特殊显微镜的工作原理和使用

第六章特殊显微镜的工作原理和使用现在是1页\一共有129页\编辑于星期六特殊显微镜是与明视场普通显微镜相对而言，在成像原理、结构和用途上存在差异的显微镜。这里介绍：暗视野显微镜、相差显微镜、微分干涉显微镜、荧光显微镜、偏光显微镜、倒置显微镜、实体显微镜、激光共聚焦显微镜。现在是2页\一共有129页\编辑于星期六一、暗视野显微镜应用：微小粒子、细菌形态、细菌记数，透明标本观察等。现在是3页\一共有129页\编辑于星期六(一)原理和结构特点在日常生活中，室内飞扬的微粒灰尘是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束光线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了，这是光学上的丁达尔现象。暗视野显微镜就是利用此原理设计的。丁达尔现象现在是4页\一共有129页\编辑于星期六暗视野显微镜是在普通光学显微镜中去除明视野集光器，换上一个暗视野集光器而成。它的结构特点主要是使用中央遮光板或暗视野聚光器，常用的是抛物面聚光器，使光源的中央光束被阻挡,不能由下而上地通过标本进入物镜。从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察的标本上。现在是5页\一共有129页\编辑于星期六明场普通显微镜成像光路图暗场照明光路图现在是6页\一共有129页\编辑于星期六标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视野是黑暗的。现在是7页\一共有129页\编辑于星期六成像特点及优缺点在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像,并非物体的本身，所以只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构，只能呈现出物体的轮廓而且比实物要大。但被检物体为非均质时，并大于1／2波长，则各级衍射光线同时进入物镜，在某种程度上可观察物体的构造。一般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结构，但却可分辨0.004um以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜(最大的分辨力为0.2um)所不具有的特性，可用以观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。现在是8页\一共有129页\编辑于星期六(二)制作中央遮光板

普通显微镜只要聚光器是可以拆卸的，支架的口径适于安装暗视野聚光器，即可改装成暗视野显微镜。在无暗视野聚光器时，可用厚黑纸片制作一个中央遮光板，放在普通显微镜的聚光器下方的滤光片框上，也能得到暗视野效果。(1)．将显微镜聚光器调到最高位置，用低倍镜对好焦距。

(2)．取下目镜，从镜筒中观察并调节光阑的大小，使其与镜筒中所见物镜的视野相等。

(3)．用厚黑纸剪制中央挡光板。外圈直径与滤光片框架相同，中央部分的大小与调节好的光阑孔径一样(可用半透明的小纸片，放在通光孔处聚光镜镜面上，纸上显示的光斑即为光阑的孔径，再用圆规量取大小)。

(4)．将中央挡光板放在滤光片框架上，开大光阑进行样品观察。如需使用高倍镜作暗视野观察，应按高倍镜对焦后的视野大小重新制作中央挡光板。现在是9页\一共有129页\编辑于星期六（三）使用方法(1)．把暗视野聚光器装在显微镜的聚光器支架上。

(2)．选用强的光源，但又要防止直射光线进入物镜，所以一般用显微镜灯照明。

(3)．在聚光器和标本片之间要加一滴香柏油，目的是不使照明光线于聚光镜上面进行全反射，达不到被检物体，而得不到暗视野照明。

(4)．升降集光器，将集光镜的焦点对准被检物体，即以圆锥光束的顶点照射被检物。如果聚光器能水平移动并附有中心调节装置，则应首先进行中心调节，使聚光器的光轴与显微镜的光轴严格位于一直线上。

