微生物学大实验终稿

微生物学大实验终稿第1页/共144页实验流程土壤样品中微生物的分离纯化细菌酵母菌霉菌放线菌形态结构观察生理生化反应nisin效价测定生长曲线测定形态观察死活细胞鉴定直接计数测微技术形态结构观察培养菌种保藏第2页/共144页土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏

第3页/共144页相关理论知识（1）微生物的分离与纯化

从混杂的微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程。常用的分离、纯化方法微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏

第4页/共144页相关理论知识（2）土壤生境

土壤是微生物生活的大本营，所含微生物无论数量还是种类都极其丰富,因此,土壤是微生物多样性生长的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本实验将采用不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。

土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏

第5页/共144页相关理论知识（3）乳酸菌乳酸菌是一类能在碳水化合物发酵过程中产生大量乳酸的细菌，在酸奶中大量存在。乳酸菌形态球形、类球状、短杆或杆状，有些细胞有芽孢。代谢产物以乳酸为主要代谢产物，有些乳酸菌可以产生乳链菌肽（Nisin)，乳链菌肽有抑菌活性。土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏

第6页/共144页目的要求1、了解微生物分离和纯化的原理。2、掌握常用的分离纯化微生物的方法。3、掌握倒平板的方法。4、进一步熟练和掌握微生物的无菌操技术。5、掌握微生物的培养方法。

土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏

第7页/共144页实验原理（1）微生物分离与纯化

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于微生物生长的培养条件（如营养成分、酸碱度、温度和氧等,或加入某种抑制剂），在平板上培养微生物，当平板上长出单菌落后，挑取，得到纯种的微生物

土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏

第8页/共144页实验原理（2）分离产Nisin的乳酸乳球菌时，要用选择性平板能够产生Nisin的乳酸菌，自身会有对一定浓度的Nisin的抗性，而很多其它的细菌不具有这种抗性。所以，在纯化乳酸乳球菌时，要在平板中加入一定量的Nisin,使得对Nisin没有抗性的其它细菌被抑制，平板中的单菌落就有更大的可能性是我们需要的乳酸乳球菌采用在平板中加入抑制剂的方法是微生物学常用的分离纯化微生物的方法。土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏

第9页/共144页试剂与器材1、材料含大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、根霉、青霉和放线菌的土壤样品及酸奶样品，牛肉膏蛋白胨培养基（斜面、液体、半固体）、马丁氏培养基、查氏培养基等2、试剂

10%酚、4%水琼脂3、器材盛9mL无菌水的试管、盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶、涂布器、无菌吸管、接种环，酒精灯、无菌培养皿、显微镜、细胞计数板等。土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏

第10页/共144页牛肉膏蛋白胨培养基

牛肉膏3g蛋白胨10gNaCl5g琼脂15-20g用水定容至1000mlpH7.0-7.2用于分离细菌土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏

第11页/共144页查氏培养基

NaNO32gK2HPO41gKCl0.5gMgSO40.5gFeSO40.01g蔗糖30g琼脂15-20g用水定容至1000ml用于分离霉菌土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏

第12页/共144页高氏一号培养基

可溶淀粉20gKNO31gNaCl0.5gK2HPO40.5gMgSO40.5gFeSO40.01g琼脂15-20g用水定容至1000mlpH7.2-7.4用于分离放线菌土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏

第13页/共144页马丁氏培养基

葡萄糖10g

蛋白胨5gK2HPO41gMgSO40.5gFeSO40.01gpH自然用水定容至800ml

用于分离酵母菌土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏

第14页/共144页M17培养基蛋白胨10g酵母粉5g抗坏血酸0.5g牛肉膏2.5gMgSO4·7H2O0.01g磷酸氢二钠19g0.04%溴甲酚紫16ml用水定容至1000ml乳链菌肽（Nisin)250mlNisin/1000ml培养基（Nisin单独灭菌)用于分离酸奶中的乳酸乳球菌从酸奶中分离乳酸乳球菌的操作与从土壤中分离细菌操作相同

土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏

第15页/共144页实验步骤土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏

第16页/共144页

倒平板土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏

第17页/共144页菌悬液的配制

土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏

第18页/共144页菌液的稀释土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏

第19页/共144页接种土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏

第20页/共144页培养土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏

第21页/共144页微生物的纯种培养土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏

第22页/共144页注意事项1、接种环要灼烧灭菌。接触菌体前要冷却。接种后要在火焰上灼烧。2、实验在洁净工作台内进行，操作时菌体不应和火焰太过接近。3、本实验要严格地按照无菌操作进行。4、培养时要倒置培养，防止染菌。5、取单菌落时不要碰到其它的菌落。土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏

第23页/共144页细菌的形态结构观察

第24页/共144页相关理论知识细菌形态群体的形态细菌菌落大多表面光滑湿润，有光泽，一般菌落较小，质地颜色均匀，同培养基结合不紧密。菌落特征与组成菌落的细胞结构、生长状况、排列方式、好气性和运动性直接相关。个体的形态主要分为球菌、杆菌、螺旋菌三大类，近年还发现星状和四方形细菌等。细菌形态随培养时间、培养基成分、浓度、培养温度、培养时间等发生变化。细菌个体微小，较透明，必须染色方可呈现。根据细菌个体形态观察的不同要求，可将染色分为简单染色、鉴别染色、特殊染色三种类型。细菌的形态结构观察第25页/共144页目的要求1、显微镜下观察细菌个体的形态。2、学习环境中微生物的检查方法，并加深对微生物分布广泛性的认识。3、了解简单染色法的原理，并掌握其操作方法4、学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。5、巩固显微镜的油镜的使用方法。6、初步认识细菌的形态。细菌的形态结构观察第26页/共144页简单染色法原理

