微生物遗传试验

微生物遗传试验第1页/共26页微生物遗传学实验第2页/共26页紫外线(U、V)诱变——营养缺陷型筛选实验目的掌握紫外线诱发微生物突变的基本原理学习筛选、检出、鉴定营养缺陷型的方法第3页/共26页实验原理根据突变可被诱发的原理，人工地采用物理、化学、生物等因素处理微生物，使其体内的DNA发生改变，从而提高突变频率，扩大遗传变异的幅度。又根据基因突变的规律，即微生物的基因突变与环境条件没有直接对应的关系，要想得到某一特定类型的突变株，关键不是选用某种特定的诱变剂，而是采用特定的筛选方法。第4页/共26页为了得到大肠杆菌的某一营养缺陷型，本实验以U．V作为诱变因素，用青霉素法将缺陷型进行浓缩。又根据营养缺陷型在基本(MM)培养基上不能生长，只有在完全(CM)或(MM)培养基上加上它所缺陷的那种物质才能生长的原理，我们采用逐个点种法，将营养缺陷型检出，最后用生长谱法加以鉴定。第5页/共26页

本实验要掌握的基本概念包括：

完全培养基，基本培养基，野生型菌株，

缺陷型菌株，诱变育种，诱变因素。诱变育种：根据突变可被诱发的原理，人工地采用物理、化学、生物的因素处理微生物，使其体内的DNA发生改变，从而提高突变频率，扩大遗传变异的幅度，然后从中筛选人们所需要的菌株，这一过程称诱变育种。诱变因素：凡是能引起微生物突变或是将突变频率提高到自发突变水平以上的因素称诱变因素。第6页/共26页U．V诱变的原理U．V作用机制照射剂量绝对剂量：以单位面积接受的能量进行计算(尔格／mm2或伦琴／mm2)。相对剂量：表示的方法很多——照射时间、距离、杀菌率等。一般实验中微生物受U.V照射的剂量方法是采用相对剂量，即固定紫外灯管的功率(15W-20W)，固定距离(30cm)照射不同时间，也有采用杀菌率作为相对剂量的。第7页/共26页U．V处理的条件细菌一定要成单细胞状态、均匀的悬浮液。真菌和放线菌一般处理孢子悬液。处理细菌细胞时，浓度一般为108／ml，并且以对数生长期为好，处理真菌和放线菌的孢子时，浓度为106／ml。处理的菌液都以生理盐水配制。U．V照射后的处理

避光培养要进行饥饿培养(考虑表型迟延作用)

第8页/共26页营养缺陷型筛选的步骤(按图操作)E.Coli

K128ml肉汤37℃振荡培养14～16hrs添加新鲜肉汤8ml，分装2只转入离心管，4000rpm离心5分钟1.菌体制备第9页/共26页2.杀菌曲线制作和诱变处理先打匀沉淀，各加8ml生理盐水分装到5个皿，每皿3mlUV处理（不同剂量）向其中一个60s处理添加3ml2×肉汤37℃避光培养12hrs在红灯下操作，将不同处理时间的菌液涂LB平板，避光培养12hrs计数，制备杀菌曲线4000rpm离心5min，用生理盐水洗涤3次取0.1ml洗涤干净的菌液加入到无氮5ml无氮培养基37℃，12hrs饥饿培养第10页/共26页3.青霉素淘汰野生型5ml2×氮培养基加青霉素到终浓度500U/ml12hrs、16hrs、24hrs分别取样0.1ml，涂布MM和CM培养基，培养36～48hrs每个时段涂布8~6个完全培养基平板和1个基本培养基平板8+18+16+1第11页/共26页4.缺陷型检出取青霉素法CM和MM培养基上菌落数量差异最大的那一组，从CM板上用无菌牙签点种100个菌落到MM和CM培养基上，37℃12hrs培养。MMCMMMCM复证接种5ml肉汤第12页/共26页5.生长谱鉴定5ml肉汤将可能的缺陷型菌落接入肉汤，37℃培养14～16hrs。4000rpm离心5min，洗涤3次取菌液1ml，混菌于基本培养基皿底划格，各区放入混合氨基酸等，培养24hrs，观察生长圈第13页/共26页第14页/共26页培养基完全培养基和2×肉汤每组以1500ml的量称取药品。先加750ml水溶解，调节pH＝7.5，取3ml于试管中即为2×肉汤，每组2支。余下添加744ml水，摇匀，分装6个三角瓶，每瓶200ml，并在瓶内加入2％的琼脂粉。剩余的液体培养基分装2个三角瓶，是为肉汤培养基。基本培养基10×A缓冲液100ml：K2HPO410.5g，KH2PO44.5g，(NH4)2SO41.0g，柠檬酸钠0.5g20%葡萄糖50ml0.25mol/LMgSO4:100ml素琼脂每组2瓶：进口琼脂粉3.5g＋175ml蒸馏水。临用前融化素琼脂，添加20ml10×A缓冲液、20％葡萄糖4ml，MgSO41ml混合倒皿。无氮培养基每组二支各5ml（全班抽一组统一配制）。2×氮培养基每组二支各5ml（全班抽一组统一配制）。无N培养基配方(100ml)：K2HPO40.7g，KH2PO40.3g，葡萄糖2g，柠檬酸钠0.5g，