(5)．选用与聚光器相应的物镜，调节焦距，找到所需观察的物像。(6)．观察并记录结果。现在是10页\一共有129页\编辑于星期六要求与注意事项(1)制作标本时所用的载玻片和盖玻片均应清洁干净，必须使用薄玻片(载玻片厚度约1.O～1.1mm，盖玻片厚度约0.1mm)，否则会影响暗视野集光器斜射光焦点的调节，如载玻片太厚，焦点只能落在载玻片内，就不能看到物像。标本也不能过厚。(2)采用的光源宜强，一般均用强光灯照明。光线暗则物像不清晰。(3)调节光源：使光线集中在暗视野集光器上。先用低倍镜观察，移动暗视野集光器，使其中央的一个圆圈恰好处在视野的中央。如暗视野集光器已准确固定好，则可免去这一步骤。(4)先在暗视野的集光器上加香柏油一滴，然后将标本放在载物台上，把暗视野集光器向上移，使其上的柏木油与标本片的底面接触，中间不能有气泡存在。(5)高倍观察：在标本盖玻片上再加香柏油一滴，降下镜筒，使油镜浸在香柏油内，再用粗、细螺旋调节物镜的焦距，有时还需稍微升降暗视野集光器以调节斜射光焦点，使其正好落在标本上，并且调节油镜头的光圈，相互配合，直到物像清楚为止，即可开始检查。也可用低倍或高倍物镜进行镜检，这就不必在盖玻片上加香柏油。现在是11页\一共有129页\编辑于星期六暗视野显微镜下的植物胚珠受精过程现在是12页\一共有129页\编辑于星期六现在是13页\一共有129页\编辑于星期六（二）相差显微镜现在是14页\一共有129页\编辑于星期六原理和结构特点光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位(指在某一时间上光的波动所能达到的位置)的不同。当光波遇到物体时，其波长(颜色)和振幅(亮度)发生变化，于是就能看到物体，当光波通过透明的物体时，虽然物体的内部不同结构会有厚度和折光率不同的差异，而波长和振幅则仍然是不会发生改变的。因此，就不易看清这些不同的结构。用普通光学显微镜观察一些活的微生物或其他细胞等透明物体时，也就不易分清其内部的细微结构。现在是15页\一共有129页\编辑于星期六但是，光线通过厚度不同的透明物体时，其相位却会发生改变，形成相差。不过，相差不表现为明暗和颜色的差异，这种微小的变化，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观察到。我们可以利用光学的相干干涉原理，可以把相差改变为振幅差，这样就能使透明的、厚度和性质不均匀的结构表现明暗的不同，能够较清楚地予以区别。如果这两条光波射到光屏的同一点上，而且一条光波比另一条光波迟滞了半个波长，即两条光波因位相相反而互相干涉抵消则光线消失，或者相对振幅相互影响而光线减弱。如果一条光波虽然迟滞了一个波长,但两条光波位相相同,则因波的叠加而光线增强-明相差+暗相差现在是16页\一共有129页\编辑于星期六相差显微镜，能够通过其复杂的结构，改变直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相差变成振幅差，即明暗差，可以被我们的感觉器官所感知。同时它还吸收部分直射光线，以增大其明暗的反差。因此可用以观察活细胞或未染色标本。现在是17页\一共有129页\编辑于星期六成像光路图现在是18页\一共有129页\编辑于星期六相差显微镜的构造特点相差显微镜的构造以普通显微镜为基础，与普通显微镜的主要不同之处是：用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜(通常标有PH的标记)代替普通物镜，并带有一个调节合轴用的望远镜。相差环则是由大小不同的环状孔形成的光阑，放置在光源通路上，使光线只能由环状部分通过，环状光圈的大小可由集光镜的数值口径(N.A)来调节。环状光圈的大小由不同大小的环状孔控制。环状光阑的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。其作用是将直射光所形成的像从一些衍射旁像中分出来。相差环现在是19页\一共有129页\编辑于星期六相差物镜是在物镜的后焦点处加一环状相板。相板由光学玻璃制成，安装在物镜的后焦面处，相板装有吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜，具有改变相位的作用。它除能推迟直射光线或衍射光的相位以外，还有吸收光使亮度发生变化的作用。放大倍数不同的物镜，其相板也不同。现在是20页\一共有129页\编辑于星期六调轴望远镜：是用来进行合铀调节的。使用不同的相差物镜时，应配合相应的环状光圈，并用合轴调节望远镜观察环状光圈和相板，调节至环状光圈的亮环与相板的暗环完全重合。这样，光线通过标本后，就必须经过相板而发生相位的改变，造成明暗差异的影像。要使得聚光镜下面环状光阑的中心与物镜光轴要完全在一直线上，必需调节光阑的亮环和相板的环状圈重合对齐，才能发挥相差显微镜的效能。否则直射光或衍射光的光路紊乱，应被吸收的光不能吸收，该推迟相位的光波不能推迟，就失去了相差显微镜的作用。环状光圈、相差物镜配合与调节好之后，其他操作方法与普通光学显微镜相同。现在是21页\一共有129页\编辑于星期六使用方法（1）相差装置的调换安装卸下普通显微镜使用的聚光器，将环状光阑装在聚光器支架上，把绿色滤光片放在上面，它可吸收红色和蓝色光，使波长范围小的单色光线进行照明，并有吸热作用，能使相差观察获得良好的效果。再从转换器上旋下普通物镜，换上相差物镜。

