微生物发酵产酶

微生物发酵产酶第1页/共83页微生物发酵产酶

目前工业用酶大多数来自微生物。经过预先设计，通过人工操作，利用微生物细胞的生命活动获得所需酶的技术过程称为酶的发酵生产。

酶的发酵生产是现在酶生产的主要方法。第2页/共83页第3页/共83页第4页/共83页第5页/共83页第6页/共83页

酶发酵生产的前提之一：选育到性能优良的产酶微生物！对产酶微生物的要求：

（1）产酶量高；（2）易培养和管理；（3）产酶性能稳定；（4）利于酶产品的分离纯化；（5）安全可靠、无毒性等。第7页/共83页

酶发酵生产的类型1、固体培养发酵：主要适于各种霉菌的发酵产酶

培养基以麸皮、米糠等为主要原料，经灭菌后，接入产酶菌株，在一定条件下发酵。exp:

麸皮、米糠酒曲、酱油曲淀粉酶、蛋白酶优点：设备简单，操作方便，酶浓度高。缺点：劳动强度大，原料利用率低，生产周期长。第8页/共83页2、液体深层发酵（目前酶发酵生产的主要方式）

液体培养基，经灭菌、冷却后，接入产酶细胞，在一定条件下发酵。适于微生物、动植物细胞。优点：机械化强度高，酶产率高，产品回收率高缺点：技术管理要求高第9页/共83页3、固定化细胞发酵（70年代后期发展）

将细胞固定在载体上后，进行发酵生产。优点：细胞密度高，可反复使用，利于产品分离纯化缺点：需要特殊的固定化细胞反应器，只适用胞外酶生产4、固定化原生质体发酵（80年代中期发展）

原生质体是指除去了细胞壁的微生物细胞或植物细胞。优点：解除细胞壁扩散阻碍；易于细胞间质中的酶的分泌；可反复或连续使用缺点：制备复杂，维持较高的渗透压，需防止细胞壁再生第10页/共83页第一节微生物细胞中酶生物合成的调节一、酶生物合成的基本过程DNARNA蛋白质（新生多肽链）成熟蛋白质（酶）胞内胞外转录翻译加工分泌或定位第11页/共83页二、酶生物合成的调节定义：通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，主要是在基因转录水平上进行的。意义：通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。第12页/共83页

按酶生物合成的速度，把细胞中合成的酶分为两类：组成酶—恒定（速度、浓度）诱导酶—在外界环境因素诱导下合成速度急增，酶浓度成百上千倍增加(适应型酶、调节型酶)第13页/共83页1960，Jacob和Monod提出的操纵子学说阐明；与生物合成相关的四个基因：调节基因Regulatorgene；启动基因Promotergene；操纵基因Operatorgene；结构基因Structuralgene；第14页/共83页

调节基因(R)：

可产生一种变构蛋白，通过与效应物(effector)（包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。调节基因常位于调控区的上游。第15页/共83页启动基因（P）（启动子）：

有两个位点：（1）RNA聚合酶的结合位点（2）cAMP-CAP的结合位点。CAP：分解代谢物活化剂蛋白，又称环腺苷酸受体蛋白(cAMPreceptorprotein，CRP）。

第16页/共83页操纵基因（Operatergene）:

位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。结构基因（Structuralgene）:

决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质。第17页/共83页酶合成的基因调控类型：诱导和阻遏1、酶合成的诱导作用

加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速进行的现象，称为诱导作用。诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物。

例：乳糖诱导ß-半乳糖苷酶的合成淀粉诱导a-淀粉酶的合成第18页/共83页2、酶合成的阻遏（1）终产物阻遏

指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。（2）分解代谢物阻遏

是指某些物质经过分解代谢产生的物质阻遏其他酶合成的现象。

葡萄糖阻遏ß-半乳糖苷酶的生物合成果糖阻遏a-淀粉酶的生物合成A1B1A2B2E×A→→→→→BE×色氨酸过量时会阻遏催化色氨酸合成的相关酶第19页/共83页三、酶生物合成的模式第20页/共83页微生物细胞在一定条件下培养生长，其生长过程一般经历调整期、生长期、平衡期和衰退期等4个阶段调整期对数生长期平衡期衰亡期时间细胞数量的对数（一）微生物生长曲线（Microbialgrowthcurve）第21页/共83页（二）酶生物合成的模式