简单染色是利用单一染料对细菌进行染色。细菌在中性、碱性或弱酸性溶液环境中通常带负电荷，碱性染料（解离时分子的染色部分带正电荷）如美兰、结晶紫等易与细菌结合使其着色。细菌的形态结构观察第27页/共144页试剂与器材1、材料

枯草芽孢杆菌、大肠杆菌及乳酸乳球球菌2、试剂

吕氏碱性美蓝染液或草酸铵结晶紫染液3、器材

显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、双层瓶（内装香柏油及二甲苯）、擦镜纸、生理盐水等。细菌的形态结构观察第28页/共144页实验步骤涂片干燥：室温自然干燥固定：通过火焰2－3次，细胞质凝固染色：滴加染液冲洗：水洗至无色干燥：自然，吹干，吸干镜检细菌的形态结构观察第29页/共144页注意事项涂片时水滴不要太大，菌体最好涂成一个薄膜。要求涂布均匀。室温自然干燥。固定时,通过火焰2－3次，不可以加热过久。染色时,滴加染液覆盖上菌体薄膜即可。冲洗时,水洗至无色，要注意水流要有一个角度，从载片的一端自然流到另一端，但是水流要通过染色过的菌体薄膜。水流不宜过大，防止将菌体冲走。镜检时，油镜与普通的物镜要严格地按照操作规程执行。细菌的形态结构观察第30页/共144页细菌的革兰氏染色第31页/共144页相关理论知识革兰氏染色法

它是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。菌种鉴定的重要手段革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，它是细菌学上最常用的鉴别染色法。

细菌的革兰氏染色第32页/共144页目的要求1、初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色法步骤。2、学习并掌握芽孢染色法3、掌握革兰氏染色法的原理。细菌的革兰氏染色第33页/共144页革兰氏染色实验原理

革兰氏染色能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后变成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。细菌的革兰氏染色第34页/共144页试剂与器材1、材料

乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌。2、试剂

结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红等。3、器材

显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、双层瓶（内装香柏油及二甲苯）、擦镜纸、生理盐水等。细菌的革兰氏染色第35页/共144页革兰氏染色实验步骤制片：取菌种培养液常规涂片，干燥，固定。初染：滴加结晶紫，染色1－2min，水洗；媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min,

水洗；乙醇脱色：滤纸吸去残水，倾斜玻片用95％乙醇洗涤脱色至无色，立即水洗；复染：番红液复染约2min，水洗；镜检：革兰氏阳性菌（蓝紫色）；革兰氏阴性菌（红色）细菌的革兰氏染色第36页/共144页实验结果（1）革兰氏阴性菌革兰氏阳性菌细菌的革兰氏染色第37页/共144页炭疽杆菌的革兰氏染色

革兰氏染色可见大量细菌

革兰氏染色后在显微镜下观察

细菌的革兰氏染色第38页/共144页染色显示革兰氏阳性阴性细菌细菌的革兰氏染色第39页/共144页注意事项1.涂片务求均匀，切忌过厚。2．在染色过程中，不可使染液干涸。火焰固定不宜过热。3．脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌；脱色不够，则会使阴性菌被染成阳性菌。4．不能选用老龄菌。细菌的革兰氏染色第40页/共144页细菌细胞的生理生化反应第41页/共144页相关理论知识（1）

微生物分类学（microbial

taonomy）

它是一门按微生物的等级关系把它们安排成条理清楚的各种分类单元或分类群（taxon）的科学。它具体的任务是分类（classificontion）、鉴定（indentification）和命名（namendature）。细菌细胞的生理生化反应第42页/共144页微生物的七级分类单位