（2）调焦打开光源，旋转集光器转盘，将“0”对准标示孔，使普通聚光器部分进入光路。先使用低倍相差物镜，按普通显微镜操作方法进行对光和调焦。旋转环状光阑，使光阑的直径和孔宽与所使用的相差物镜相适应，如相差物镜为40X时应用40X标示孔的光阑。现在是22页\一共有129页\编辑于星期六（3）合铀调整拔出目镜，插入合铀望远镜，一边从望远镜向内观察，并用左手固定其外筒；一边用右手转动望远镜内筒使其上升，当对准焦点就能看到环状光阑的亮环和相板的暗环，此时可将望远镜固定住。再升降集光器并调节其下的螺旋使亮环的大小与暗环一致，然后左右前后调节环状光阑聚光器上的调节钮，使两环完全重合。（4）观察换回目镜，按常规要领进行观察。在更换不同倍率的相差物镜时，每一次都要使用相匹配的环状光阑。现在是23页\一共有129页\编辑于星期六用途位相显微镜是利用样品中质点折射率的不同或质点厚度的不等，产生光线的相位差，使新鲜标本不必染色就可以看到，而且能够观察到活细胞内线粒体及染色体等精细结构，还可以应用于霉菌、细菌、病毒等更微小活体的研究，进行标本形态、数量、活动及分裂、繁殖等生物学行为观察，并可进行量度与比较。现在是24页\一共有129页\编辑于星期六用途：观察未经染色的玻片标本现在是25页\一共有129页\编辑于星期六用途特点:鉴定活体细胞最实用、最经济的方法缺点:需要光强高切片不能太厚(5~10um)盖片、载片需符合标准最好配用单色滤光镜荧光效果不如明场物镜现在是26页\一共有129页\编辑于星期六三、微分干涉差显微镜现在是27页\一共有129页\编辑于星期六微分干涉差显微镜微分干涉差显微镜：又称Nomarski相差显微镜（Nomarkicontrastmicroscope），1952年，Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明了微分干涉差显微镜（differentialinterferencecontrastmicroscope）即DIC显微镜。能看到和测定微小的位相变化，与位相显微镜相似，使无色透明的标本具有明暗和颜色的变化，从而增强反差。其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。现在是28页\一共有129页\编辑于星期六原理DIC显微镜的物理原理完全不同于相差显微镜，技术设计要复杂得多。DIC利用的是偏振光，有四个特殊的光学组件：偏振器、DIC棱镜、DIC滑行器和检偏器。偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生线性偏振。在聚光器中则安装了石英Wollaston棱镜，即DIC棱镜，此棱镜可将一束光分解成偏振方向不同的两束光（x和y），二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由于标本的厚度和折射率不同，引起了两束光发生了光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个Wollaston棱镜，即DIC滑行器，它把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面（x和y）仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置，即检偏器。现在是29页\一共有129页\编辑于星期六原理在光束形成目镜DIC影像之前，检偏器与偏光器的方向成直角。检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光，从而使二者发生干涉。x和y波的光程差决定着透光的多少。光程差值为0时，没有光穿过检偏器；光程差值等于波长一半时，穿过的光达到最大值。于是在灰色的背景上，标本结构呈现出亮暗差。为了使影像的反差达到最佳状态，可通过调节DIC滑行器的纵行微调来改变光程差，光程差可改变影像的亮度。调节DIC滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一侧亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕。现在是30页\一共有129页\编辑于星期六微分干涉差显微镜的装置：1.微分干涉差/相差聚光器：主要作用是提供光源，2.渥拉斯顿棱镜中间镜筒：可以得到0-700nm不同的干涉色光。3.起偏镜：产生单色光。4.调中望远镜：调节物镜合轴和校正干涉条纹。现在是31页\一共有129页\编辑于星期六微分干涉差显微镜的调节步骤：1.安装中间镜筒、聚光器、平消色差物镜2.先将聚光器调到0档，拉出聚光器和物镜上的棱镜3.柯勒照明4.推进上述棱镜5.换上合轴调中望远镜，在10倍相差物镜和10倍聚光镜下调中6.分别转入20倍、40倍物镜和聚光镜进行合轴调节7.将聚光器转到0档，在10倍物镜下旋转调节调中望远镜，至看到物镜后焦点平面上的干涉条纹；旋动中间镜筒至黑色干涉条纹处于中间斜向位置；缓缓前、后拉动起偏器旋钮至黑色干涉条纹达到清晰，固定起偏器。8.旋转聚光器档位盘，选用对应的DIC物镜和干涉差聚光器进行镜检。9.旋转中间镜筒的棱镜，背景达到灰色时候效果最好现在是32页\一共有129页\编辑于星期六应用DIC显微镜使细胞的结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。DIC显微镜下的硅藻（伪彩色）现在是33页\一共有129页\编辑于星期六应用微分干涉差显微镜同样可以观察到在普通亮视野中看不见的无色透明物体,可以观察细胞、细菌等活体,而且影像呈立体感，较位相显微镜的影像更细致、更逼真。可用它对活细胞的各个部位作更精细的研究。如果用白光照明，不同位相表现为各种颜色，转动载物台，颜色会发生变化。单色光照明产生明暗反差，各种成分呈现不同的对比度。微分干涉差显微镜又可以作为一种高度精密的超微量光学天平来使用，用以估测的干物体的精确质量可以小到1×克。当细胞中所含固体物质的浓度增加百分之一时，其折射率相应增加0.0018。细胞各相成分的折射率可以根据它与相关区域（悬浮液区）间位种的不同而估计，从而可进一步算出一个细胞中某些成分的干燥重量。现在是34页\一共有129页\编辑于星期六注意事项：1.标本表面保证清洁无尘2.最好选用可旋转载物台3.载玻片和盖玻片必须符合标准，无刻痕4.具有双折射的物质不能达到微分干涉差点镜检效果。现在是35页\一共有129页\编辑于星期六四、荧光显微镜现在是36页\一共有129页\编辑于星期六荧光概念荧光：物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光——冷光。可分为：化学荧光（氧化还原反应发出的荧光）、光化荧光（光源激发而产生的荧光）、生物荧光、放射荧光。荧光显微镜应用的是光化荧光。荧光现象：荧光物质吸收长波光（320-400nm）的能量，以较长波长的可见光形式发射出去，这种现象就是荧光现象。现在是37页\一共有129页\编辑于星期六荧光的性质：吸收光，必需有激发光源荧光波长＞激发波长（损失热能）荧光强度极小于激发光的强度有不同程度的衰减荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率现在是38页\一共有129页\编辑于星期六荧光的产生一次荧光：又叫自发荧光或固有荧光，经过紫外光照射直接发出荧光。二次荧光：又叫继发荧光，被观察物体经过荧光染料处理之后，经过紫外光照射才能发出荧光。荧光染料种类很多：现在是39页\一共有129页\编辑于星期六荧光显微镜原理荧光显微镜利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光365nm或紫蓝光420nm)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。现在是40页\一共有129页\编辑于星期六荧光显微镜结构特点荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。现在是41页\一共有129页\编辑于星期六不同照明方式下荧光显微镜主要部件

透射式汞灯光源激发滤色镜吸收滤色镜暗场聚光镜

落射式汞灯光源激发滤色镜分色镜吸收滤色镜现在是42页\一共有129页\编辑于星期六光源现在多采用200W的超高压汞灯作光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达50～70个标准大气压力，这一过程一般约需5～15min。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质，因此，为荧光显微镜普遍采用。超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工作环境温度不宜太高。200W超高压汞灯的平均寿命，在每次使用2h的情况下约为200h，开动一次工作时间愈短，则寿命愈短，如开一次只工作20min，则寿命降低50%。因此，使用时尽量减少启动次数。灯泡在使用过程中，其光效是逐渐降低的。灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。点燃灯泡后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15min。超高压汞灯（100W或200W）光源的电路和包括变压、镇流、启动几个部分。在灯室上有调节灯泡发光中心的系统，灯泡球部后面安装有镀铝的凹面反射镜，前面安装有集光透镜。现在是43页\一共有129页\编辑于星期六滤色系统荧光光源的采用超高压汞灯，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断(或压制)滤光片。它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛?二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。滤色系统是荧光显微镜的重要部位，由激发滤板和压制滤板组成。滤板型号，各厂家名称常不统一现在是44页\一共有129页\编辑于星期六滤板一般都以基本色调命名，前面字母代表色调，后面字母代表玻璃，数字代表型号特点。如德国产品（Schott）BG12，就是种蓝色玻璃，B是蓝色的第一个字母，G是玻璃的第一个字母；我国产品的名称已统一用拼音字母表示，如相当于BG12的蓝色滤板名为QB24，Q是青色（蓝色）拼音的第一个字母，B是玻璃拼音的第一个字母。不过有的滤板也可以透光分界滤长命名，如K530，就是表示压制滤长530nm以下的光而透过530nm以上的光。还有的厂家的滤板完全以数字命名，如美国Corning厂的NO：5-58，即相当于BG12。用于荧光显微镜的主要滤板如下表。现在是45页\一共有129页\编辑于星期六基本色调相应名称2mm厚透光范围（峰值）nm上海电器元件厂德国（Schott）苏联日本黑紫ZWB-1UG-1yΦC-2DV-1300～400（365）黑紫ZWB-2UG-5yΦC-1

