免疫标记技术节荧光免疫技术

免疫标记技术节荧光免疫技术第1页，共52页，2023年，2月20日，星期三第十七章荧光免疫技术第2页，共52页，2023年，2月20日，星期三荧光免疫技术的基本原理荧光的基本知识荧光抗体染色的方法及其原理荧光抗体的制备荧光免疫测定的类型及其原理免疫荧光技术在医学检验中的应用本章要点第3页，共52页，2023年，2月20日，星期三目录基本知识1荧光免疫显微技术2时间分辨荧光免疫测定3荧光偏振免疫测定4免疫芯片技术5第4页，共52页，2023年，2月20日，星期三荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光检测技术的敏感性和直观性相结合而建立的一种标记免疫技术。前言第5页，共52页，2023年，2月20日，星期三第一节基本知识荧光免疫技术：用荧光素标记Ab或Ag，与待测标Ag或Ab结合，通过检测荧光，确定标本中有无相应的Ab或Ag。AbF（AgF）+Ag（Ab）AbF-Ag/（AgF–Ab）荧光激发光检测

分类荧光免疫分析

（定量）荧光抗体技术（定位、定性）第6页，共52页，2023年，2月20日，星期三一、荧光的基本知识荧光（fluorescence）

荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，发射出的波长大于激发光波长的光。基态发射光（荧光）基态（荧光物质）激发态发射光谱激发光谱激发光第7页，共52页，2023年，2月20日，星期三荧光效率荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率。

发射荧光的光量子数（荧光强度）吸收光的光量子数（激发光强度）荧光效率=第8页，共52页，2023年，2月20日，星期三荧光寿命

荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度所用的时间。各种荧光物质的荧光寿命不同。荧光淬灭荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、高温（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等。*荧光免疫检测中避免荧光淬灭的发生；消除非特异性荧光（本底）的干扰。第9页，共52页，2023年，2月20日，星期三Stokes位移荧光物质从激发态回到基态的过程中，由于部分能量丢失而导致发射光波长比激发光波长，两者波长之差。荧光偏振荧光物质经单一平面的偏振光照射后，吸收光能并发出单一平面的偏振荧光的现象。第10页，共52页，2023年，2月20日，星期三

二、常用的荧光物质荧光物质最大吸收光谱最大发射光谱应用异硫氰酸荧光素(FITC)490nm～495nm520nm～530nm（黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹明(RB200)570nm～575nm595nm～600nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)550nm620nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT藻红蛋白（PE）490nm-560nm595nm（红色）双标记FAT、流式细胞术碘化丙啶（PI）488nm620nm橙红色Eu3+螯合物340nm613nm时间分辨荧光免疫测定第11页，共52页，2023年，2月20日，星期三三、荧光抗体的制备荧光素搅拌法透析法制备免疫血清亲和层析离子交换层析法纯化抗体标记抗体纯化透析法凝胶过滤法鉴定实际应用第12页，共52页，2023年，2月20日，星期三第二节荧光免疫显微技术定性和定位检测，或对自身抗体进行定性和滴度测定荧光素标记抗体与标本片中组织或细胞抗原结合，洗涤除去游离的荧光抗体后，于荧光显微镜下观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。第13页，共52页，2023年，2月20日，星期三

AbF+Ag（组织/细胞）AbF-Ag检测特异性荧光紫外线一、基本原理第14页，共52页，2023年，2月20日，星期三二、方法类型1.直接法2.间接法3.双标记法第15页，共52页，2023年，2月20日，星期三固定Ag（待测）＋Ab*——AgAb*快，直接、干扰因素少；常用于检测Ag

特异性高但敏感度偏低检测一种Ag，需标记一种Ab，较麻烦Ag？

AbF直接法第16页，共52页，2023年，2月20日，星期三制备一种荧光抗体，可检测多种Ag或Ab既可检测Ag，又可检测Ab。灵敏度高间接法荧光素标记抗抗体AgAb抗－Ab*第17页，共52页，2023年，2月20日，星期三双标记法两种荧光素分别标记两种不同的特异性抗体，与同一标本不同抗原表位反应，荧光显微镜观察两种颜色荧光。如：具CD3、CD4表位的Th细胞。ThCD3CD4（FITC黄绿）（RB200橘红）第18页，共52页，2023年，2月20日，星期三三、关键技术1.标本制作2.荧光抗体染色3.荧光显微镜检查4.荧光抗体染色结果判读第19页，共52页，2023年，2月20日，星期三标本制作组织切片：冷冻切片、石蜡切片印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织涂片：各种体液、穿刺液、细菌和细胞悬液培养细胞：单层培养细胞冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细胞结构欠清晰石蜡切片：组织细胞结构清楚，抗原损失多固定剂：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等

保存：4℃、-20℃第20页，共52页，2023年，2月20日，星期三荧光抗体染色于已固定的标本上滴加经相关试剂（含适当稀释的荧光抗体），置湿盒内25℃～37℃温育30分钟左右或4℃过夜；然后用PBS充分洗涤，待干燥后镜检。第21页，共52页，2023年，2月20日，星期三荧光显微镜检查（荧光显微镜）

光源：高压汞灯氙灯或卤素灯滤光片：隔热、激发和吸收光路：透射光、落射光聚光器：明视野、暗视野相差聚光器镜头：消色差镜头第22页，共52页，2023年，2月20日，星期三隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。激发滤光片：位于光源和物镜之间，使紫外线（激发光）透过。吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光透过，保护眼睛。荧光显微镜的基本结构第23页，共52页，2023年，2月20日，星期三透射光：照明光线从标本下方经聚光器透过标本进入物镜。落射光：照明光线从标本上方落射到标本上，经反射进入物镜。透射荧光光路(a)落射荧光光路(b)荧光显微镜光路图光路荧光显微镜的基本结构第24页，共52页，2023年，2月20日，星期三设立实验对照:阳性对照和阴性对照区分特异和非特异染色阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型三、荧光抗体染色及结果判断荧光显微镜检查（结果判断）

