6酶、细胞、原生质体固定化

第二章酶与细胞的固定化

固定化生物技术——

通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用。1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有机溶剂对其有影响）。2.不能回收，也使产物中混杂酶蛋白。3.分离纯化困难。

游离酶的缺点：一、固定化酶和固定化细胞的定义及特点1.固定化酶(immobilizedenzyme)

固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。

第一节酶与细胞的固定化什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术优点：(1)可提高稳定性。(2)能回收，易与产物分离，可反复使用。缺点：(1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。(2)酶活性下降。

2.固定化细胞（immobilizedcell）

固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。

优越性：(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作;(2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系

完成部分代谢过程。

局限性：(1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副

产物。(2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制

作用。3.固定化原生质体意义：(1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和胞内产物的分泌。(2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后，由于载体的保护作用，稳定性提高。

二、固定化方法固定化方法（一）酶的固定化方法吸附法共价偶联法交联法包埋法网格型微囊型离子交换吸附物理吸附法

依据带电的酶或细胞和载体之间的静电作用，使酶吸附于惰性固体的表面或离子交换剂上。1.吸附法（adsorption）根据吸附剂的特点分:1）物理吸附法（physicaladsortion）作用力：氢键、疏水键常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素、活性碳等。2）离子结合法（ionbinding）作用力：离子键常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素优点：条件温和，操作简便，酶活力损失少。缺点：结合力弱，易解吸附。

借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联。2.共价偶联法（covalentbindingorcovalentcoupling）

1）载体：亲水载体优于疏水载体

如:天然高分子衍生物:

纤维素葡聚糖凝胶亲和性好，机械性能差琼脂糖合成聚合物：聚丙烯酰胺 聚苯乙烯机械性能好，但有疏水结构尼龙2）偶联方法：偶联成功与否取决于： 载体：功能基团：芳香氨基，羧基，羧甲基等。酶分子:侧链非必需基团：羧基，巯基，羟基，酚基，咪唑基。

常用的偶联反应有：重氮化法、叠氮法、溴化氰法、烷基化法等。优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。

3.交联法（crosslinking）

借助双功能试剂使酶分子之间发生交联的固定化方法。双功能试剂：

常用的是戊二醛 O

O H—C—CH2—CH2—

CH2—

C—H

戊二醛有两个醛基，均可与酶或蛋白质的游离氨基反应,使酶蛋白交联。

此法与共价偶联法利用的均是共价键，不同之处：交联法不使用载体。

交联反应既能发生在分子间，也可发生在分子内。

酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保持溶解状态。

酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为不溶态。

缺点：(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。

4.包埋法（entrapment）

将酶用物理的方法包埋在各种载体（高聚物）内。分为：网格型：将酶包埋在高分子凝胶细微网格中。微囊型：将酶包埋在高分子半透膜中。1）网格型包埋法（gel(lattic)entrapment）

又称凝胶包埋法凝胶包埋条件酶活性强度天然凝胶琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶温和不变差合成凝胶聚丙烯酰胺、光交联树脂聚合反应部分失活高使用的多孔载体及其特点海藻酸钙凝胶包埋法：

滴至海藻酸钠溶液＋E(orcell)CaCl2溶液中IE(orIC)

角叉菜胶包埋法：滴至角叉菜胶＋E(orcell)KCl

溶液中IE(orIC)聚丙烯酰胺凝胶包埋法：

APAcr+Bis+E(orcell)IE(orIC)TEMED2）微囊型包埋法（microencapsulation）

又称半透膜包埋法

将一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜内。半透膜：直径几十微米到几百微米，厚约25nm。

半透膜孔径<酶分子孔径，小于半透膜孔径的小分子底物和产物可以自由进出，被称为“人工细胞”。

与网格型包埋法相比，微囊型包埋法的优点：1）固定化酶颗粒小，有利于底物和产物扩散。2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。缺点：反应条件要求高,制备成本也较高。

包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法，与其它固定化方法相比：优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高。缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。

吸附法共价偶联法交联法包埋法

酶的四种固定化方法固定化方法吸附法包埋法共价结合法交联法物理吸附法离子吸附法制备难易易易较难难较难结合程度弱中等强强强活力回收高，酶易流失高高低中等再生可能可能不能不能不能费用低低低高中等底物专一性不变不变不变可变可变各种固定化方法的优缺点比较分类方式固定化细胞分类方式固定化细胞细胞类型微生物植物动物生理状态死细胞:完整细胞,细胞碎片,细胞器活细胞:增殖细胞,静止细胞,饥饿细胞（二）细胞的固定化方法

1.固定化细胞的分类

1)直接固定法

不使用载体，借助物理（如加热、冰冻）、化学方法（如柠檬酸、各种絮凝剂）将细胞直接固定。一般只用于单酶或少数几种酶催化的反应。

2)吸附法3)包埋法

2.固定化方法

例如：葡萄糖异构酶(白色链霉菌)，是一种胞内酶。在50--80℃加热10分钟，使菌体自溶作用的酶失活，而葡萄糖异构酶仍然保持活性，长期使用酶活力不减少。

微生物细胞植物细胞动物细胞

吸附法吸附力较弱，细胞易脱落包埋法实验：

2.4%左右的卡拉胶，70℃溶解,再冷却到42℃,+10%左右的细菌菌体(预热到42℃）

迅速混合均匀4℃冰箱放置大约30min

取出后切成3×3mm的小颗粒

一般采用网格包埋法（即凝胶包埋法）。常用凝胶：琼脂凝胶，海藻酸钙凝胶，角叉菜胶和光交联树脂。注意：一般要加渗透压稳定剂，以防止原生质体破裂。（三）原生质体的固定化方法