280～240（360）靛蓝ZB-2BG-1ΦC-1BG-1300～500（380）靛蓝ZB-3BG-3CC-4BG-3260～520（400）靛蓝QB-24BG-12CC-8BG-12310～570（420）淡蓝QB-10BG-38C3C-5

310～720（460）

QB-12

-8

-11

橙黄CB-3OG-1（K530）OC-11OG-1530以上橙黄JB-8OG-4（K510）ЖC-18FY-5510以上绿橙JB-7GG-11（K490）ЖC-17FY-3480以上

FY-4

淡绿JB-4GG-3（K430）жC-11US-10420以上现在是46页\一共有129页\编辑于星期六1．激发滤板

根据光源和荧光色素的特点，可选用以下三类激发滤板，提供一定波长范围的激发光。紫外光激发滤板：此滤板可使400nm以下的紫外光透过，阻挡400nm以上的可见光通过。常用型号为UG-1或UG-5，外加一块BG-38，以除去红色尾波。紫外蓝光激发滤板：此滤板可使300～450nm范围内的光通过。常用型号为ZB-2或ZB-3，外加BG-38。紫蓝光激发滤板：它可使350～490nm的光通过。常用型号为QB24（BG12）。最大吸收峰在500nm以上者的荧光素（如罗达明色素）可用蓝绿滤板（如B-7）激发。近年开始采用金属膜干涉滤板，由于针对性强，波长适当，因而激发效果比较玻璃滤更好。如西德Leitz厂的FITC专用KP490滤板和罗达明的S546绿色滤板，均远比玻璃滤板效果好。激发滤板分薄厚两种，一般暗视野选用薄滤板，亮视野荧光显微镜可选用厚一些。基本要求是以获得最明亮的荧光和最好的背景为准。现在是47页\一共有129页\编辑于星期六2．压制滤板压制滤板的作用是完全阻挡激发光通过，提供相应滤长范围的荧光。与激发滤板相对应，常用以下3种压制滤板：紫外光压制滤板：可通过可见光、阻挡紫外光通过。能与UG-1或UG-5组合。常用GG-3K430或GG-6K460。紫蓝光压制滤板：能通过510nm以上滤长的荧光（绿到红），能与BG-12组合。通常用OG-4K510或OG-1K530。紫外紫光压制滤板：能通过460nm以上波长的荧光（蓝到红），可与BG-3组合，常用OG-11K470AK490，K510。现在是48页\一共有129页\编辑于星期六各种滤色镜现在是49页\一共有129页\编辑于星期六反光镜反光镜的反光层一般是镀铝的，因为铝对紫外光和可见光的蓝紫区吸收少，反射达90%以上，而银的反射只有70%；一般使用平面反光镜。现在是50页\一共有129页\编辑于星期六聚光镜专为荧光显微镜设计制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明视野聚光器的暗视野聚光器两种。还有相差荧光聚光器。1．明视野聚光器在一般荧光显微镜上多用明视野聚光器，它具有聚光力强，使用方便，特别适于低、中倍放大的标本观察。2．暗视野聚光器暗视野聚光器在荧光显微镜中的应用日益广泛。因为激发光不直接进入物镜，因而除散射光外，激发光也不进入目镜，可以使用薄的激发滤板，增强激发光的强度，压制滤板也可以很薄，因紫外光激发时，可用无色滤板（不透过紫外）而仍然产生黑暗的背景。从而增强了荧光图像的亮度和反衬度，提高了图像的质量，观察舒适，可能发现亮视野难以分辨的细微荧光颗粒。3．相差荧光聚光器相差聚光器与相差物镜配合使用，可同时进行相差和荧光联合观察，既能看到荧光图像，又能看到相差图像，有助于荧光的定位准确。一般荧光观察很少需要这种聚光器。现在是51页\一共有129页\编辑于星期六物镜各种物镜均可应用，但最好用消色差的物镜，因其自体荧光极微且透光性能（波长范围）适合于荧光。由于图像在显微镜视野中的荧光亮度与物镜镜口率的平方成正比，而与其放大倍数成反比，所以为了提高荧光图像的亮度，应使用镜口率大的物镜。尤其在高倍放大时其影响非常明显。因此对荧光不够强的标本，应使用镜口率大的物镜，配合以尽可能低的目镜（4×,5×，6.3×等）。现在是52页\一共有129页\编辑于星期六目镜在荧光显微镜中多用低倍目镜，如5×和6.3×。过去多用单筒目镜，因为其亮度比双筒目镜高一倍以上，但目前研究型荧光显微镜多用双筒目镜，观察很方便。现在是53页\一共有129页\编辑于星期六照明装置荧光显微镜就其光路来分有两种：1．透射式荧光显微镜：激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。常用暗视野集光器，也可用普通集光器，调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上．这是比较旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱．所以对观察较大的标本材料较好。现在是54页\一共有129页\编辑于星期六2．落射式荧光显微镜这是近代发展起来的新式荧光显微镜，与上不同处是激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。光路中需加上一个双色束分离器，它与光铀呈45度角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，反回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。现在是55页\一共有129页\编辑于星期六如换用不同的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强。更适用于不透明及半透明标本，如厚片、滤膜、菌落、组织培养标本等的直接观察。现在是56页\一共有129页\编辑于星期六分色后成像光路图现在是57页\一共有129页\编辑于星期六荧光显微镜标本制作要求（一）载玻片：载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。（二）盖玻片：盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光，这种反射的激发光女可激发标本。（三）标本：组织切片或其他标本不能太厚，应控制在10um左右为好，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。采用石蜡制片时。必须彻底脱蜡，因为石蜡本身可发青色荧光。玻片最好用莹石玻璃制成的。（四）封裱剂：封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/lpH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。（五）镜油：一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。现在是58页\一共有129页\编辑于星期六使用方法1．打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮点。