MgSO40.1g,pH＝7.0。2×N培养基配方(100ml)：在无氮培养基基础上添加(NH4)2SO40.2g生理盐水200ml分装2瓶：0.85％NaCl，蒸馏水配制。另：每组准备6个空三角瓶灭菌备用。第15页/共26页实验结果杀菌曲线时间S02040608090菌落数处理组0(CK)20“40“60“80“稀释度10-710-610-510-610-510-410-510-410-310-410-310-210-310-210-1菌落数第16页/共26页杀菌曲线制作合并2管共16ml菌液，每个待照平皿加3ml。20”40”60”60”80”CK余液照射后在避光条件下稀释，稀释倍数如下表所示处理组0（CK）20s40s60s80s稀释倍数10-710-610-510-410-3每个处理取最后3个稀释度（如CK取10-7、10-6、10-5，以此类推）涂布平皿，37℃避光培养12hrs以上，取出进行菌落计数。照射完立即添加3ml2×加富肉汤，用黑布包好，放在铝盒中，37℃培养12hr备用。第17页/共26页红灯下的稀释操作稀释完毕后取最后3个稀释度涂平板，每个稀释度2个重复，共30套。ssss第18页/共26页实验二细菌转化第19页/共26页细菌转化目的：1.将体外的重组质粒作为转化因子引入到相应的受体细胞中，然后从中筛选出特定的转化子。2．掌握化学法转化的基本方法第20页/共26页二.原理转化因子有不同的存在形式。无论那一种转化因子都存在于细胞内，要进行转化，首先必须从细胞中将转化因子抽提出来。不同的转化因子转化不同的细菌有不同的转化效率，转化率的高低关键取决于受体的感受态，只有具备有感受态的细菌才能摄取外来的DNA分子。而且细菌的感受态是在短时间内发生的，一般出现在对数生长的后期。本实验是对大肠杆菌的质粒PRF作为转化因子，将它从大肠杆菌中抽提出来，此质粒PRF上代有氨卞青霉素的标记，以大肠杆菌DH5作为受体，大肠杆菌DH5对氨卞是敏感的，若将PRF转化到DH5中就能在选择性平板LB+AP上长出转化子来。第21页/共26页三.步骤(一)抽提质粒的原理本实验抽提质粒采用的是碱抽提法。原理是基于染色体DNA与质粒DNA在变性与复性的过程中的差异而达到分离的目的。一般情况下，染色体DNA在pH7.0-9.0之间，结构是比较稳定的。当pH高达12.6的碱性条件下，染色体的氢键断裂，双螺旋结构松开。质粒DNA在这样的pH环境下大部分氢键也断裂，但质粒仍保持超螺旋的闭合环状结构，虽氢键断裂但构型不变。用pH4.8醋酸缓冲液调pH至中性时，质粒DNA很快复性恢复原状，而悬浮在液相中。而染色体DNA不能复性变成长短不一的片段，形成缠绕的网状结构，与细胞中的大分子RNA、蛋白质、SDS等化合物形成复合物在高速离心力的作用下被沉淀下来，从而达到分开的作用，最后用无水乙醇在-20℃条件下，使质粒沉淀。第22页/共26页溶液配方碱抽提质粒需用三种溶液，分别称为溶液I、Ⅱ、III。SolutionI50mM葡萄糖，10mMEDTA(乙二胺四乙酸二钠)25mmTris-Hce(PH8．0)2mg／me溶葡酶SolutionII200mMNaOH，1％SDS(十二烷基硫酸钠)SolutionIII

3MKAE-HAE的缓冲液(PH4.8)第23页/共26页抽提质粒的步骤将菌株(含PRF质粒)挑取一环接种于10ml肉汤溶液中(含AP100微克／毫升)于37℃摇床过夜。将长好的菌取5ml倒入5ml离心管中，以4000rpm离心5分钟。弃上清，打匀沉淀，加300微升溶液I在冰上放15分钟。(反复轻轻转动)加600微升溶液Ⅱ(现配)在冰上5分钟(轻轻转动)。再加450微升溶液III，在冰上15分钟(轻轻转动)。13000rpm5min，转上清液于另一5ml离心管中用等体积的PCI(约1．3ml)抽提(即混匀、摇动后离心分离)小心用移液器将上层转入另一离心管中，加2倍体积(2．6ml)无水乙醇，混匀后放入-20℃冰箱过夜，以沉淀质粒。第二天取出沉淀的离心管，以13000rpm离心5min，倾去乙醇，略微干燥后加100微升无菌水溶解质粒。第24页/共26页大肠杆菌感受态的制备（化学法）用无菌牙签从平板挑取一个单菌落，转到含有5ml的LB培养基的试管内，37℃下振摇过夜，次日取菌液1ml到100ml的LB培养基中，37℃，培养2～3hrs，然后将菌液在200～300rpm培养。待O