号（kingdom）（拉：Regnum）

门（Phylum）（拉：Phylum）或Division（拉：

Divisio）

纲（class）（拉：classis）

目（order）（拉：order）

科（Family）（拉：Family）

属（Genus）（拉：Genus）

种（Species）（拉：Species）细菌细胞的生理生化反应第43页/共144页种的概念亚种（Subspecies,

subsp.,

SSP.）变种（Variety,

Var.）型（form）类群（group）菌株（strain）细菌细胞的生理生化反应第44页/共144页相关理论知识（2）微生物的分类系统

原核生物分类系统（细菌、放线菌、蓝细菌，支原体、衣原体、立克次氏体等）

《伯杰氏细菌鉴定手册》（Bergey’s

Manual

of

Determinative

Bacteriology）（1923-1974的1-8版）

《伯杰氏系统细菌学手册》（Bergey’s

Manual

of

systematic

Bocteriology,1984）真菌的分类系统（酵母菌、霉菌、食用真菌、原生动物、藻类等）

Ainswerth(1973)的分类系统。（Ainsuorth

and

Bisby’s的《真菌学辞典》《Dictionary

of

the

Fungi,

Sixth.edition,

1971》）细菌细胞的生理生化反应第45页/共144页相关理论知识（3）微生物的鉴定获得该微生物的纯种培养物（pure

culture）；

测定一系列必要的鉴定指标；查找权威性的鉴定手册。

经典分类鉴定方法

形态；生理、生化反应；生态特性；生活史特点；血清学反应（免疫学鉴定）；噬菌体的敏感性等现代分类鉴定方法

微生物遗传型的鉴定细胞化学成分的鉴定

细菌细胞的生理生化反应第46页/共144页目的要求1、不同微生物对各种有机分子水解能力不同，说明不同微生物有不同的酶系统。2、掌握微生物大分子水解实验的原理及方法。3、了解糖发酵原理及在肠道细菌鉴定中的作用。4、测定细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力。5、了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的实验原理和方法。6、通过不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利用情况了解细菌碳、氮代谢类型的多样性。7、了解细菌在培养基中的生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。

细菌细胞的生理生化反应第47页/共144页实验原理（1）

各种细菌在代谢类型上表现了很大的差异。不同的细菌分解大分子碳水化合物、蛋白质和脂肪的能力不同，所能发酵的类型和最终产物也不一样。不同细菌对营养的要求不同也说明了它们有不同的合成能力。所有这些都反映了它们有不同的酶系统。细菌生化反应的多样性在自然界产生了两种结果：第一、使自然界所有的有机分子都可以分解；第二、使不同细菌之间有了互相作用和互相依赖的基础，例如，一种微生物能利用另一种微生物所分解的产物。细菌细胞的生理生化反应第48页/共144页实验原理（2）

微生物对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大的物质为较小的化合物，使其能被运输至细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖；脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等。代谢过程中产酸（乳酸、醋酸、丙酸）和/或产气(H2,CH4,CO2）；酸用指示剂检测；气通过倒置的德汉氏小管或直接观察。有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚。吲哚本身没有颜色，不能直接看见，但当加入对二甲基氨基苯甲醛试剂时，该试剂与吲哚作用，形成红色的玫瑰吲哚。某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。细菌细胞的生理生化反应第49页/共144页实验原理（3）

不同细菌利用柠檬酸盐能力不同，有的细菌可利用柠檬酸盐作为碳源，有的则不能。某些细菌将柠檬酸盐分解为二氧化碳，培养基中由于有游离钠离子存在而形成碳酸钠，是培养基碱性增加。根据培养基中指示剂变色来判断实验结果。指示剂可用溴麝香草酚蓝(pH﹤6呈黄色，pH6-7.6呈绿色，pH﹥7.6呈蓝色）。有些细菌能分解含硫氨基酸产生硫化氢，硫化氢遇培养基中的铅盐或铁盐，可产生黑色硫化铅或硫化铁沉淀，从而可确定硫化氢的产生。细菌细胞的生理生化反应第50页/共144页多糖的水解细菌细胞的生理生化反应第51页/共144页吲哚实验1细菌细胞的生理生化反应第52页/共144页吲哚实验2细菌细胞的生理生化反应第53页/共144页伏普实验细菌细胞的生理生化反应第54页/共144页试剂与器材1、材料

乳酸乳球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、糖发酵培养基、蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、固体淀粉培养基。2、试剂

甲基红试剂、40%氢氧化钾、5%α-萘酚、乙醚、吲哚试剂。3、器材

德汉氏小管、试管、接种环、恒温培养箱、高压灭菌器等。细菌细胞的生理生化反应第55页/共144页淀粉固体培养基

可溶性淀粉2g牛肉膏5g蛋白胨10gNaCl5g琼脂15g水1000mlpH自然倒平板水解淀粉实验细菌细胞的生理生化反应第56页/共144页葡萄糖发酵培养基

K2PO41g葡萄糖10g蛋白胨5g琼脂5g溴甲酚紫15ml水1000mlpH7.0-7.2分装试管（4-5cm）垂直冷却3个试管糖发酵实验细菌细胞的生理生化反应第57页/共144页蛋白胨水培养基

蛋白胨5gNaCl5g水1000ml分装试管（4-5cm）3个试管吲哚实验细菌细胞的生理生化反应第58页/共144页葡萄糖蛋白胨水培养基

葡萄糖5g蛋白胨5gNaCl5g水1000mlpH7.0-7.2分装试管（4-5cm）3个试管伏普实验细菌细胞的生理生化反应第59页/共144页淀粉的水解实验1、固体淀粉培养基灭菌后冷却至50℃,倒平板；2、记号笔将平板分区，不同的区域接种不同的菌种，记录接种的菌种名；3、平板倒置在37℃培养24h;4、将平板打开，加入Lugol’s碘液，轻旋转，观察结果。细菌细胞的生理生化反应第60页/共144页糖发酵实验实验步骤

取半固体葡萄糖发酵培养基试管３支，分别用接种针穿刺接入大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和阴性对照，37℃培养24h。观察记录与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“－”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“＋”表示。培养液中有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“＋”表示；如管内没有气泡为阴性反应，记录用“－”表示。细菌细胞的生理生化反应第61页/共144页吲哚实验实验步骤

