微生物的培养与应用课件

微生物的培养与应用课件第1页/共43页考点40微生物的培养、分离及计数考点41传统发酵技术的应用第十五章

微生物的培养与应用第2页/共43页高考考法突破考法1微生物的培养与纯化应试基础必备考点40微生物的培养、分离及计数考法2微生物的分离、筛选与计数第3页/共43页应试基础必备(1)培养基①概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养物质。②成分：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，还需满足不同微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的需求。③培养基的制备：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。(2)无菌技术①关键：防止外来杂菌的入侵。②方法：实验室中常用紫外线或化学药物消毒，如用酒精擦拭双手；灭菌的方法主要有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌。1．微生物的培养第4页/共43页(3)实验操作①制备固体培养基a．步骤：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。b．倒平板操作时待培养基冷却至50

℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。②纯化菌种a．原理：在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个菌落，这个菌落就是一个纯化的细菌菌落。b．方法：平板划线法、稀释涂布平板法。③菌种的保藏a．临时保存：固体斜面培养基上4℃保存，菌种易被污染或产生变异。b．甘油保存：甘油瓶中－20℃冷冻箱中保藏。第5页/共43页2．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(1)筛选菌株原理：人为提供有利目的菌生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长。(2)统计菌落数目的方法①显微镜直接计数法a．原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。b．方法：用计数板计数。c．缺点：不能区分死菌与活菌。第6页/共43页②间接计数法(活菌计数法)A．原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中大约含有多少活菌。B．计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。C．操作a．设置重复组，增强实验的说服力与准确性。b．为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。(3)实验流程：土壤取样→制备培养基→微生物的培养与观察→细菌的计数。第7页/共43页3．培养基对微生物的选择作用(1)纤维素酶纤维素酶是一种复合酶，它包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，具有催化分解纤维素的作用，其作用过程如下：(2)纤维素分解菌的筛选原理以纤维素作为唯一碳源的选择培养基上，刚果红＋纤维素→红色复合物，纤维素分解菌可分泌纤维素酶，分解纤维素使红色消失，出现透明圈。即：可根据透明圈来筛选纤维素分解菌。(3)土壤中纤维素分解菌的筛选流程土壤取样(要在富含纤维素的环境中取样)→选择培养→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落。第8页/共43页高考考法突破1.对培养基的认识考法1微生物的培养与纯化营养物质含义作用主要来源碳源能提供碳元素的物质构成生物体的物质，异养生物的能源物质无机物：CO2、NaHCO3；有机物：糖类、脂肪酸、石油、花生粉饼等氮源能提供氮元素的物质合成蛋白质、核酸以及含氮代谢产物无机物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐；有机物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等生长因子生长必不可少的微量有机物酶和核酸的成分维生素、氨基酸、碱基等水细胞生命活动必不可少的物质不仅是良好的溶剂，还是结构物质培养基、大气、代谢产物无机盐提供除碳、氮元素以外的各种重要元素，包括某些大量元素细胞内的组成成分；生理调节物质；某些化能自养型细菌的能源；酶的激活剂等培养基（）(1)培养基的成分第9页/共43页(2)培养基的分类划分标准培养基种类特点用途物理性质液体培养基不加凝固剂工业生产固体培养基加凝固剂，如琼脂对微生物分离、鉴定等用途选择培养基培养基中加入某种化学物质，用来抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长培养和分离出特定微生物(如分离细菌和真菌，可以在培养基中加入青霉素)鉴别培养基根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物，如用伊红美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落呈黑色并带有金属光泽)第10页/共43页(3)培养基的配制原则①目的要明确：根据微生物的种类、培养目的等选择原料配制培养基，如培养自养型的微生物就不用加入有机营养物质。②营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。③pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同。第11页/共43页2.无菌技术操作的方法概念常用方法应用的范围消毒使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）煮沸消毒法：在100℃下煮沸5～6min一般物品巴氏消毒法：70～75℃煮30min或在80℃煮15min一些不耐高温的液体，如牛奶化学药剂消毒法如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等紫外线消毒法：30W紫外灯照射30min接种室灭菌使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物（包括芽孢和孢子）灼烧灭菌：酒精灯火焰接种工具的灭菌干热灭菌：160～170℃下灭菌1～2h玻璃器皿、金属器具的灭菌高压蒸汽灭菌：121℃下灭菌15～30min培养基及容器的灭菌第12页/共43页3.平板划线法和稀释涂布平板法对大肠杆菌的纯化的比较平板划线法稀释涂布平板法示意图第13页/共43页平板划线法稀释涂布平板法注意事项①第一次划线及每次划线之前都需要灼烧接种环进行灭菌，划线操作结束仍需灼烧接种环(灭菌的目的各不相同：第一次操作是为了杀死接种环上原有的微生物；每次划线之前灭菌是为了杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端；划线结束后灭菌是为了杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者)。②灼烧接种环之后，要冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。③划线时最后一区域不要与第一区域相连。④划线用力要适当，防止用力过大将培养基划破①稀释操作时：每支试管及其中的9mL水、移液管均需灭菌；操作试管口和移液管应在离火焰1～处②涂布平板时：a.涂布器用70%的酒精消毒，取出时，多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃；b.不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精；c.酒精灯与培养皿距离要适合，移液管头不要接触任何物体缺点不易分离出单个菌落，不能计数能使单菌落分离，便于计数，但统计样品中菌落的数目往往比实际数目低(因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落)第14页/共43页［课标全国Ⅲ理综2016·39，15分］某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料分离纯化乳酸菌。分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。回答下列问题：（1）分离纯化乳酸菌时，首先需要用