（1）同步合成型（2）延续合成型（3）中期合成型（4）滞后合成型

通过分析比较细胞生长与酶产生的关系,可以把酶的生物合成的模式分为4种类型：第22页/共83页1、同步合成型酶的生物合成与细胞的生长同步进行，又称生长偶联型。大部分组成酶和部分诱导酶的生物合成属于同步合成型。特点：（1）发酵开始，细胞生长，酶也开始合成，说明不受分解代谢物和终产物阻遏。（2）生长至平衡期后，酶浓度不再增长，说明mRNA很不稳定。时间(h)浓度细胞浓度酶浓度第23页/共83页2、中期合成型酶的合成在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期后，酶的合成也停止。特点：（1）该类酶的合成受分解代谢物阻遏。（2）该酶对应的mRNA不稳定。浓度酶浓度细胞浓度时间(h)第24页/共83页3、延续合成型酶的合成伴随着细胞生长而开始，但在细胞进入平衡期后，酶还可以延续合成较长的一段时间。特点：（1）该类酶不受分解代谢产物阻遏和终产物阻遏。（2）该酶对应的mRNA是相当稳定的。时间(h)浓度细胞浓度酶浓度第25页/共83页4、滞后合成型只有当细胞生长一段时间或者进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。特点：（1）该类酶受分解代谢物阻遏作用的影响，阻遏解除后，酶才大量合成。（2）该酶对应的mRNA稳定性高。时间(h)浓度酶浓度细胞浓度第26页/共83页

属于滞后合成型的酶，之所以要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成，主要原因是由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶才开始大量合成。若培养基中不存在阻遏物，该酶的合成可以转为延续合成型。该类型酶所对应的mRNA稳定性很好，可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一段时间内，继续进行酶的生物合成。第27页/共83页同步合成型中间合成型延续合成型滞后合成型酶合成起始时间酶合成停止时间产酶与生长相关特点生长与酶合成偶联度酶mRNA稳定性酶生物合成与生长关联式比较生长开始对数期生长开始平衡期衰亡期平衡期后平衡期平衡期同起同停晚起晚停同起晚停晚起同停非偶联过渡偶联紧密偶联很稳定较稳定不稳定不稳定第28页/共83页小结：影响酶生物合成模式的主要因素：培养基中阻遏物的存在和mRNA的稳定性。（1）不受培养基中某种物质阻遏时，可随着细胞生长而开始合成；受阻遏的酶，要在细胞生长一段时间或进入平衡期后，解除阻遏，酶才开始合成。（2）mRNA稳定性高的，可在细胞停止生长后继续合成其对应的酶；稳定性差的，随着细胞生长停止而终止酶的合成。第29页/共83页

选择：在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵周期，最理想的合成模式是延续合成型。

改造非理想模式：在细胞选育上下功夫，并适当调节工艺条件：（1）同步合成型：适当降低发酵温度，尽量提高酶所对应的mRNA的稳定性。（2）中期合成型：要从解除阻遏和提高mRNA的稳定性两方面进行努力。（3）滞后合成型在发酵过程中要尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使酶的合成提早开始。选择与改造第30页/共83页第二节产酶微生物的特点用于酶发酵生产的微生物必需具备的条件：（1）酶的产量高（2）容易培养和管理（3）产酶稳定性好（4）利于酶的分离纯化（5）安全可靠第31页/共83页新开发的酶必须按规定进行下表的各项检查项目试验动物急性中毒鼠,大白鼠口服4周大白鼠12月狗致癌试验:24月两重啮齿动物畸胚组织发生试验(24月)两重啮齿动物生产病原性试验四种动物皮肤刺激性试验(肤,眼)兔子,人抗原性人第32页/共83页（一）常用的产酶微生物第33页/共83页1、细菌大肠杆菌（Escherichiacoli）形态：杆状，革兰氏阴性，运动或不运动，无芽孢，一般无荚膜。菌落呈白色至黄白色，扩展，光滑，闪光。

