewinsightsregardingstomeevolutioninthelegumefamily[J].Annalsofbotany,2014,113(7):1197-1210.去除rRNA，保证数据质量。产策数据周原核转录2Gclean45个自然纯纯化双链cDNA加A和接PCR富文库质量检上 OD600约0.6-0.8，106-108cfu/ml，菌液离心除去培养基收集菌体后，立即液氮速冻，-80℃保存，干冰寄送。不建议用RNAlater保存，因为RNAlater密度较大，提取时不易分离菌体。RNA本RNA总量≧3.0μg（单次建库），浓度≧65ng/μl；OD260/280≧1.8，23S/16S≧1，RIN≧6.0；无组污染，无LengthDistributionof

Vp_15421vs

DEGs(881up:down:

lengthof

−4−1 log2(fold图1sRNA长度分布 图2

图3GO富集有向无环图 图4原核生物结构和调控模式TheMostEnrichedGOTermsestablishmentofaniontransportsingle−organismtransportnitrogencompoundtransportorganicaniontransportorganicacidtransportcarboxylicacidtransportaminoacidtransportionaminoacidtransmembraneGOGOanicacid:anicaniontransmembranetr...carboxylicacidtransmembrane...GTPaseactivitysolute:sodiumsymporteractivi...aminoacidtransmembranetrans...neutralL−aminoacidsecondary...neutralaminoacidtransmembran...

Numberof

图5GO富集柱状 图6KEGG富集散点Ribo-zero去除原核转录组（包含原核sRNA分析），旨在从表达水平解决生物学问题，通过GO富集和KEGG富集分析，便于菌的作用机理、药物对病原菌的药用机理）；农业渔业生产（青枯雷尔氏菌野马铃薯、单孢菌稻、副性菌虾胰脏（藻相研究产甲梭作生物的子理方文章信名时研究内药NucleicAcids链球菌通过GreA的转录延伸的表达发挥调节NucleicAcidsRNA-seq分析副溶血弧菌侵染期间的调控网NucleicAcidsSci他汀类药物对链球菌的作用机Sci甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌的转录组分动BMC鱼类病原菌的转录组分10.1186/s12864-015-1669-PLoS牛支气管淋转录组分植BMC益生菌根促生细菌对橡树生长的促进作10.1186/s12864-015-1856-BMC植物病原真菌立枯丝核菌AG-3与2株细菌之间的互10.1186/s12864-015-1758-机NucleicAcids采用链特异性建库RNA-seq分析热纤梭菌转录组结SciRNA-seq揭示酸性环境下布鲁氏菌的代谢和毒GenomeBiol转录组分析新病原菌应对氧胁迫的应激反能PLoS产气甲烷梭菌在生物中的应1、深度分析绿脓杆菌AmpR调节子通过调节smallRNA对铁离子吸收、热激及氧化物胁迫的调节NucleicAcids ：绿脓杆菌（Pseudomonasaeruginosa）;RNA-seq;ChIP-之前的研究发现，AmpR调节子，一种LysR的转录因子，能够调控非β-内酰胺类抗性及多种毒力因子的表达。本文通过RNA-seq及互补试验，进一步阐明了AmpR调节子在铁离子吸收、热激及氧化物胁迫过程中的调节作用。并且通过ChIP-Seq技术，定位到AmpR调节子结合在ampC和lasR的启动子区域，进而发挥调控作用。图1差异表达Venn2、基于副溶血弧 的表达比较分析期间其调控网络及对环境的应答反应NucleicAcids ：副溶血弧菌（VibrioParahemolyticus）；原核转录组；表达调比较了体外和体内培养的副溶血弧菌的差异表达（DEGs），共发现416个上调和181个下调，57%的外培养并过表达转录因子VtrB）下的差异表达，最后证实在体内侵染条件下胆汁和转录因子VtrB均能诱导T3SS2的表的致病机制不同，霍乱弧菌会立即作用于宿主的上皮细胞并产生破坏，而副溶血弧菌则依赖TTSS着在小肠上皮细胞的刷