2．透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的阻断滤片。落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的插块。

3．用低倍镜观察，根据不同型号荧光显微镜的调节装置，调整光源中心，使其位于整个照明光斑的中央。

4．放置标本片，调焦后即可观察。使用中应注意：末装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤；用油镜观察标本时，必须用无荧光的特殊油镜；高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经5分钟后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。

5.观察在示教台上的荧光显微镜下＜用蓝紫光滤光片＝，可见经o．01％的丫啶橙荧光染料染色的细胞，细胞核和细胞质被激发产生两种不同颜色的荧光(暗绿色和橙红色)。现在是59页\一共有129页\编辑于星期六使用荧光显微镜的注意事项（1）严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。（2）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5～15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。（3）防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。（4）检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3～5min后，荧光也明显减弱；所以，最多不得超过2～3h。（5）荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。（6）标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。长时间的激发光照射标本，会使得荧光衰减和消失现象，故应尽可能缩短照射时间。暂时不观察时可用挡光板遮盖激发光。（7）标本观察时候应采用无荧光油，应避免眼睛直视紫外光源。（8）电源应安装稳压器，电压不稳会降低荧光灯的寿命。现在是60页\一共有129页\编辑于星期六荧光的衰减

防衰减的方法使用抗衰减剂选择衰减小的荧光素降低激发光强度降低标本中氧的浓度有衰减的标本现在是61页\一共有129页\编辑于星期六荧光图像的记录方法荧光显微镜所看到的荧光图像，一是具有形态学特征，二是具有荧光的颜色和亮度，在判断结果时，必须将二者结合起来综合判断。结果记录根据主观指标，即凭工作者目力观察。作为一般定性观察，基本上可靠的。荧光显微镜摄影技术对于记录荧光图像十分必要，由于荧光很易褪色减弱，要即时摄影记录结果。方法与普通显微摄影技术基本相同。只是需要采用高速感光胶片。因紫外光对荧光猝灭作用大，如FITC的标记物，在紫外光下照射30s，荧光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能将荧光图像拍摄下来。一般研究型荧光显微镜都有半自动或全自动显微摄影系统装置。现在是62页\一共有129页\编辑于星期六荧光显微镜的应用范围生物体内的各种组织、细胞、细胞器、微生物、病毒等，对激发光的敏感度不同，使用时应选择不同的激发滤色镜来得到最佳的激发光。激发方式激发波长应用范围U激发334病理切片，细菌、FITC染料、V激发365.405.435自发荧光、一般荧光抗体、四环素染色物B激发405.435.490FITC染料、吖啶橙染色、染色体、红细胞、癌细胞、蛔虫G激发546浮尔根染色、DNA现在是63页\一共有129页\编辑于星期六各种标记荧光素的特性现在是64页\一共有129页\编辑于星期六优点：检出能力高对细胞的刺激小能进行多重染色用途：物体构造的观察荧光的有无、色调比较进行物质判别发荧光量的测定对物质定性、定量分析荧光显微镜的优点和用途现在是65页\一共有129页\编辑于星期六

WU

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BANDWIBAWIGWIBDAPI+FITCFITC+PI双重染色标本的单色和双色观察现在是66页\一共有129页\编辑于星期六FITC+TexasRed+DAPI多重染色标本的多色观察现在是67页\一共有129页\编辑于星期六原位杂交技术现在是68页\一共有129页\编辑于星期六现在是69页\一共有129页\编辑于星期六五、偏光显微镜现在是70页\一共有129页\编辑于星期六自然光—普通光源发出的光,在垂直于传播方向的平面上,所有可能方向的光矢量E的振幅都相等。