“-”：无或极微弱“+”：较弱但清晰可见“++”：明亮“+++”：耀眼对照光：“-”或“±”阳性：特异荧光强度“+”以上效价：呈"+"的血清最高稀释度第25页，共52页，2023年，2月20日，星期三四、方法评价与应用方法评价优点：可用于抗原或抗体的定位、定性检查，既有抗原抗体反应的高度特异性，又能在荧光显微镜下清晰地显示其形态，直观性强。

缺点：荧光容易消退，难以制备永久性标本，非特异荧光常干扰结果判断。第26页，共52页，2023年，2月20日，星期三第四节应用自身抗体检测抗核抗体(均质型)抗核抗体(核膜型)抗核抗体(斑点型)一、荧光抗体技术的应用临床应用第27页，共52页，2023年，2月20日，星期三病原体检测寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）荧光抗体技术的应用细菌（藤黄微球菌)第28页，共52页，2023年，2月20日，星期三荧光免疫技术可用于淋巴细胞表面CD抗原、抗原受体、补体受体、Fc受体等的检测以及淋巴细胞及其亚群的鉴定和计数。荧光抗体技术的应用细胞表面抗原和受体检测第29页，共52页，2023年，2月20日，星期三其他：如免疫病理、肿瘤等检测肿瘤抗原（人肝癌细胞）荧光抗体技术的应用第30页，共52页，2023年，2月20日，星期三第三节时间分辨荧光免疫测定（timeresolvedfluoro-immunoassay,TRFIA）

时间分辨荧光免疫检测系统第31页，共52页，2023年，2月20日，星期三第三节时间分辨荧光免疫测定（timeresolvedfluoro-immunoassay,TRFIA）

用镧系元素标记抗原或抗体，并与时间分辨技术相结合而建立的一种新型超微量物质免疫分析方法，具有灵敏度高、特异性强、发光稳定、自然荧光干扰少、标准曲线范围宽等特点，已在临床实验中广泛应用。第32页，共52页，2023年，2月20日，星期三AgEu3＋/AbEu3＋+Ag/Ab检测一、基本原理AgEu3＋-Ab/AbEu3＋-Ag?Ab/Ag

荧光寿命长：10μs-1000μs，时间差—

时间分辨

Stokes位移大：270nm，易分辨第33页，共52页，2023年，2月20日，星期三时间分辨短寿命荧光长寿命荧光第34页，共52页，2023年，2月20日，星期三Eu3+元素的stokes位移第35页，共52页，2023年，2月20日，星期三二、方法类型12

3双抗体夹心法固相抗体竞争法固相抗原竞争法第36页，共52页，2023年，2月20日，星期三Eu增强液激发Eu固相Ab待检AgEu标记Ab每一步均需洗涤Eu解离发光双抗体夹心法第37页，共52页，2023年，2月20日，星期三增强液激发固相AbAg？AgEu3+荧光强度与待检抗原含量成负相关固相抗体竞争法第38页，共52页，2023年，2月20日，星期三增强液激发固相AgAg？AbEu3+荧光强度与待检抗原含量成负相关固相抗原竞争法第39页，共52页，2023年，2月20日，星期三三、方法评价

灵敏度高：最小检出量10-18mol/L分析范围宽：4～5个数量级

标记物稳定：有效使用期长

测量快速，易自动化易受污染，本底增高第40页，共52页，2023年，2月20日，星期三四、临床应用广泛用于微量或超微量物质的检测，如各种激素（肽类激素、甲状腺激素、类固醇激素等）、蛋白质、酶、药物、肿瘤标记物及病毒抗原等的测定。第41页，共52页，2023年，2月20日，星期三第四节荧光偏振免疫测定（fluorescencepolarizationimmunoassay,FPIA）

荧光偏振免疫测定是利用抗原抗体竞争反应原理，根据荧光素标记抗原与其抗原抗体复合物之间荧光偏振程度的差异，测定液体中小分子物质的含量。第42页，共52页，2023年，2月20日，星期三一、基本原理

荧光物质经激发光照射后，可发出偏振荧光，其强弱程度与荧光分子的大小呈正相关荧光素标记的小分子抗原（AgF）偏振荧光弱；而形成的AgF-Ab分子增大，偏振荧光强反应体系中待测Ag与AgF竞争结合已知抗体，故待测Ag越多，形成AgF-Ab越少，游离AgF多，故待检Ag含量与偏振荧光强度成反比第43页，共52页，2023年，2月20日，星期三

（一）FPIA原理荧光偏振免疫测定示意图第44页，共52页，2023年，2月20日，星期三二、方法评价荧光素标记试剂稳定，使用寿命长重复性好快速，易自动化适于小、中等分子物质检测仪器设备昂贵，试剂盒专属性强灵敏度较非均相荧光免疫测定法低第45页，共52页，2023年，2月20日，星期三三、临床应用主要用于测定小分子抗原物质，是临床药物浓度测定的首选方法，目前已有多种药物、激素、毒品和常规生化项目可以用本方法进行分析，如环孢素、苯妥英钠、卡马西平、地高辛、丙戊酸、苯巴比妥、氨茶碱及鸦片浓度等测定。第46页，共52页，2023年，2月20日，星期三第五节免疫芯