用接种环分别接种大肠杆菌、枯草芽孢杆菌到含有蛋白胨水培养基的2支试管中,将试管置37℃恒温培养箱中培养48h。向培养后的蛋白胨水培养基内加3-4滴乙醚，摇动数次，静置3min,待乙醚上升后，沿试管壁缓慢加入2滴吲哚试剂。观察记录

在乙醚与培养物之间产生红色环状物的，为阳性反应，否则为阴性。细菌细胞的生理生化反应第62页/共144页V-Ptest（乙酰甲基甲醇试验）

以无菌操作分别将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌分别接种于2支葡萄糖蛋白胨水培养基（V-Ptest），空白对照管不接菌，置37℃恒温箱中，培养。培养2d后，将培养物内加入5-10滴40%KOH,然后加入等量的5%α-奈酚溶液，用力振荡，在放入37保温15-30min,若培养物呈红色，为V-Ptest阳性。

细菌细胞的生理生化反应第63页/共144页柠檬酸盐利用实验将大肠杆菌和枯草芽孢杆菌分别接种于2支柠檬酸盐斜面上，置于37℃培养24-48小时。观察柠檬酸盐培养基上有无细菌生长和是否变色，斜面呈蓝色的是阳性反应，呈绿色的为阴性反应。细菌细胞的生理生化反应第64页/共144页硫化氢产生实验将大肠杆菌和枯草芽孢杆菌分别穿刺接种于2支半固体培养基中，置于37℃培养24-48小时。观察结果，如培养基中出现黑色沉淀线者，为阳性反应。细菌细胞的生理生化反应第65页/共144页注意事项1、实验中无菌操作。2、吲哚实验中加入乙醚时要缓慢的加入。3、培养时间达到要求时间，现象明显。4、配制氢氧化钾时，要注意不要腐蚀皮肤和实验台。细菌细胞的生理生化反应第66页/共144页酵母菌的培养、形态观察、直接计数及死活细胞的鉴定第67页/共144页相关理论知识酵母菌形态酵母菌是单细胞真核微生物。酵母菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。比细菌的单细胞个体要大得多。酵母菌无鞭毛，不能游动。酵母菌具有典型的真核细胞结构,有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、液泡、线粒体等，有的还具有微体。

酵母菌的培养、形态观察、直接计数及死活细胞的鉴定第68页/共144页单细胞的酵母菌

面包酵母（长有芽孢）酵母菌的出芽生殖

含有细菌真菌菌丝和酵母菌

酵母菌的培养、形态观察、直接计数及死活细胞的鉴定第69页/共144页相关理论知识酵母菌菌落特征

大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色，少数为红色，个别为黑色。

啤酒酵母的菌落红酵母的菌落各种酵母菌的菌落

酵母菌的培养、形态观察、直接计数及死活细胞的鉴定第70页/共144页相关理论知识酵母菌的无性繁殖

芽殖

酵母菌最常见的无性繁殖方式是芽殖。芽殖发生在细胞壁的预定点上，此点被称为芽痕，每个酵母细胞有一至多个芽痕。成熟的酵母细胞长出芽体，母细胞的细胞核分裂成两个子核，一个随母细胞的细胞质进入芽体内，当芽体接近母细胞大小时，自母细胞脱落成为新个体，如此继续出芽。如果酵母菌生长旺盛，在芽体尚未自母细胞脱落前，即可在芽体上又长出新的芽体，最后形成假菌丝状。

裂殖

裂殖是少数酵母菌进行的无性繁殖方式，类似于细菌的裂殖。其过程是细胞延长，核分裂为二，细胞中央出现隔膜，将细胞横分为两个具有单核的子细胞。

酵母菌的培养、形态观察、直接计数及死活细胞的鉴定第71页/共144页酵母菌的芽殖过程1．泡；2．小管；3．核；4．液泡

酵母菌假菌丝的形成图中1、2、3、4·······

是出芽的顺序

酵母菌的培养、形态观察、直接计数及死活细胞的鉴定第72页/共144页相关理论知识酵母菌的有性繁殖

酵母菌是以形成子囊和子囊孢子的方式进行无性繁殖的。两个临近的酵母细胞各自伸出一根管状的原生质突起，随即相互接触、融合，并形成一个通道，两个细胞核在此通道内结合，形成双倍体细胞核，然后进行减数分裂，形成4个或8个细胞核。每一子核与其周围的原生质形成孢子，即为子囊孢子，形成子囊孢子的细胞称为子囊。

酵母菌的培养、形态观察、直接计数及死活细胞的鉴定第73页/共144页相关理论知识酵母菌子囊孢子的形成过程1、2、3、4：两个细胞结合；5：接合子；6、7、8、9：核分裂；10、11：核形成孢子

酵母菌的培养、形态观察、直接计数及死活细胞的鉴定第74页/共144页显微计数法

显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（PetrofHausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜。

酵母菌的培养、形态观察、直接计数及死活细胞的鉴定第75页/共144页血球计数板

血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区，计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。

酵母菌的培养、形态观察、直接计数及死活细胞的鉴定第76页/共144页血球计数板特征

酵母菌的培养、形态观察、直接计数及死活细胞的鉴定第77页/共144页目的要求1、观察酵母菌的形态特征及出芽方式。2、了解血球计数板构造及计数原理，掌握显微计数的原理及方法。3、学习鉴别死活细胞的方法。