线偏振光--光矢量只在某一固定的方向上振动。E播传方向振动面现在是71页\一共有129页\编辑于星期六横波的偏振性光矢量的振动方向总与光的传播方向垂直，在垂直于光传播方向的平面内,可有不同的振动方向。v0HE只有横波才有偏振现象现在是72页\一共有129页\编辑于星期六寻常光线(o光):遵守折射定律。对于晶体一切方向都具有相同的折射率，且在入射面内传播。非常光线(e光):不遵守折射定律。它的折射率随方向而变化，并且不一定在入射面内传播。o光和e光都是线偏振光,且振动方向相互垂直尼科尔棱镜现在是73页\一共有129页\编辑于星期六二向色性：某些晶体（电气石、硫酸金鸡钠碱晶体等）对光振动有强烈的选择性吸收能力，这种性质称为二向色性。如电气石晶体对自然光的某一振动方向上的光振动几乎完全吸收，而垂直于该方向的光振动只稍微减弱后通过。旋光现象：线偏振光通过某些透明介质后，它的光振动方向将绕着光的传播方向旋转某一角度的现象，称为旋光现象。这种介质称为旋光物质。如石英、糖、酒石酸钾钠等。现在是74页\一共有129页\编辑于星期六偏光显微镜的基本原理：单折射性：光线通过某一物质时，如果光的性质不因照射的方向而改变，这种物质在光学上具有各向同性，称为单折射体，如普通气体、液体和非结晶固体。双折射性：若线通过某一物质时，光的速度、折射率、吸收性和光波导振动面、振幅等因照射的方向不同而改变，这类物质在光学上具有各向异性，被称为双折射体，如晶体、纤维。现在是75页\一共有129页\编辑于星期六偏光显微镜的基本原理：偏光显微镜是鉴定细微结构性质的一种光学显微镜。凡具有双折射的物质，在偏光显微镜下就能分辨的清楚，虽然这些物质也可用染色进行观察，但有些则不可能，而必须利用偏光显微镜。偏光显微镜的特点，就是将普通光改变为偏振光进行镜检，以鉴别某一物质是单折射或双折射性。偏光显微镜是利用起偏振镜和检偏振镜进行偏振光成像的。现在是76页\一共有129页\编辑于星期六起偏振镜和检偏振镜偏振光可用尼科尔棱镜和偏振片得到。尼科耳棱镜是由方解石晶体做成。取长度约三倍于厚度的方解石晶体，天然方解石两端的面与原来底边成71°的角，经研磨后成68°角，然后将晶体剖开，成两块直角棱镜，再用加拿大树胶将剖面粘合成一长方柱形棱镜。将侧面CN涂黑，就制成了尼科耳棱镜。方解石的双折射现象现在是77页\一共有129页\编辑于星期六尼科耳棱镜光路图自然光射入第一块棱镜后，分成寻常光（O光）和非寻常光（e光），方解石对O光的折射率为，对e光的折射率为，而加拿大树胶的折射率为。在方解石与树胶的分界面上，O光是从光密媒质入射到光疏媒质，且它的入射角为77o，已超过全反射临界角（约为69o），产生全反射而不能通过，被棱镜侧面吸收。而e光则穿越整个棱镜透过胶合面后，并从第二块棱镜射出，射出光的偏振方向在棱镜的主截面内。这样，透过尼科耳棱镜的光就是完全偏振光。尼科耳棱镜即可作起偏振器使用，也可以作为检偏振器使用。尼科尔棱镜的优点是对各色可见光透明度都很高，并能够均匀完全起偏。但天然方解石价格昂贵，制造比较困难。图5-3中(a)为方解石的双折射现象，(b)为尼科耳棱镜的主截面图。现在是78页\一共有129页\编辑于星期六自然光射入某些晶体时可以产生振动方向互相垂直的两束直线偏振光，同时将其中一束强列吸收，另一束通过，晶体的这种性能叫晶体的二色性。偏振片是一种使自然光变为偏振光的人造透明薄片，由于面积大成本低而被广泛应用。用具有二色性的晶体制造的偏振片可用来产生偏振光。例如，电气石晶体能够强烈吸收寻常光线，1mm厚的电气石晶体即可把寻常光线全部吸收而让非常光线通过，产生一束非常光线的偏振光。另外一种偏振片是用聚乙烯醇膜来制造的。将聚乙烯醇的分子拉伸成为线性结构，平行排列，则其薄膜只允许平行分子排列方向振动的光通过，而产生直线偏振光。现在是79页\一共有129页\编辑于星期六起偏和检偏起偏：使自然光（或非线偏振光）变成线偏振光的过程检偏：检查入射光的偏振性的过程在偏光显微镜中能产生偏振光的偏振片叫起偏振镜，另外在起偏振镜后面还有一个检偏振镜(或叫分析器)。现在是80页\一共有129页\编辑于星期六当两个偏振镜振动轴平行时，起偏振镜A产生的偏振光可以完全通过B检偏镜；当A、B振动轴成一定角度时，A产生的偏振光只有部分能通过检偏镜B，而当A与B的振动轴垂直时，A产生的偏振光完全被B阻挡，产生消光现象。现在是81页\一共有129页\编辑于星期六偏振光经过旋转的检偏器后光强发生变化.起偏器检偏器自然光线偏振光....现在是82页\一共有129页\编辑于星期六偏振光经过旋转的检偏器后光强发生变化.起偏器检偏器自然光线偏振光....现在是83页\一共有129页\编辑于星期六偏振光经过旋转的检偏器后光强发生变化.起偏器检偏器自然光线偏振光....现在是84页\一共有129页\编辑于星期六偏振光经过旋转的检偏器后光强发生变化.起偏器检偏器自然光线偏振光....现在是85页\一共有129页\编辑于星期六如果是圆偏振光，用检偏振镜检查时不发生消光现象，光的强度不发生变化。如果是椭圆偏振光，用检偏振镜检查量不发生消光现象，但光的强度要发生变化，当B的振动轴与椭圆长轴重合时，光的强度最大，与椭圆的短轴重合时，光的强度最小。现在是86页\一共有129页\编辑于星期六偏光显微镜将普通光改变为偏振光进行镜检,以鉴别某一物质具有单折射性(各向同性)或双折射性(各向异性)分辨率可达0.04微米双折射性是晶体的基本特性。因此，偏光显微镜被广泛地应用在矿物，化学等领域。在生物学中，很多结构也具有双折射性，可以用偏光显微镜来鉴别纤维、染色体、纺锤丝、淀粉粒、细胞壁、细胞质和组织中是否含有晶体。现在是87页\一共有129页\编辑于星期六偏光显微镜必须具备以下附件：（a）起偏镜（b）检偏镜（c）专用无应力物镜（d）旋转载物台。现在是88页\一共有129页\编辑于星期六偏光镜检术的方式：（一）正相镜检（Orthscope）:又称无畸变镜检，其特点是使用低倍物镜，不用伯特兰透镜（BertrandLens）,同时为使照明孔径变小，推开聚光镜的上透镜。正相镜检用于检查物体的双折射性。（二）锥光镜检（Conoscope）：又称干涉镜检，这种方法用于观察物体的单轴或双轴性。现在是89页\一共有129页\编辑于星期六偏光镜检术的要求：（一）载物台的中心与光轴同轴。（二）起偏镜和检偏镜应处于正交位置。（三）制片不宜过薄。现在是90页\一共有129页\编辑于星期六偏光显微镜在装置上的要求：（一）光源：最好采用单色光，因为光的速度，折射率，和干涉现象由于波长的不同而有差异。一般镜检可使用普通光。（二）目镜：要带有十字线的目镜。（三）聚光镜：为了取得平行偏光，应使用能推出上透镜的摇出式聚光镜。（四）伯特兰透镜：这是把物体所有造成的初级相放大为次级相的辅助透镜。现在是91页\一共有129页\编辑于星期六偏振光装置的调整及使用偏光显微镜是在一般显微镜光路中，加入两偏振片构成，即在入射光路中加入一个起偏振片，在观察镜中加入一个检偏振片，就可以实现偏振光照明。除了起偏振镜和检偏振镜外，有时还加入一个灵敏色片，用来检验椭圆偏振光，并获得色偏振。1、起偏振镜位置的调整起偏镜一般安装在可以转动的圆框内，借助手柄转动调节，调节的目的是为了使起偏振镜出来的偏振光动面水平，以保证垂直照明器平面玻璃反射进入物镜的偏振光强度最大，且仍为直线偏振光。调整方法，是将经过抛光而未经腐蚀的不锈钢试样(光性均质体)放在载物台上，除去检偏振镜，只装起偏振镜，从目镜内观察聚焦后试样磨面上反射光的强度，转动起偏振镜，反射光强度发生明暗变化，当反射光最强时，就是起偏振镜振动轴的正确位置。现在是92页\一共有129页\编辑于星期六2、检偏振镜位置的调整：起偏振镜位置调整好后，装入检偏振镜，调节检偏振镜的位置，当在目镜中观察到最暗的消光现象时，就是检偏振镜与偏振镜正交的位置。在实际观察中，常将检偏振镜作一个小角度的偏转，以增加显微组织的衬度。其偏转的角度由刻度盘上的刻度指示出来。若将检偏振镜在正交位置转动90°，则两偏振镜振动轴平行，这时和一般光线下照明的效果相同。许多金相显微镜在出厂时已经把起偏振镜或偏振镜的振动轴的方向固定好，只要调节另一个偏振镜的位置就可以了。3、物台中心位置的调整：利用偏振光鉴别物相时，经常需要将载物台作360°旋转，为使观察目标在载物台旋围时不离开视域，在使用前必须调节载物台的机械中心与显微镜的光学系统主轴重合。一般是通过载物台上的对中螺钉进行调整。现在是93页\一共有129页\编辑于星期六偏光显微镜的照明:偏光显微镜也和一般显微镜照明一样，分为明场照明和暗场照明两种照明方式。现在是94页\一共有129页\编辑于星期六在生物领域应用：偏光显微镜是利用光的偏振特性对具有双折射性物质进行研究鉴定的必备仪器,可供广大用户做单偏光观察，正交偏光观察，锥光观察。利用不同的纤维蛋白结构显示出明显的各向异性，使用偏光显微镜可得到这些纤维中分子排列的详细情况。如胶原蛋白、细胞分裂时的纺缍丝等。矿物质、化学物品鉴别；鉴别纤维、染色体、淀粉粒、细胞中晶体；植物病理检验；鉴别骨骼、牙齿、胆固醇、神经纤维、肿瘤细胞、横纹肌和毛发等现在是95页\一共有129页\编辑于星期六偏光显微镜的成像光路图现在是96页\一共有129页\编辑于星期六花粉粒简易偏光效果现在是97页\一共有129页\编辑于星期六淀粉十字偏光效果图现在是98页\一共有129页\编辑于星期六现在是99页\一共有129页\编辑于星期六六、倒置显微镜倒置显微镜的组成与普通显微镜相同,不同的是光源在载物台上,物镜与照明系统在载物台下,与其它显微镜的结构位置相反,故称倒置显微镜.一般具有相差物镜，用于观察培养的活细胞。现在是100页\一共有129页\编辑于星期六结构和使用特点：1、长工作距离聚光器，其上一般带有滤光片，孔径光阑。2、物镜有较长的工作距离。3、记录装置：安装有摄影镜筒，可进行缩时电影，观察生命活动过程。倒置显微镜中最常用的观察方法就是相差。由于这种方法不要求染色，是观察活细胞和微生物的理想方法。这种方法提供带有自然背景色的、高对比度的、高清晰度的图像。