对泡菜滤液进行梯度稀释，进行梯度稀释的理由是

。（2）推测在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有

和

。分离纯化时应挑选出

的菌落作为候选菌。（3）乳酸菌在-20℃长期保存时，菌液中常需要加入一定量的

（填“蒸馏水”“甘油”或“碳酸钙”）。例第15页/共43页【解析】（1）分离纯化乳酸菌需采用稀释涂布平板法，在稀释度足够高的菌液中，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而在培养基上形成单菌落。为避免引入杂菌，必须用无菌水进行稀释。（2）据题意可知，只有乳酸菌能产生乳酸溶解碳酸钙，加入碳酸钙的培养基可作为鉴别培养基，便于对乳酸菌进行筛选鉴定；此外，加入碳酸钙也可中和产生的酸，有利于乳酸菌的生存。（3）细胞冷冻保存时，加入保护剂甘油可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，可避免因细胞的机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白质变性等因素导致细胞死亡。【答案】

（1）无菌水泡菜滤液中菌的浓度高，直接培养很难分离得到单菌落（2）鉴别乳酸菌中和产生的乳酸（或酸）具有透明圈（3）甘油第16页/共43页考法2微生物的分离、筛选与计数高考考法突破1．微生物的分离（1）分离原理①利用分离对象对某一营养物质的“嗜好”，专门在培养基中加入该营养物质，使其成为一种加富（或营养）培养基。②利用分离对象对某种物质的抗性，在培养基中加入抑制物，原来占生长优势的微生物受抑制，而分离对象则占生长优势，从而使其得到分离。（2）常见的分离微生物的方法①改变培养基中的营养成分，如培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物，利用富含纤维素的培养基分离纤维素分解菌；在尿素为唯一氮源的培养基中，分离尿素分解菌等。②当培养基中加入抗生素时，如加入青霉素、链霉素，可以抑制细菌的生存，从而分离出真菌等真核微生物。第17页/共43页

2.微生物的筛选（1）利用透明圈筛选微生物①抗生素与透明圈的关系：用含抗生素的滤纸片均匀置于平板培养基上的不同位置，某种细菌形成的透明圈越大，说明该细菌对该抗生素越敏感，抗生素抑菌能力越强。若不出现透明圈，说明该细菌对该抗生素不敏感。②分解圈（或透明圈）的大小与降解能力的关系：在固体培养基中加入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。接种培养后待筛选的菌落周围就会形成分解圈（或透明圈），分解圈（或透明圈）的大小反映了菌落利用此物质的能力。常作为初步筛选菌落的快速方法。如在培养基中加入可溶性淀粉、酪素或原油可以分别用于检测菌株产淀粉酶、产蛋白酶或降解原油能力的大小。第18页/共43页（2）菌株筛选原理的比较土壤中分解尿素的细菌分解纤维素的微生物示意图常用选择培养基进行筛选，即提供有利于目的菌株生长的条件，如营养、温度、pH等，同时抑制其他微生物的生长刚果红染色法，即在含有纤维素的培养基中，加入刚果红时，刚果红与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被分解后，该复合物不能形成，培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈第19页/共43页（1）直接计数法——常用的是显微镜直接计数法。但不能区分死细胞与活细胞，应用范围狭窄，难以计数微小的细菌。（2）间接计数法①原理：常用稀释涂布平板计数法，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。②操作：实验时，每一浓度至少涂布3个平板，以增强实验的说服力和准确性。③计数规则：选择菌落数在30～300间的平板进行计数。④计算方法：每克样品中的菌株数=(C÷V)×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。3．微生物数目的统计方法第20页/共43页例［四川理综2016·10题节选］如图是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，请回答下列问题：（1）图中选择培养基应以