图2比较分析副溶血弧菌体外培养(LB)和体内侵染(CF)的表DeepakB,HansiK,MelitaJ,etal.DeepsequencingysesexpandsthePseudomonasaeruginosaAmpRregulontoincludesmallRNA-mediatedregulationofironacquisition,heatshockandoxidativestressresponse[J].NucleicAcidsRes,2014,Jan;42(2):979-98.LivnyJ,ZhouX,MandlikA,etal.ComparativeRNA-Seqbaseddissectionoftheregulatorynetworksand2014,42(19):12212-23.宏转录组(Metatranscriptomics)是指从整体水平上研究某一特定环境，特定时期群体生命全部组转录情况以及转录调控规律，它以生态环境中的全部RNA为研究对象，避开了微生物分离培养的问题，能有效的扩展微生物资源产策数据周5Gdata10G60个自然RNA样本（不提供提取服务RNA：总量≧2.5μg（单次建库），浓度≧65ng/μl；OD260/280≧1.8，23S/16S≧1，RIN≧6.0；无组污染，图1KEGG注释结果的第二分类水平的统计 图2物种注释结果分类统计图3多样品eggNOGPCoA分 图4多样品eggNOG聚类结果比较分宏转录组，以生态环境中的全部RNA为研究对象，避开了微生物分离培养的问题，能从转录水平研究复杂微生方文章信名时研究内健肠道微生物宏转录组和宏组的联合分多组合分析肠道微生10.1007/s00281-014-0456-Genome口腔宏转录组研究牙周炎病理特10.1186/s13073-015-0153-互海洋浮游植物与微生物的互Front枫林中氮对细菌及真菌的影PLoS无花果转录组分析变异稳定互Environ蜜蜂肠道微生物代谢分10.1111/1462-PLoS宏转录组类杀虫剂在白蚁肠道中的作保Front宏转录组在降解海湾石油污染中的应ApplMicrobiol土壤和水中微生物对烃类混合物的降解作10.1007/s00253-014-6159-环海洋浮游植物多样性的研ISME地热环境微生物ISME南极硅藻微生物群落功能的研发BMC宏转录组在分析干酪形成过程菌群变化中的应10.1186/1471-2164-15-ApplEnviron宏转录组在食品发酵中的应10.1128/AEM.02028-抗生Sci通过宏转录组挖掘自然环境中抗生素抗 已知可加速地植生长激素实验员目的起期对集北太洋和5地一见(eNisamsrs)5r由陆地植物根部周围的微生物生成的激素。实验人员还通过代谢组学和宏转录组学方法识别出了A和与海洋中AA。 1海洋环境中IAAIAA 肠道微生物宏转录组与 组的联合分析 本实验开发出一种新的方法，收集用于组和转录组分析的唾液与粪便。该方法不需要专业人员和设施，同时还能保持样品的完整性。这种方法也为消化道微生物组的组成和乳糜泻、口腔癌、牙周炎和肥胖症相关的细菌，提供了重要的解。外，究人员用受者自收集的部位样品结合型分学、宏组和宏录组图2自样本的方法在微生物宏转录组和宏组研究中的应注：以上从左到右依次为来自HPFS的8位自愿提供样本；自唾液和粪便样本分别送往；唾液样本冷冻处理，粪便样本进行3中处理：1.冷冻；2.加乙醇；3.加RNAlater；唾液和粪便均提取DNA，只提取粪便RNA反转录为cDNA，IlluminaHiSeq，去除低质量及人的reads；E.宏组和宏转录组数据分别用HUMAnN和MetaPhlAn进行统计学分析S.AAmin,L.RHmelo,HM.vanTol，etal.In ctionandsignallingbetweenacosmopolitanphytonktonandassociatedbacteria[J].Nature,2015,Jun4;522(7554):98-101.EricA.F，XochitlC.M，NicolaS，etal.Relatingthemetatranscriptomeandmetagenomeofthehumangut[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2014Jun3;111(22):E2329-38.随着高通量技术的发展，科学工作者已不再满足于单一视角的研究工作，转而地应用多组学、多视角对目标以微生物为对象的组结合转组策略；以环境微生物为对象的扩增子结合宏组策略宏结宏录策。单菌多组学分微生物组denovo结合转录微生物组denovo，是基于微生物的DNA样品，通过高通量，组装获得微生物的全组序列。然而对菌株功能机制的研究，单纯对组序列的解析，难以精确洞悉目标分子机制，所以需要结合转录组的表达数据，缩小目标的范围，挖掘关键及其代谢途径。另一方面，由于微生物传代频率高、进化速率快，菌株之间往往累积了较多的变异，当使RNA-Seq研究表达时，若直接以近缘组作为参照，转录本的拼接准确性会大打折扣，所以有必要对所研究菌株进行denovo和精细组装，微生物组；denovo组装；转录组；表菌菌株组转录 组精细转录组分表达目分子1、牛樟芝代谢产物合成和性生殖机 组和转录组研究 牛樟芝Antrodiacinnamomea是一种产自的多孔菌属药用真菌，可用于、高血压及宿醉等病症的辅助治疗。本文对两株单倍体（S27和S32）及两株双倍体（B496和B479）真菌A.cinnamomea进行了组及转录组研究。通过组组装得到32.15Mb真菌组框架图，共计9,254个。