酵母菌的培养、形态观察、直接计数及死活细胞的鉴定第78页/共144页实验原理酵母菌观察

酵母菌是单细胞真核生物，菌体比细菌大且不运动。繁殖方式以无性为主（芽殖或裂殖），有性繁殖产生子囊和子囊孢子。直接计数法

直接计数法是利用血球计数板在显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。死活细胞鉴定

美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型为无色。用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此不仅用此法可以观察酵母细胞的形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。

酵母菌的培养、形态观察、直接计数及死活细胞的鉴定第79页/共144页试剂与器材1、材料酿酒酵母2、试剂

0.05%和0.1%的吕氏碱性美蓝液、革兰氏染色用的碘液。3、器材

显微镜、载玻片、盖玻片、接种环、酒精灯等。

酵母菌的培养、形态观察、直接计数及死活细胞的鉴定第80页/共144页实验步骤（1）死活细胞鉴定（美蓝浸片观察）在载玻片中央加一滴0.1％美蓝染色液，挑菌混匀；倾斜缓慢放置盖玻片；放置3min后镜检；染色半小时后再次进行观察，注意死活细胞数量是否增加；

酵母菌的培养、形态观察、直接计数及死活细胞的鉴定第81页/共144页实验步骤（2）计数实验镜检计数室，去污，清洗，吹干；装目镜测微尺，刻度朝下；校正目镜测微尺（高倍镜下两重合线之间两尺分别所占的格数）校正后取下镜台测微尺，换上细菌染色制片。盖上盖玻片，菌悬液于边缘滴一小滴，渗入，使充满菌液；

酵母菌的培养、形态观察、直接计数及死活细胞的鉴定第82页/共144页显微镜计数加样后静止5min，每个小格内5－10个菌体，取5个中格（可选4个角和中央的一个中格）计数；代入公式计算结果。1ml菌液中的总菌数＝N/5x25x10xM(N为5个中方格中总菌数，M为菌液稀释倍数）清洗。

酵母菌的培养、形态观察、直接计数及死活细胞的鉴定第83页/共144页实验结果酵母菌的显微镜下的形态结构

酵母菌的培养、形态观察、直接计数及死活细胞的鉴定第84页/共144页注意事项1、酵母菌制片时，菌体不能过多。2、染色时间要掌握好。3、血球计数板清洗是不能用手或者别的硬物擦拭。4、显微测量时要校对目镜测微尺。

酵母菌的培养、形态观察、直接计数及死活细胞的鉴定第85页/共144页放线菌与霉菌的形态观察第86页/共144页相关理论知识（1）

放线菌(Actinomycetes)是一群丝状，G+的细菌，在气生菌丝末端形成孢子。细胞壁主要成分是肽聚糖，最适pH与细菌相似。主要以孢子方式进行无性繁殖。其DNA碱基组成中GC含量特别高，超过任何已知的细菌。许多临床应用的抗生素都由链霉菌种产生。已知放线菌能够产生500多种抗生素。大多数抗生素对不同的细菌有独特的疗效，有50多种被实际应用放线菌与霉菌的形态观察第87页/共144页相关理论知识（2）

放线菌是单细胞的原核生物。与其它的原核生物不同的是，放线菌的菌体一般由分枝状的菌丝构成，菌丝的宽度在1um左右。放线菌的菌丝可以分为两类：伸入到培养基内部的菌丝称为基内菌丝，主要功能是吸收营养物质；伸展在空气中的菌丝称为气生菌丝，这类菌丝较粗，呈直线形或弯曲分枝形。大多数放线菌都是靠基内菌丝吸收现成的营养物质，进行腐生生活的。链霉菌属是放线菌中种类最多、分布最广、形态特征最典型的类群。放线菌与霉菌的形态观察第88页/共144页相关理论知识（3）

放线菌生长到一定阶段，大部分气生菌丝分化成孢子丝，通过横割分列的方式产生成串的分生孢子。孢子丝形态多样，有直、弯曲、钩状、螺旋状、轮生等多种形态。孢子也有球形、椭圆形、杆状和瓜子状等等。它们的形态构造都是放线菌分类鉴定的重要依据。放线菌的菌落早期同细菌菌落月牙状相似，后期形成孢子菌落呈粉状、干燥，有各种颜色呈同心圆放射状。放线菌与霉菌的形态观察第89页/共144页相关理论知识（4）

放线菌没有有性繁殖，主要通过形成无性孢子方式进无性繁殖，成熟的分生孢子或孢囊孢子散落在适宜环境里发芽形成新的菌丝体；另一种方式是菌丝体的无限伸长和分枝，在液体振荡培养（或工业发酵）中，放线菌每一个脱落的菌丝片段，在适宜条件下都能长成新的菌丝体。放线菌在固体培养基上形成与细菌不同的菌落特征，放线菌菌丝相互交错缠绕形成质地致密的小菌落，干燥、不透明、难以挑取，当大量孢子覆盖于菌落表面时，就形成表面为粉末状或颗粒状的典型放线菌菌落，由于基内菌丝和孢子常有颜色，使得菌落的正反面呈现出不同的色泽。放线菌与霉菌的形态观察第90页/共144页相关理论知识（5）链霉菌的各种孢子丝结构放线菌与霉菌的形态观察第91页/共144页相关理论知识（6）Thecrosssectionofanactinomycetecolonyshowingthesubstratemycelium（基内菌丝）andaerialmycelium（气生菌丝）withchainsofconidiospores（分生孢子）放线菌与霉菌的形态观察第92页/共144页相关理论知识（7）放线菌与霉菌的形态观察第93页/共144页相关理论知识（8）放线菌与霉菌的形态观察第94页/共144页相关理论知识（9）