为唯一氮源；鉴别培养基还需添加

作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成

色。（2）在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。该过程采取的接种方法是

，每克土壤样品中的细菌数量为

×108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较

。第21页/共43页【解析】

（1）题中要从土壤中分离出产脲酶细菌，所用的选择培养基应以尿素为唯一氮源，要鉴别尿素分解菌，可在培养基中加入酚红指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间，由于产生的脲酶分解了尿素，产生氨，使培养基pH升高，所以菌落周围的指示剂变成红色。（2）依据题意“均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1mL，可知该过程采取的接种方法是稀释涂布平板法；根据计算公式：每克样品中菌株数=（C÷V）×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数，为使结果接近真实值，一般选择菌落数在30~300的平板进行计数，菌落数为13和462的平板应舍弃，所以每克土壤样品中的细菌数量为［（156+178+191）÷3］÷0.1×105=1.75×108个；因为稀释涂布平板法计数过程中，可能出现两个或多个细菌连在一起只形成一个菌落的情况，所以利用稀释涂布平板法统计的菌落数要比血细胞计数板计数法得到的数值低。【答案】（1）尿素酚红红（2）稀释涂布平板法1.75少第22页/共43页高考考法突破应试基础必备考点41传统发酵技术的应用考法3 果酒和果醋的制作方法及应用考法4 腐乳的制作及条件控制考法5 泡菜制作及亚硝酸盐含量的测定第23页/共43页应试基础必备1.果酒、果醋、腐乳和泡菜的制作第24页/共43页第25页/共43页第26页/共43页2.影响腐乳品质的因素（1）盐：a.浓度过低，不足以抑制微生物生长，豆腐易腐败变质。b.浓度过高，会影响腐乳口味。（）（）（2）酒的含量：一般控制在12%左右。（3）香辛料：具调味、杀菌作用。（（1）危害：当摄入总量较多时，可引起中毒或死亡。在特定条件下，亚硝酸盐可以转变成致癌物——亚硝胺。（（2）原理：在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料。将显色反应后的样品与已知浓度的标准液进行目测比较，可以大致估算出泡菜中亚硝酸盐的含量。（3）检测步骤：配制溶液→制备标准显色液→制备样品处理液→比色。3．亚硝酸盐含量的测定第27页/共43页高考考法突破（(1)酵母菌与果酒的关系：酵母菌有氧呼吸时，产生能量多，产物为二氧化碳和水，可大量繁殖；无氧呼吸时，产生能量少，产物为酒精和二氧化碳，仅能满足自身代谢，基本不繁殖，所以用酵母菌进行工业生产果酒时先进行通气，再密闭。(2)醋酸菌与果醋的关系：醋酸菌是一种好氧细菌，只有当氧气充足时，才能进行旺盛的生理活动。当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再进一步转变为醋酸。考法3 果酒和果醋的制作方法及应用1.微生物种类与产物的关系第28页/共43页选择新鲜的葡萄，榨汁前先将葡萄进行冲洗，再除去枝梗，以防葡萄汁流失以及污染。冲洗以洗去灰尘为目的，不要太干净，以防洗去野生酵母菌。2.制作果酒的材料的选择与处理3.防止发酵液被污染的措施(1)榨汁机要清洗干净并晾干。(2)发酵瓶要洗净并用体积分数为70%的酒精消毒。(3)装入葡萄汁后要封闭充气口。第29页/共43页(1)葡萄汁装入发酵瓶时，要留约1/3的空间，目的是先让酵母菌进行有氧呼吸快速繁殖，耗尽O2后再进行酒精发酵；防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液溢出。(2)严格控制温度：18～25℃利于酵母菌的繁殖和酒精发酵；30～35℃利于醋酸菌的繁殖和醋酸发酵。(3)充气：酒精发酵为无氧发酵，需封闭充气口；醋酸发酵为有氧发酵，需适时通过充气口充气。(4)果酒发酵要定时排气的原因：操作过程中由于产生二氧化碳使瓶内气压增大，如果不及时排气，导致发酵瓶瓶塞被冲开甚至爆炸。(5)检验酒精的常用方法：重铬酸钾在酸性条件下与酒精反应呈灰绿色。4.发酵条件的控制及酒精的检测第30页/共43页制作果酒制作果醋相同过程①选材和材料处理：选择新鲜的葡萄，先用清水冲洗葡萄1～2遍除去污物后，再去枝梗②制作发酵液，防止杂菌污染③发酵：将葡萄汁注入发酵瓶，注意液体量不要超过发酵瓶总体积的2/3