现在是101页\一共有129页\编辑于星期六倒置显微镜操作步骤2.开机。接连电源。打开镜体下端的电控开关。3.使用：1）准备：将待观察对象置于载物台上。旋转三孔转换器，选择较小的物镜。观察，并调节铰链式双目目镜，舒适为宜。（2）调节光源：推拉调节镜体下端的亮度调节器至适宜。通过调节聚光镜下面的光栅来调节光源的大小。（3）调节像距：转三孔转换器，选择合适倍数的物镜；更换并选择合适的目镜；同时调节升降，以消除或减小图像周围的光晕，提高了图像的衬度。（4）观察：通过目镜进行观察结果；调整载物台，选择观察视野。4.关机：取下观察对象，推拉光源亮度调节器至最暗。关闭镜体下端的开关，并断开电源。旋转三孔转换器，使物镜镜片置于载物台下侧，防止灰尘的沉降。现在是102页\一共有129页\编辑于星期六倒置显微镜应用倒置显微镜用于微生物、细胞、细菌、组织培养、悬浮体、沉淀物等的观察，可连续观察细胞、细菌等在培养液中繁殖分裂的过程，并可将此过程中的任一形态拍摄下来。在细胞学、寄生虫学、肿瘤学、免疫学、遗传工程学、工业微生物学、植物学等领域中应用广泛现在是103页\一共有129页\编辑于星期六显微操作用于培养细胞的观察或者显微注射，核移植等精细操作操作等。现在是104页\一共有129页\编辑于星期六显微操作仪转基因操作现在是105页\一共有129页\编辑于星期六七、解剖显微镜又被称为实体显微镜或体视显微镜，是为了不同的工作需求所设计的显微镜。利用解剖显微镜观察时，进入两眼的光各来自一个独立的路径，这两个路径只夹一个小小的角度，因此在观察时，样品可以呈现立体的样貌。现在是106页\一共有129页\编辑于星期六其特点为：视场直径大、焦深大这样便于观察被检测物体的全部层面；虽然放大率不如常规显微镜，但其工作距离很长；像是直立的，便于实际操作，这是由于在目镜下方的棱镜把象倒转过来的缘故。现在是107页\一共有129页\编辑于星期六其光学结构原理是由一个共用的初级物镜，对物体成像后的两个光束被两组中间物镜亦称变焦镜分开，并组成一定的角度称为体视角（一般为12度--15度），再经各自的目镜成像，它的倍率变化是由改变中间镜组之间的距离而获得，利用双通道光路，双目镜筒中的左右两光束不是平行，而是具有一定的夹角，为左右两眼提供一个具有立体感的图像。它实质上是两个单镜筒显微镜并列放置，两个镜筒的光轴构成相当于人们用双目观察一个物体时所形成的视角，以此形成三维空间的立体视觉图像。现在是108页\一共有129页\编辑于星期六附件根据实际的使用要求，目前的体视显微镜可选配丰富的附件，比如若想得到更大的放大倍数可选配放大倍率更高的目镜和辅助物镜，可通过各种数码接口和数码相机、摄像头、电子目镜和图像分析软件组成数码成像系统接入计算机进行分析处理，照明系统也有反射光、透射光照明，光源有卤素灯、环形灯、荧光灯、冷光源等等。现在是109页\一共有129页\编辑于星期六体视显微镜在使用前的调校主要有：调焦，视度调节，瞳距调节和灯泡更换几个步骤。下面分别进行说明。调焦：将工作台板放入底座上的台板安装孔内。观察透明标本时，选用毛玻璃台板；