真菌是微生物中的一大类群，属于真核微生物，与人类关系非常密切。真菌是抗生素（如青霉素、头孢霉素）、有机酸等多种发酵工业的基础，在自然界中则扮演着各种复杂有机物分解者的角色。然而有些真菌是病原菌，引起人类和动植物病害，有些真菌产生毒素，使人、畜中毒，严重者引起癌症。霉菌是丝状真菌的俗称，意即“发霉的真菌”，它们往往能形成分枝繁茂的菌丝体，但又不象蘑菇那样产生大型的子实体。在潮湿温暖的地方，很多物品上长出一些肉眼可见的绒毛状、絮状或蛛网状的菌落。

放线菌与霉菌的形态观察第95页/共144页相关理论知识（10）

菌丝体霉菌的菌丝构成霉菌营养体的基本单位是菌丝。菌丝是一种管状的细丝，把它放在显微镜下观察，很像一根透明胶管，直径一般为3-10微米，比细菌和放线菌的细胞约粗几倍到几十倍。菌丝可伸长并产生分枝，许多分枝的菌丝相互交织在一起，就叫菌丝体。霉菌菌丝类型无隔膜菌丝菌丝中无隔膜，整团菌丝体就是一个单细胞，其中含有多个细胞核。这是低等真菌（即鞭毛菌亚门和接合菌亚门中的霉菌）所具有的菌丝类型。有隔膜菌丝菌丝中有隔膜，被隔膜隔开的一段菌丝就是一个细胞，菌丝体由很多个细胞组成，每个细胞内有1个或多个细胞核。在隔膜上有1至多个小孔，使细胞之间的细胞质和营养物质可以相互沟通。这是高等真菌（即子囊菌亚门和半知菌亚门中的霉菌）所具有的菌丝类型。放线菌与霉菌的形态观察第96页/共144页相关理论知识（11）

霉菌有着极强的繁殖能力，而且繁殖方式也是多种多样的。霉菌菌丝体上任一片段在适宜条件下都能发展成新个体，在自然界中，霉菌主要依靠产生形形色色的无性或有性孢子进行繁殖。孢子有点像植物的种子，不过数量特别多，特别小。霉菌的无性孢子直接由生殖菌丝的分化而形成，常见的有节孢子、厚垣孢子、孢囊孢子和分生孢子。由于霉菌的菌丝较粗而长，因而霉菌的菌落较大，有的霉菌的菌丝蔓延，没有局限性，其菌落可扩展到整个培养皿，有的种则有一定的局限性，直径1-2厘米或更小。菌落质地一般比放线菌疏松，外观干燥，不透明，呈现或紧或松的蛛网状、绒毛状或棉絮状；菌落与培养基的连接紧密，不易挑取；菌落正反面的颜色和边缘与中心的颜色常不一致。放线菌与霉菌的形态观察第97页/共144页目的要求1.了解放线菌、霉菌的形态观察的原理。2.学习并掌握观察放线菌、霉菌形态的操作方法。3.初步了解放线菌、霉菌的形态特征放线菌与霉菌的形态观察第98页/共144页实验原理

本实验采用的是插片法观察放线菌和霉菌。将放线菌或霉菌接种在琼脂平板上，插上灭菌的盖玻片后培养，使放线菌或霉菌的菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上。观察时，轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检。这种方法可观察到放线菌或霉菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长期的形态。放线菌与霉菌的形态观察第99页/共144页试剂与器材1、材料各种霉菌及放线菌菌种2、试剂查氏培养基、高氏培养基、９５％乙醇3、器材接种环、酒精灯、脱脂棉、镊子、载玻片、盖玻片、经灭菌的培养皿、试管、超净工作台、培养箱、显微镜放线菌与霉菌的形态观察第100页/共144页实验步骤倒平板将培养基熔化后，倒10-12毫升左右于灭菌培养皿内，凝固后使用。接种无菌操作将霉菌和放线菌分别划线接种到培养基上插片将灭菌的盖玻片以45度角插入培养皿内的培养基中，插入深约为1/2或1/3。培养将接菌及插片结束后的培养皿放入28℃的培养箱倒置培养镜检培养后菌丝体生长在培养基上，小心用镊子将盖玻片抽出，轻轻擦去生长较差的一面的菌丝体，将生长良好的菌丝体面向的载玻片，压放于载玻片上。直接在显微镜下观察。记录绘图放线菌与霉菌的形态观察第101页/共144页

放线菌与霉菌的形态观察第102页/共144页倒平板放线菌与霉菌的形态观察第103页/共144页接种放线菌与霉菌的形态观察第104页/共144页插片放线菌与霉菌的形态观察第105页/共144页培养放线菌与霉菌的形态观察第106页/共144页观察放线菌与霉菌的形态观察第107页/共144页放线菌与霉菌的形态观察第108页/共144页实验结果示意图放线菌与霉菌的形态观察第109页/共144页关键步骤及注意事项