大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致病的，会引起腹泻和尿路感染。易于在实验室操作、生长迅速，而且营养要求低。应用最广泛的产酶菌，一般分泌胞内酶。常在工业生产中应用于生产谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、限制性核酸内切酶等。第34页/共83页醋酸杆菌（Acetobacter）

菌体从椭圆至杆状，单个、成对或成链，革兰氏阴性，不生芽孢。含糖、乙醇和酵母膏的培养基上生长良好。应用：有机酸(食醋等）葡萄糖异构酶(高果糖浆)第35页/共83页枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）

直状、近直状的杆菌，周生或侧生鞭毛，革兰氏阳性，无荚膜。枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、5’-核苷酸酶。第36页/共83页2、放线菌(Actinomycetes)放线菌是一类具有分支状菌丝的单细胞原核微生物,由于菌落呈放射状而得。

放线菌是一类介于细菌和真菌之间的单细胞生物。一方面,放线菌的细胞构造和细胞壁的化学组成与细菌相似,与细菌同属原核生物;另一方面,放线菌菌体呈纤细的菌丝状,而且分支,又以外生孢子的形式繁殖,这些特征又与霉菌相似。放线菌菌落中的菌丝常从一个中心向四周辐射状生长,因此叫放线菌。第37页/共83页放线菌产酶举例链霉菌：葡萄糖异构酶、青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。第38页/共83页3、霉菌（molds）霉菌:是一类丝状真菌。构成霉菌菌（个）体的基本单位称为菌丝（hyphae），呈长管状，可不断自前端生长并分支。在固体基质上生长时，部分菌丝深入基质吸收养料，称为基质菌丝或营养菌丝；向空中伸展的称气生菌丝，可进一步发育为繁殖菌丝，产生孢子。大量菌丝交织成绒毛状、絮状或网状等，称为菌丝体（mycelium）。菌丝体常呈白色、褐色、灰色，或呈鲜艳的颜色，有的可产生色素使基质着色（如赤霉菌等）。霉菌繁殖迅速，常造成食品、用具大量霉腐变质，但许多有益种类已被广泛应用，是人类实践活动中最早利用和认识的一类微生物。第39页/共83页选用不同的霉菌作为发酵菌种，不仅可以酿制酱、酱油、醋、豆腐乳等食品，还可以应用于生产有机酸、酶制剂、维生素、生物碱及激素等多种产品;据统计，在550种酶制剂中有近1/3是霉菌产生的。霉菌与产酶第40页/共83页霉菌产酶举例

第41页/共83页生产糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、过氧化氢酶、脂肪酶等；黑曲霉（Aspergillusniger）第42页/共83页米曲霉（Aspergillusoryzae）生产糖化酶、蛋白酶、氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶等。第43页/共83页红曲霉（Monascus）生产α-淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。第44页/共83页青霉（Penicillium）青霉是世界分布最广的几类真菌之一。生产葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶、纤维素酶等。(一)生活习性

青霉通常在柑桔及其他水果上,冷藏的干酪及被它们的孢子污染的其他食物上均可找到,其分生孢子在土壤内,空气中及腐烂的物质上到处存在，青霉营腐生生活。第45页/共83页(二)形态

青霉的营养体为无色或淡色的菌丝体,菌丝各细胞之间有横隔膜。整个菌丝体分为伸入营养基质中吸取营养的基质菌丝和伸向空气中的气生菌丝。在气生菌丝上产生简单的长而直立的分生孢子梗,分生孢子为球形至卵形,呈绿色,蓝色或黄色,即通常看到的各种青霉菌落特有的颜色。第46页/共83页木霉（Trichoderma）木霉具有较强分解纤维素能力。在木质素、纤维素丰富的基质上生长快，传播蔓延迅速。棉籽壳、木屑、段木都是其良好的营养物。生产纤维素酶的重要菌株。第47页/共83页根霉(Rhizopus)根霉因有假根（Rhizoid）而得名（假根的功能是在培养基上固着，并吸收营养）。分布于土壤、空气中，常见于淀粉食品上，可引起霉腐变质和水果、蔬菜的腐烂。应用：根霉能产生糖化酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶等。第48页/共83页4、酵母