不同过程①一般将温度控制在18～25℃，时间控制在10～12d左右。发酵旺盛期的CO2产量非常大，要及时排气，防止发酵瓶爆裂②检测指标：7～10d以后，可以开始进行取样检验工作。例如，可以嗅味和品尝、用酸性重铬酸钾溶液检验酒精含量，进行酵母菌的镜检、测定pH等工作①将温度严格控制在30～35℃，并注意适时通过充气口充气②检测指标：果醋的制作是否成功可以通过观察菌膜的形成、嗅味和品尝初步鉴定，再通过检测和比较醋酸发酵前后的pH进一步鉴定。还可以在显微镜下观察发酵液中是否有醋酸菌，并统计其数量做进一步鉴定5.果酒和果醋的制作步骤的比较第31页/共43页6.制作果酒和果醋的装置图分析(1)各部位的作用①充气口：在醋酸发酵时连接充气泵进行充气。②排气口：排出酒精发酵时产生的CO2；与排气管相连的长而弯曲的胶管，可有效阻止空气中微生物的进入，避免来自空气的污染。③出料口：用来取样。(2)该装置的使用方法使用该装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应将充气口连接充气泵，输入氧气。第32页/共43页例［课标全国Ⅱ理综2016·39，15分］苹果醋是以苹果汁为原料经发酵而成的，回答下列问题：（1）酵母菌的呼吸代谢途径如图所示。图中过程①和②是苹果醋生产的第一阶段，在酵母菌细胞的

中进行，其产物乙醇与

试剂反应呈现灰绿色，这一反应可用于乙醇的检验；过程③在酵母菌细胞的中

进行，与无氧条件相比，在有氧条件下，酵母菌的增殖速度

。（2）第二阶段是在醋酸杆菌的作用下将第一阶段产生的乙醇转变为醋酸的过程，根据醋酸杆菌的呼吸作用类型，该过程需要在

条件下才能完成。（3）在生产过程中，第一阶段和第二阶段的发酵温度不同，第一阶段的温度

（填“低于”或“高于”）第二阶段的。（4）醋酸杆菌属于

核生物，其细胞结构中

（填“含有”或“不含有”）线粒体。第33页/共43页【解析】（1）酵母菌是真核生物，图中过程①和②是无氧呼吸，在酵母菌的细胞质基质中进行。在酸性条件下，重铬酸钾与乙醇反应呈灰绿色。过程③是丙酮酸的彻底氧化分解，在线粒体中进行。有氧条件下，葡萄糖氧化分解会产生更多能量，因此酵母菌增殖速度更快。（2）醋酸杆菌是好氧型细菌，要在有氧条件下将乙醇转化为醋酸。（3）制作果醋的第一阶段是酒精发酵，温度为18~25℃，第二阶段为醋酸发酵，温度为30~35℃，第一阶段的温度低于第二阶段的。（4）醋酸杆菌是原核生物，没有线粒体。【答案】（1）细胞质基质重铬酸钾线粒体快（2）有氧（3）低于（4）原不含有第34页/共43页(1)发酵过程中加盐的作用：不仅可以调制风味，而且能够抑制杂菌等其他微生物的繁殖。(2)卤汤的作用：除具有一定的防腐作用外，还能使腐乳具有独特的风味。2.防止杂菌感染的措施考法4 腐乳的制作及条件控制1.盐和卤汤的作用(1)用来腌制腐乳的玻璃瓶洗干净后要用沸水消毒灭菌。(2)装瓶时操作要迅速小心，装瓶后要用胶条密封，且最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染，进而影响腐乳风味。第35页/共43页(1)温度：温度影响菌丝的生长和代谢，如温度过低，则菌丝生长缓慢，不能进入豆腐块的深层；温度高，菌丝易老化和死亡，影响腐乳的品质。(2)发酵时间：发酵时间影响生化反应速度及生化产物的量。4.腐乳味道鲜美、易于消化吸收的原因3.影响因素毛霉产生的蛋白酶可将豆腐中的蛋白质水解为多肽和氨基酸；其产生的脂肪酶能将豆腐中的脂肪水解为甘油和脂肪酸。第36页/共43页［江苏生物2016·7，2分］下列关于中学“腐乳的制作”实验，叙述正确的是（）A.加盐主要是为了调节水分，利于毛霉生长B.加料酒主要是为了灭菌，避免腐乳变质C.发酵过程中起主要作用的是乳酸杆菌D.实验室制作的腐乳不宜直接食用【解析】加盐一方面有利于析出水分，另一方面可以抑制杂菌等其他微生物的生长，A错误；加料酒可以抑制微生物的生长，同时能使腐乳具有独特的风味，B错误；腐乳的制作过程中，多种微生物参与了豆腐的发酵，如青霉、酵母菌、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉，C错误；实验室制作的腐乳一般完成了前期发酵，此时并不适合直接食用，需要一周左右的后期发酵才能达到最佳食用效果，D正确。D例第37页/共43页(1)蔬菜应新鲜(2)清水和盐的质量比为4∶1，盐水要煮沸后冷却。煮沸有两大作用：一是除去水中的氧气，二是杀灭盐水中的其他细菌。(1)泡菜坛要选择透气性差的容器，以创造无氧环境。(2)泡菜坛坛盖边沿的水槽内注满水，以保证坛内乳酸菌发酵所