1、倒平板要厚一些，接种时划线要密。2、插片时要有一定角度并与划线垂直。3、观察时，宜用略暗光线，先用低倍镜找到适当视野，更换高倍镜观察。4、如果用0.1%美蓝对培养后的盖玻片进行染色后观察，效果会更好。

放线菌与霉菌的形态观察第110页/共144页乳链菌肽效价的生物测定第111页/共144页相关理论知识

乳酸链球菌素(Nisin)是世界上公认安全的防腐剂，是一种由微生物代谢所产生的具有很强杀菌作用的天然代谢产物。

Nisin本身具有热稳定性，并耐酸、耐低温贮藏，Nisin的溶解性、稳定性都与溶液的pH值密切相关，溶解度随pH值的下降而提高，pH值2.5时溶解度为12%,pH值为5.0时下降到4%，在中性及碱性条件下几乎不溶解。Nisin能抑制大部分革兰阳性菌及其芽抱的生长和繁殖，如葡萄球菌属、链球菌属以及梭状芽抱杆菌属和芽抱杆菌属的细菌，特别是对金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、肉毒杆菌作用明显。乳链菌肽效价的生物测定第112页/共144页目的要求掌握乳链菌肽效价的生物测定方法熟悉琼脂扩散法的操作了解乳链菌肽的抑菌作用乳链菌肽效价的生物测定第113页/共144页实验原理

乳链菌肽的微生物测定方法有稀释法、比浊法以及琼脂扩散法等。本实验采用国际上最普遍应用的琼脂平板扩散法来测定抗菌肽效价。它是将规格一定的不锈钢小管置于带菌琼脂平板上或者在琼脂平板上打孔，管中加入被测液，在室温中扩散一定时间后放入温箱培养。在菌体生长的同时，被测液扩散到琼脂平板内，抑制或杀死周围细菌的生长，从而产生不长菌的透明的抑菌圈。在一定的范围内，抗菌物质的浓度（对数值）与抑菌圈直径（数学值）呈直线关系。因此，根据抑菌圈的大小，可以求出相应的抗菌物质的效价。乳链菌肽效价的生物测定第114页/共144页试剂与器材1、材料乳酸乳球菌（中国菌种保藏中心1.2030）、从酸奶中分离出来的乳酸乳球菌、枯草杆菌2、试剂乳酸乳球菌培养基，LB液体培养基，底层琼脂、顶层琼脂培养基注：把镊子、打孔器、枪头（1ml、100ul）、5ml的EP管等灭菌。3、器材牛津小杯、培养皿、离心机等乳链菌肽效价的生物测定第115页/共144页培养基乳酸乳球菌培养基蔗糖1%、蛋白胨0.45%、酵母膏1%、K2HPO42.84%、NaCl0.2%、MgSO4·7H200.02%100ml配制100mlLB液体培养基蛋白胨1g、酵母粉0.5g、NaCl1g底层琼脂培养基胰蛋白胨0.8g、酵母粉0.5g、葡萄糖0.5g、NaCl0.5g、Na2HPO4·12H200.2g、琼脂1g100ml顶层琼脂培养基胰蛋白胨0.8g、酵母粉0.5g、葡萄糖0.5g、NaCl0.5g、Na2HPO4·12H200.2g、琼脂0.5g配制100ml乳链菌肽效价的生物测定第116页/共144页实验步骤将乳酸乳球菌发酵液取出20ml于50ml离心管中，放置于4℃进行低温沉降1小时。将配好的顶层琼脂加热熔化。把枯草杆菌的浓度调成OD600

值为0.16。在平板中先铺一层琼脂培养基待加热熔化的顶层琼脂降温至50℃左右，加入确定量的枯草杆菌，混合均匀，加入已经铺好底层琼脂的平板中，每个平板加5ml。待凝固后打孔挑出孔内琼脂，往里面加入步骤1中低温沉降的乳酸乳球菌的上清，加平即可。乳链菌肽效价的生物测定第117页/共144页注意事项指示菌要调菌液浓度加指示菌的琼脂培养基要冷却到50℃左右后，再加指示菌打孔时要注意不要打裂乳链菌肽发酵液要先沉降乳链菌肽上清液要加满平板上的孔乳链菌肽效价的生物测定第118页/共144页微生物菌种的保藏第119页/共144页相关理论知识

菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是重要的微生物基础工作。菌种保藏就是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于研究与应用。微生物菌种的保藏方法有斜面冰箱保存法、石蜡油封藏法、沙土保藏法和冷冻干燥保存法等。其中以斜面冰箱保存法最为简便。微生物菌种的保藏第120页/共144页斜面冰箱保存法

在平板上选择分离良好的细菌、放线菌和霉菌的纯种，分别接种于营养琼脂培养基、高氏一号培养基和豆芽汁葡萄糖琼脂培养基的斜面上，使其充分生长后，放在冰箱内4℃温度下保存。定期移种。这种方法虽然简便，但保存时间不能太长。一般霉菌、放线菌和有芽孢的细菌可保存半年左右，酵母菌可保存4个月左右，无芽孢的细菌可保存1个月左右。超过上述时间，就需要进行移种。微生物菌种的保藏第121页/共144页目的要求1、了解菌种保藏的基本原理