观察不透明标本时，选用黑白台板。然后松开调焦滑座上的紧固螺钉，调节镜体的高度，使其与所选用的物镜放大倍数大体一致的工作距离。调好后，须锁紧紧固螺钉。调焦时，建议选用平面物体，如印有字符的平整纸张、直尺、三角板等。视度调节：先将左右目镜筒上的视度圈均调至0刻线位置。通常情况下，先从右目镜筒中观察。将变倍手轮转至最低倍位置，转动调焦手轮和视度调节圈对标本进行调节，直至标本的图像清晰后，再把变倍手轮转至最高倍位置继续进行调节直到标本的图像清晰为止，此时，用左目镜筒观察，如不清晰则沿轴向调节左目镜筒上的视度圈，直到标本的图像清晰为止。现在是110页\一共有129页\编辑于星期六瞳距调节：扳动两目镜筒，可以改变两目镜筒的出瞳距离。当使用者观察视场中的两个圆形视场完全重合时，说明瞳距已调节好。应该注意的是由于个体的视力及眼睛的调节差异，因此，不同的使用者或即便是同一使用者在不同时间使用同一台显微镜时，应分别进行齐焦调整，以便获得最佳的观察效果。灯泡更换：无论是更换上光源灯泡，还是更换下光源灯泡，在更换前，请务必将电源开关关上，电源线插头一定要从电源插座上拔下。当更换上光源灯泡时，先拧出上光源灯箱的滚花螺钉，取下灯箱，然后从灯座上卸下坏灯泡，换上好灯泡，再把灯箱和滚花螺钉装上即可。当更换下光源灯泡时，需将毛玻璃台板或黑白台板，从底座上取出，然后从灯座上取下坏灯泡，换上好灯泡；再把毛玻璃台板或黑白台板装好即可。更换灯泡时，请用干净的软布或棉纱将灯泡玻壳擦拭干净，以保证照明效果。现在是111页\一共有129页\编辑于星期六最常的用途1.解剖实验：当要解剖细微部分时，需要放大观察。2.微小生物生态：如昆虫或其它小动物、植物的生态观察。3.花粉的形态及萌芽的过程，从而加深对花粉的认识。4.植物的组织和动物的组织观察。5.藻类、蕨类孢子体及配子体的形态与构造.现在是112页\一共有129页\编辑于星期六广泛应用根据体视显微镜这些光学原理和特点决定了它在工业生产和科学研究中的广泛应用。比如在生物、医学领域用于切片操作和显微外科手术；在工业中用于微小零件和集成电路的观测、装配、检查等工作。现在是113页\一共有129页\编辑于星期六八、激光共聚焦扫描显微镜激光共聚焦扫描显微镜是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。其组成除光学显微镜部分之外主要由激光光源、扫描装置、检测器、计算机系统（包括数据采集，处理，转换，应用软件）、图象输出设备、光学装置和共聚焦系统组成。在生物医学等研究领域中发挥重要作用，尤其在研究和分析活细胞结构、分子、离子的实时动态变化过程，组织和细胞的光学连续切片和三维重建等方面，是传统的光学显微镜所望尘莫及的。现在是114页\一共有129页\编辑于星期六现在是115页\一共有129页\编辑于星期六观察方式：以荧光为主光源：激光（紫外、可见光、近红外）照明方式：点照明、逐点扫描成像方式：共聚焦、逐点成像输出：实时观测,数字化图像，可以进行图像处理和定量分析多重染色样品的观察LSCM的基本特点现在是116页\一共有129页\编辑于星期六

LSCM的主要组成部分及照明针孔：使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。且与探测器针孔及焦平面形成共聚焦装置。光束分离器：将样品激发荧光与其他非信号光线分开。物镜焦平面：激光点光源照射物体在焦平面处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。该光斑经过objective,beamsplitter等一系列装置的处理，分别在illuminatingpinhole及detectorpinhole两处聚焦。共聚焦的含义由此而来。探测器针孔：与beamsplitter作用类似，起到空间滤波器的作用。最大限度的阻碍非聚焦平面散射光和聚焦平面上非焦点斑以外的散射光，以保证探测器针孔所接受到的荧光信号全部来自于样品光斑焦点位置，因此样品上衍射聚集光斑和探测器针孔成像光斑包含相同信息（两点共轭）。现在是117页\一共有129页\编辑于星期六PMT：光电倍增管（探测器）：接受通过针