啤酒酵母：丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等。

假丝酵母：脂肪酶、尿酸酶、尿囊酸酶、转化酶、醇脱氢酶等。第49页/共83页（二）生产菌种的来源第50页/共83页1、向菌种中心购买或索取。

中国国家级菌种保藏管理中心（7个）

名称依托单位中国农业微生物菌种保藏管理中心中国农业科学院土壤肥料研究所(ACCC)中国工业微生物菌种保藏管理中心中国食品发酵工业研究院(CICC)中国医学微生物菌种保藏管理中心中国药品生物制品检定所(CMCC)中国兽医微生物菌种保藏管理中心中国兽医药品检定所(CVCC)中国林业微生物菌种保藏管理中心中国林业科学研究院(CFCC)中国抗菌素菌种保藏管理中心中国医科院医药生物技术研究所(CACC)中国普通微生物菌种保藏管理中心中国科学院微生物研究所(CCGMC)

第51页/共83页国外菌种中心AmericanTypeCultureCollection

JapanCollectionofMicroorganismshttp://www.jcm.riken.go.jpTheUnitedKingdomNationalCulturecollectionhttp://www.ukncc.co.ukDeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenhttp://www.dsmz.deATCC美国菌种中心，最大的菌种中心,有病毒、细菌、真菌、细胞等不同的微生物

JCM日本微生物菌种中心英国国家菌种中心，Over70,000micro-organismsandcelllinesareavailable.

德国微生物与细胞收集中心第52页/共83页（1）样品的采集（采样）：主要是各种富含所需微生物的土壤、水、气、枯枝烂叶、烂水果等；产酶菌种筛选步骤：2、筛选

由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。第53页/共83页（2）初筛：分离产目的酶的菌株；

给予特殊的培养基或培养条件，进而让目的菌株得以繁殖，尽可能地把只成为目的菌的菌株分离出来。产-淀粉酶菌株的筛选产蛋白酶菌株的筛选第54页/共83页（3）复筛：从所得菌株中筛选优良株；在初筛的基础上，筛选产酶量高、性能更符合生产要求的菌种。第55页/共83页（三）产酶菌种的保存

保藏方法:斜面保藏法、沙土保藏法、真空冷冻干燥保藏法、低温保藏法、石蜡油保藏法等。第56页/共83页第三节发酵产酶工艺条件及其控制

发酵法生产酶制剂，就是给酶的生产菌种提供适当的营养和生长环境，使生产菌大量增殖，同时合成所需要的酶，然后由发酵所得物料制成酶产品。

现代酶制剂的大规模生产以液体深层发酵法为主。

无论哪种发酵法，都要做三方面的工作：（1）从原料准备培养基；（2）从原始菌种准备生产菌种；（3）发酵过程管理。发酵产酶的一般工艺流程第57页/共83页[原料][原始菌种][麸皮等原料]

↓↓饼粕等原料淀粉质原料试管斜面培养(活化)[配制培养基]

↓

↓

↓(灭菌)按不同原料净化、粉碎摇瓶等分级扩大培养作不同处理↓

↓水解种子罐培养

↓

↓

[淀粉糖液][发酵罐(液体发酵)][发酵池(固体发酵)]

↓↓

↓

培养

配制培养基↓

(灭菌)[发酵液][成品曲]

↓↓

↓下游加工

{液态酶制剂}

↓{固体粗酶制剂}{各种精制酶制剂}酶发酵生产的一般工艺流程图第58页/共83页第59页/共83页

一、生产种子的制备

生产种子：由原始保藏菌种，经过活化，扩大培养，用于发酵罐接种的大量菌体。1、种子制备工艺过程保藏菌种活化培养逐级摇瓶培养种子罐培养接种至发酵罐第60页/共83页（1）菌种活化

目的：保藏的菌种在用于发酵生产之前，必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下培养，以恢复细胞的生命活动能力。