2、掌握几种常用的菌种保藏方法。微生物菌种的保藏第122页/共144页实验原理

菌种保藏的方法很多。其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境,即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。一般情况下，斜面保藏、半固体穿刺、石蜡油封存和砂土管保藏法较为常用，也比较容易制作。

微生物菌种的保藏第123页/共144页试剂与器材1、材料各种需要保藏的菌种及相应的培养基、河砂、瘦黄土或红土。2、试剂

EDTA、NaAc、10mmol/LTris、液体石蜡、甘油、五氧化二磷、95%乙醇、10%盐酸、无水氯化钙、食盐、干冰。3、器材无菌吸管、无菌滴管、无菌培养皿、安瓿瓶、冻干管、40目与100目筛子、油纸、滤纸条、干燥器、真空泵、真空压力表、喷灯、L形五通管、冰箱、微生物菌种的保藏第124页/共144页斜面低温保藏

这是一种常用的而且是最简便的保藏方法。首先将要保藏的菌种移接到适宜的斜面培养基上。一般采用营养丰富的半合成培养基，如PDA培养基，麦芽汁琼脂培养基等。为了减少培养基水分蒸发，延长保藏时间，可将琼脂用量加到20%。在这些培养基中，最好再加入少许0.2%的K2HP04、KH2PO4、CaCO3等缓冲剂，以中和菌种在保藏过程中产生积累的有机酸。用适宜温度培养至菌丝长满斜面，选择菌丝生长健壮的试管，先用硫酸纸包扎好管口棉塞，再将若干支试管用牛皮纸包好。微生物菌种的保藏第125页/共144页

液体石蜡保藏

将要保藏的菌种接入前面介绍的马铃薯半合成培养基上，培养至菌丝长满斜面，选择生长健壮的备用。然后选用化学纯的液体石蜡装入三角瓶内，装至瓶体的１/3处，塞上棉塞后包扎，１kg/cm2灭菌１小时。灭菌后，放在40℃恒温箱中，使水分蒸发至石蜡液透明为止。冷却后在无菌箱(室)内，以无菌操作方法，用无菌吸管分别注入待保存的各个试管菌种内，注入量以淹过斜面1cm为宜。然后塞以橡皮胶塞，用蜡封口，直立于试管架上，放入4℃冰箱中或常温下保藏。此法可保藏5～7年，但最好1～2年移植一次。使用时，不必倒去石蜡油，只要用接种针从斜面上挑取小块菌丝即可(但要尽量少带石蜡油)。余下的母种可继续保藏。由于挑出移接的菌丝块沾有石蜡，故生长微弱，必须转接几次才能恢复正常。微生物菌种的保藏第126页/共144页砂土管保藏法河砂处理取河砂若干加入盐酸10%，加热煮沸30min除去有机机质。倒去盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，最后一次用蒸镏水冲洗，烘干后用40目筛子过筛，弃去粗颗粒，备用。土壤处理取非耕作层不含腐殖质的痩黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。烘干后碾碎，用100目筛子过筛，粗颗粒部分丢掉。砂土混合处理妥当的河砂与土壤按3：1的比例掺合(或根据需要而用其他比例，甚至可全部作砂或土)均匀后，装入10x100mm的小试管或安瓿管中，每管分装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌(通常采用间歇灭菌2--3次)，烘干。微生物菌种的保藏第127页/共144页

无菌检查 每10支砂土管随机抽1支，将砂土倒入肉汤培养基中，30℃培养40h，若发现有微生物生长，所有砂土管则需重新灭菌，再作无菌试验，直至证明无菌后方可使用。菌悬液的制备 取生长健壮的新鲜斜面菌种，加入2-3ml无菌水(每18x180mm的试管斜面菌种)，用接种环轻轻将菌苔洗下，制成菌悬液。分装样品 每支砂土管(注明标记后)加入0．5ml菌悬液(刚刚使砂土润湿为宜)，用接种针拌匀。

微生物菌种的保藏第128页/共144页

干燥将装有菌悬液的砂土管放入干燥器内，干燥器底部盛有干燥剂。用真空泵抽干水分后火焰封口(也可用橡皮塞或棉塞塞住试管口)。保存置4℃冰箱或室温干燥处，每隔一定的时间进行检测。此法多用于产芽孢的细菌、产生孢子的霉菌和放线菌。在抗生素工业生产中应用广泛、效果较好，可保存几年时间，但对营养细胞效果不佳。微生物菌种的保藏第129页/共144页注意事项1、实验操作要严格无菌。2、需保藏的菌种需是生长健壮的菌种。3、各种保藏方法的有效时间不同，时间到了以后要及时的进行菌种活化后再进行菌种保藏。微生物菌种的保藏第130页/共144页细菌生长曲线的测定第131页/共144页实验目的1、了解细菌生长的特点及测定原理，掌握其生长规律，绘制生长曲线。

2、掌握光电比浊法测量细菌数量的方法。

细菌生长曲线的测定第132页/共144页实验原理

将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，定时测定培养液中的菌量，以菌量作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。依