进化和功能分析揭示A.cinnamomea有性繁殖理论和倍半萜类、三萜类、麦角甾烷类、安卓奎诺尔、安卓凯因A等物质的生物合成机制。研究发现，的表达在菌丝和子实体之间差异显著，有242种蛋白参与了甲羟戊酸代谢途径，萜类化合物代谢途径、细胞色素P450合成，聚酮合酶合富，包括子实体中的14-α-脱甲基酶（CYP51F1）、聚酮合酶和菌丝体中的合成酶Q（COQ）。转录组分析S27和S32分别得到7,503和7,541isogroups，NCBI数据库分析比对所测数据与其他多孔真菌Fibroporiaradiculosa、Ceriporiopsissubvermispora、Trametesversicolor、P.centa和Dichomitussqualens蛋白编码吻合。本研究将对药1四种AcinnamomeaRNA平关联分注：四种RNA样本RPKMs关联分析（左）和四个样本表达venn图（右）；其中S27、S32（单核菌丝体）；AM（双核菌丝体）；LuMYJ,FanWL,WangWF,etal.GenomicandtranscriptomicysesofthemedicinalfungusAntrodiacinnamomeaforitsmetabolitebiosynthesisandualdevelopment[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2014,111(44):E4743-E4752.环境微生物多组学分环境微生物群落是一个复杂的系统，从细胞层面到DNA、mRNA、蛋白质、代谢产物，不同研究水平都有不同的研究技术相对应，其中，基于二代平台的16S扩增子、宏组和宏转录组技术应用最广。联合多种高通量技术，表1环境微生物研究研究水研究方特局限细低成无法研究难分离培养物PCR-研究物种多样16S研究物种多样只能研究分类信宏提取和纯数据库信息不完蛋白蛋白获得蛋白表达比较不同环境样本的蛋白差代谢获得代谢图比较不同环境样本的代谢差的物种变化趋势、确定影响环境微生物关键因素。在此础上筛选适当的分组进行宏组可作为扩增子研重延和充精深至能面更地析体变的子制。环环境微生样品扩增 扩增 微生 组组变化功 注互相关键物种1、不同和地域人类肠道菌群的变化 S的方法了1人品菌成中0个用宏的方分析了成。在丁美委内瑞亚马逊地区、非洲东南部马拉威乡村、大都市三个地区选了健康的儿童和成人，其中包括同卵、异卵双胞胎。研究发0到3的居民与另外两个国家细菌组成和功能集明显同，在儿期和成人期差别都很明显。研究结果进一步表在研图2每类群体细菌多样性均随增长而增图3三类群体中婴儿粪便微生物功能差YatsunenkoT,ReyFE,ManaryMJ,etal.Humangutmicrobiomeviewedacrossageandgeography[J].Nature,2012,486(7402):222-227.宏组和宏转录组作为研究环境微生物群落的两种重要技术，各有独特的优势和局限。宏组和宏转录组结合的DA和mNA。环环境微DNA水 mRNA水 宏转录物种 信表达信互相印关键物种 组及宏转录组揭示酸性矿山废水中原核生物的生态学作用ISME 酸性矿山废水(Acidminedrainage,AMD)是一个全球性的环境问题，研究AMD的微生物物种组成、遗传特性和适应机制，有助于增进对环境微生物生态学及进化学的理解。本研究以5L（pH2.6）AMD过滤后的滤膜为材料，分别进行了针对AMD细菌和古菌的16SV4区、宏组和结果表明，ADM微生物多样性极低（81个OTU），99.7%细菌，0.3%古菌，其中变形菌门，厚壁菌门和硝化螺旋菌门丰度分别为97.1%，0.9%和0.6%。对整个微生物群落的组序列进行宏组，得到105Gb数据，并组装11菌种的组草图，其中嗜酸菌Ferrovumspp.的组序列为首次，另外10株菌种在AMD中的相对如固氮作用，硫代谢途径等，并且COG数据库注释显示它们4AMD 图5Ferrovumsp.FKB7组草 图68株可表达菌株COGs功能注2、基 组物合 簇 在复杂的生态系统中，一些小分子在协调微生物与宿主或微生物与微生物之间的生态关系中发挥着重要作用。本研究依据自主开发的数据分析软（rr对P的2样进宏分。不位置的菌群中，鉴定了8分物研示，菌的，存码类素明它是革兰氏阳性致病菌的有效抗菌剂。宏转录组数据表明，lactocillin等硫肽簇的确在体内得到了表达。图7微生物菌群生物合成图8口腔微生物宏转录组合成簇表达情HuaZS,HanYJ,ChenLX,etal.Ecologicalrolesofdominantandrareprokaryotesinacidminedrainagerevealedbymetagenomicsandmetatranscriptomics[J].ISME,2014,9(6):1280-1294.DoniaMS,CimermancicP,SchulzeCJ,etal.Asystematic ysisofbiosyntheticgeneclustersinthehumanmicrobiomerevealsacommonfamilyofantibiotics[J].Cell,2014,158(6):1402-1414.附录 常见环境微生物样本及DNA提取方法参下运回并置于-80°C保存。手提DNA，可参考文献：CleggCD,RitzKGriffithsBS.DirectextractionofmicrobialcommunityDNAfromhumifiedundsoils[J].Lettersinappliedmicrobiology,1997,25(1):30-33.