方法：在试管斜面上培养1-3代。（2）扩大培养

目的：活化后的菌种经过一级至数级的扩大培养，以获得足够数量的优质细胞。培养基称为种子培养基。

方法：分为实验室培养和车间培养两个阶段。第61页/共83页扩大培养应注意的事项：（1）尽量减少传代次数，以降低菌种衰退和污染的可能性；（2）培养基成分一般应比发酵培养基的氮源丰富；（3）培养时间一般控制在微生物生长的对数生长期，及时接入下一级培养或发酵罐；（4）严格控制培养条件（pH、温度、通气量等），加强培养过程的实时监测。第62页/共83页二、培养基1、碳源：提供碳元素；能源。

碳源、氮源、无机盐、生长因素、水等。

来源：淀粉及其水解物—淀粉水解糖、糖蜜、或含淀粉的原料如大米、薯类、玉米、麸皮、米糠等。此外有些微生物可以采用脂肪、石油、乙醇等为碳源。

注意：在选择碳源时，应尽量选择对所需酶有诱导作用的碳源，而不使用或少使用有分解代谢物阻遏作用的碳源。

培养基是人工配制的供微生物生长、繁殖及合成酶的营养物质的混合物。第63页/共83页2、氮源：提供氮元素。

来源：①有机氮：常利用农副产品的籽实榨油后的副产品，如豆饼、花生饼、菜子饼等；②无机氮：含氮的无机化合物，如（NH4）2SO4、NH4NO3、NaNO3和（NH4）3PO4等。3、无机盐：大量元素和微量元素。基本功能：构成细胞的成分；构成酶产品的组分；作为酶的激活剂。第64页/共83页4、生长因子

指微生物生长繁殖所必不可缺的微量有机物，主要包括各种氨基酸、嘌呤或嘧啶、维生素等三类物质。

酶制剂中所用的生长因子，大多是由天然原料提供，如玉米浆、麦芽汁、豆芽汁、麸皮、米糠、酵母膏等。5、水第65页/共83页配制培养基的注意事项：（1）培养基的碳氮比是培养基成分配比的重点；（2）碳源和氮源的选择，要注意避免碳分解代谢阻遏和氮分解代谢阻遏；（3）培养基中无机盐的选择要注意盐类引起的生理酸碱性反应；（4）发酵生产所用的培养基成分配比不可轻易改变。第66页/共83页微生物发酵产酶培养基举例1、枯草杆菌BF7658ａ-淀粉酶发酵培养基：玉米粉8%

豆饼粉4%

磷酸氢二钠0.8%

硫酸铵0.4%

氯化钙0.2%

氯化铵0.15%

自然pH第67页/共83页2、黑曲霉糖化酶发酵培养基

玉米粉10%

豆饼4%

麸皮1%pH4.4~5.0第68页/共83页（二）培养基的种类1、斜面培养基：是供菌种生长繁殖使用的。2、种子培养基：是供菌种生长繁殖使用的。3、发酵培养：是供菌种生长繁殖和发酵产物合成之用。第69页/共83页三、发酵条件的控制1、温度的调节控制（2）有些微生物生长最适温度与发酵产酶的最适温度有所不同。例：酱油曲霉生产蛋白酶，28℃时蛋白酶产量比在40℃条件下高2~4倍，在20℃条件下发酵，则蛋白酶产量更高，但细胞生长速率较慢。

为此，在有些酶的发酵生产过程中，要在不同的发酵阶段控制不同的温度，即在微生物生长阶段控制在生长的最适温度范围，而在产酶阶段控制在产酶最适温度范围。（1）不同的微生物有不同的最适生长温度。第70页/共83页（3）温度的控制方法

一般采用热水升温，冷水降温。因此，在发酵罐中均设有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管，夹套、喷淋管等。第71页/共83页第72页/共83页2、pH值的调节控制（1）不同微生物，其生长繁殖的最适pH值有所不同。（2）微生物生长的最适pH值与产酶最适pH值往往不同。（3）有些微生物可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的pH，往往可以改变各种酶之间的产量比例。黑曲霉α-淀粉酶糖化酶pH值中性↑↓pH值偏酸性↓

↑

第73页/共83页（4）影响pH值的因素一般来说，培养基成分中C/N比高，发酵液倾向于酸性，pH低；C/N比低，发酵液倾向于碱性