微生物的实验培养

微生物的实验培养第1页/共40页了解有关培养基的基础知识，进行无菌技术的操作，进行微生物的培养。

一、课题目标：掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌和平板划线法等基本操作技术，熟练、规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。无菌技术的操作。二、课题重点和难点：三、技能目标：第2页/共40页特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.一、微生物基础知识微生物植物界动物界原核生物界原生生物界真菌界病毒界霉菌酵母菌食用菌细菌蓝藻放线菌支原体衣原体列克次体生物1、微生物第3页/共40页2、菌落单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。第4页/共40页菌落细菌的菌落特征因种而异第5页/共40页二、培养基

培养基是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料

。不同的微生物所使用的培养基成分是不尽相同的。1.培养基含义第6页/共40页2.培养基的成分水分：无机盐：碳源：有机碳（糖等）无机碳（CO2、CO32-等）提供C元素，有机碳也能提供能量氮源：有机氮（蛋白质等）无机氮（N2、NO2-

、NO3-、NH4+等）有机氮（蛋白质等）无机氮（N2、NO2-

、NO3-、NH4+等）提供N元素，有机氮还能提供C元素、且能提供能量生长因子：微生物生长所必须的，自身又不能合成的有机小分子物质。氨基酸、核苷酸、维生素、碱基等。第7页/共40页（1）按物理状态来分：培养基可分为固体培养基和液体培养基。其中固体培养基用于菌种分离、鉴定菌落等。（2）按功能来分：可分为选择培养基和鉴别培养基。（3）按成分来分：可分为天然培养基和合成培养基。3.培养基的种类第8页/共40页液体培养基：主要用于工业生产表面生长均匀混浊生长沉淀生长第9页/共40页半固体培养基：观察微生物的运动无运动有运动(弥散)第10页/共40页固体培养基：主要用于微生物分离、鉴定、计数和保藏第11页/共40页常见的选择培养基加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基:

分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物第12页/共40页

根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。

优点：标准化生产，组分和含量相对固定;成本低缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。合成培养基:第13页/共40页天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限;成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染;天然培养基：第14页/共40页三、无菌技术1.无菌技术的概念

无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。无论是倒平板、平板划线操作，还是稀释涂布平板法，其操作中的每一步都需要做到“无菌”，即防止杂菌污染。主要包括以下几个方面：（教材P15）只有熟练、规范地进行无菌操作，才可能成功地培养微生物。第15页/共40页利用较温和的化学或物理方法，杀死物体表面或内部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）的过程。2.消毒与灭菌的概念及两者的区别

(2)灭菌的定义用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子，而达到完全无菌的过程。(1)消毒的定义灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。第16页/共40页1)煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2)巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3)化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源4)紫外线消毒……(1)消毒的方法：3.常用的消毒与灭菌的方法第17页/共40页1)灼烧灭菌2)干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。3)高压蒸气灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min.(2)灭菌的方法：第18页/共40页1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）（2）需要灭菌；（3）需要消毒。旁栏思考第19页/共40页3.微生物实验室培养的基本操作程序1、器具的灭菌2、培养基的配制3、培养基的灭菌4、倒平板5、微生物接种6、恒温箱中培养7、菌种的保存第20页/共40页1、培养基配制（1）原则1）目的明确：要根据微生物和种类、培养目的等选择原料，配制培养基。2）营养要协调：各种营养物质要保证适当的浓度和比例。3）PH值要适当：不同微生物生长所需PH值不同。四、实验操作第21页/共40页（2）制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）第22页/共40页（3）配制过程１）计算２）称量３）溶化４）灭菌５）倒平板第23页/共40页倒平板技术第24页/共40页1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？问题讨论答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。第25页/共40页3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以减少培养基表面的水分挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。第26页/共40页2、纯化大肠杆菌：微生物的接种技术接种方法有：

平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面.在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.平板划线法和稀释涂布平板法第27页/共40页第28页/共40页第29页/共40页问题讨论

1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？

答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。第30页/共40页

2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。

3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？

答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。第31页/共40页

稀释涂布平板法:将菌液进行一系列的梯度稀释,然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面,进行培养。在稀释度足够高的菌液里,聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞,从而能在培养基表面形成单个的菌落。第32页/共40页第33页/共40页第34页/共40页问题讨论

涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？

应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。第35页/共40页菌种的保存1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。2、长期保存：甘油冷冻管藏法第36页/共40页【典例解析】例1．关微生物营养物质的叙述中，正确的是A.是碳源的物质不可能同时是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐D.无机氮源也能提供能量答案：D第37页/共40页例2．下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是A.防止杂菌污染B.消灭杂菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌D.灭菌必须在接种前答案：B第38页/共40页编号成分含量①粉状硫10g②(NH4)2SO40.4g③K2