推荐试剂盒：PowerSoil®DNAIsolation20C中保DNA4C存放要置于-80°C，如需则需要置于冰上。若粪便样本量较多或不能马上收集，最迟要在4小时之内全部收集完。手提DNA，可参考文献：FuretJPFirmesseO,GourmelonMetalComparativeassessmentofhumanand推荐试剂盒：PowerFecal®DNAIsolationKitMoBioUSA)、FastDNA®SpinKitforSoilMPUSA)、QIAampDNAStoolMiniKitQiagenGermany手提DNA，可参考文献：ArumugamR,ChanXY,YinWF,etal.MetagenomicysisofMicrobialDive-rsityofTropicalSeaWaterofGeorgetownCoast,Malaysia[J].LifeScienceJournal,2013,10(3).或ShiP,JiaS,ZhangXX,etal.Metagenomicinsightsintochlorinationeffectsonmicrobialantibioticindrinkingwater[J].Waterresearch,2013,47(1):111-120.推荐试剂盒：PowerWater®SterivexDNAIsolationKitMoBio活性污泥：从曝气池中取25ml悬浮的活性污泥样本放入无RNA酶的管中，迅速放入液氮并运送到提地表沉积物：取距地表0-10cm的地表沉积物，每个位点取1-2kg的沉积物装入聚乙烯塑料袋中，立刻置于0°运到进行DNA提取推荐试剂盒：FastDNA®SpinKitforSoil(MPBiomedicals,USA)，或UltraClean®MegaSoilDNAkit(MoBio，USAPowerClean®DNAClean-UpkitMoBio，USA化注：每个样本提取两次并将提取好的DNA混为一管以减少DNA提取的潜在偏，参考CaiL,YuK,YangY,etal.Metagenomicexplorationrevealshighlevelsofmicrobialarsenicmetabolismgenesinactivatedsludgeandcoastalsediments[J].Appliedmicrobiologyandbiotechnology,2013,97(21):9579-9588.用流水冲洗植物根样本表面并摘到小侧根，粘根土壤粒要进行化学（95%的次氯酸钠2min），用无菌玻璃珠在无菌水中剧烈摇晃，物理去除细菌并置-80°C保存。内生真菌样本DNA提取参考文献：SessitschA,HarmP,DöringJ,etal.Functionalcharacteristicsofanendophytecommunitycolonizingricerootsasrevealedbymetagenomicysis[J].Molecularnt-MicrobeInctions,2012,25(1):28-36.内生细菌样本DNA提取方法参考文献：ShiYW,YangH,ZhangT,etal.Illumina-basedysisofendophyticbacterialdiversityandspace-timedynamicsinsugarbeetonthenorthslopeofTianshanmountain[J].Appliedmicrobiologyandbiotechnology,2014,98(14):6375-6385.将物体置于无菌容器内，加入PBS并利用涡旋振荡器等进行振荡，使微生物从物体表面脱离在PBS中，利用PBS提取DNA或者将PBS用滤膜过滤之后送滤膜提取DNA。物体表面微生物样本和DNA提取具体流程可参考文献：HewittKM,GerbaCP,MaxwellSL,etal.Officespacebacterialabundanceanddiversityinthreemetropolitanareas[J].2012.瘤胃微生物样本和DNA提取具体流程可参考文献：SinghKM,TripathiAK,PandyaPR,etal.MethanogendiversityintherumenofnSurtibuffalo(Bubalusbubalis),assessedby16SrDNAysis[J].Researchinveterinaryscience,2012,92(3):451-455.推荐试剂盒：QIAampDNAStoolMiniKit（Qiagen白蚁肠道微生物样本和DNA提取可参考文献：PoulsenM,HuH,LiC,etal.Complementarysymbiontcontributionstont positioninafungus-farmingtermite[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2014,111(40):14500-14505.肠道黏膜微生物样本和DNA提取可参考文献：YasudaK,OhK,RenB,etal.Biogeographyoftheintestinalmucosalandlumenalmicrobiomeintherhesusmacaque[J].Cellhostµbe,2015,17(3):385-391.宏病毒组样本准备推荐采用TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0病毒核酸提取试剂盒，采用Rochetriscripto