第二节

固定化酶和固定化细胞的性质与表征一、固定化酶的性质

影响酶催化活性的因素

1.构象改变或立体屏蔽以及微扰

2.分配效应和扩散限制效应

（一）酶的活性：

通常低于天然酶（有例外）。

（二）酶的稳定性酶的耐热性、对变性剂、抑制剂、蛋白酶的抵抗力增加。

可能的原因：①固定化增加了酶活性构象的牢固程度，

可防止酶分子伸展变形；②抑制酶的自身降解。③固定化部分阻挡了外界不利因素对酶

的侵袭。如：氨基酰化酶，70℃，15分钟，酶失去活性。而固定化后，70℃，15分钟，有>80%活性。

（三）酶的最适温度

最适温度与酶稳定性有关。多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升（有例外）。

（四）酶的最适pH

带负电荷载体：最适pH向碱性偏移。

带正电荷载体：最适pH向酸性偏移。

固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。

固定化载体与底物电荷相反,固定化酶的表观Km值降低。

固定化载体与底物电荷相同,固定化酶的表观Km值显著增加。（五）酶的动力学特征

与自然酶基本相同。但大分子底物难于接近酶分子，导致酶的专一性发生改变。（六）酶的作用专一性

与固定化酶相比，固定化细胞的情况比较复杂。（1）有活性升高的现象。（2）稳定性的增加。（3）最适温度和最适pH常保持不变。二、固定化细胞的性质

(一)酶(细胞)的活力

固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定自然酶活力的方法改进后才能用于测定固定化酶。

(二)蛋白总量

1.双辛可宁酸法(BCA法)2.考马斯亮蓝法

三、固定化酶（细胞）的评价指标

(三)偶联率及相对活力

偶联率=(加入蛋白活力一上清液蛋白活力)/加入蛋白活力×100%活力回收=固定化酶总活力/加入酶的总活力×100%相对活力=固定化酶总活力/(加入酶的总活力-上清液中未偶联酶活力)×100%

(四)半衰期

在连续测定条件下，固定化酶(细胞)的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示。

是衡量稳定性的一项重要指标。不同固定化方法的比较carriersRecoveryofenzymeactivity(%)Agar54.0po1yacrvlamldel5.24Gelatin40.77carragheenan69.13Glutaraldehyde0乙酰-DL—AlaL—Ala+乙酸

乙酰-D—Ala第三节固定化酶与固定化细胞的应用

一、在工业生产上的应用1.氨基酰化酶（Aminoacylase）

世界上第一种工业化生产的固定化酶泵储罐反应产物离心机消旋反应器固定化酶柱子晶体L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala

2.葡萄糖异构酶

世界上生产规模最大，应用最为成功的一种固定化酶。二、固定化酶在医学上的应用1.消血栓：纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫反应，无法长期使用。酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。

用包埋法制备的酶固定化技术可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质能自由进出。2.人工肾：原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微胶囊活性炭组成人工肾。酶传感器

固定化酶和电化学传感器的结合。优点：①既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学电极的高灵敏度；②酶的专一反应性，使其具有较高的选择性，能够直接在复杂试样中进行测定。三、在分析检测中的应用SensitiveandspecificRapidSimpleBiosensor

1967年Updike等采用酶的固定化技术，将葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧电极结合，组装成了世界上第一个生物传感器——葡萄糖氧化酶电极。

葡萄糖酶电极

酶电极示意图ß－D－葡萄糖＋O2 D－葡萄糖酸－1，5－内酯＋H2O2半透膜酶胶层感应电极GlucoseGluconicacidGlucoseoxidaseOxygenHydrogenperoxideMembraneElectrode

根据反应中消耗的O2、生成的葡萄糖酸和H2O2的量，可以用氧电极、pH电极和H2O2电极来测定葡萄糖的含量。继酶传感器（enzymesensor）后，又出现：细胞器传感器（cellorganellesensor）组织传感器（tissuesensor）微生物传感器（microbesensor）免疫传感器（immunosensor）1）酶传感器的原理生物传感器

由生物识别单元（如酶、微生物、抗体等）和物理转换器相结合所构成的分析仪器。生物识别元件

(Biologicalrecognitionelement)

是酶、抗原(体)、细胞器、组织切片和微生物细胞等生物分子经固定化后形成的一种膜结构，对被测定的物质有选择性的分子识别能力。

换能器(Transducer)

将识别元件上进行的生化反应中消耗或生成的化学物质，或产生的光或热等转换为电信号，并呈现一定的比例关系。酶传感器工作原理示意图酶传感器主要由固定化酶膜和变换器组成：固定化酶膜：选择性地“识别”并催化被检测物质发生化学反应；变换器：把催化反应中底物或产物的变量转换成电信号，通过仪表显示出来。

2）酶传感器的应用

水质监测

用化学法测定酚时，硫化物、油类等可干扰其测定。

从马铃薯中提纯、经吸附交联得到的固定化多酚氧化酶与氧电极构成酚传感器，可检测大多数酚类化合物。德国研发的环境废水BOD分析仪医疗方面葡萄糖传感器和血糖测定仪

用葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase,GOD）制成葡萄糖传感器，可测定血液中葡萄糖浓度。手掌型葡萄糖(glucose)分析仪SBA-50型单电极生物传感分析仪SBA-70型血糖乳酸自动分析仪食品鲜度鱼鲜度传感器

在日本、加拿大等国广泛用于鱼类鲜度的测定。鱼死后体内ATP经酶解依次形成ADP、AMP、IMP、肌苷、次黄嘌呤和尿酸。鲜度可用K值表示：K=肌苷+次黄嘌呤/ATP+ADP+AMP+IMP+肌苷+次黄嘌呤+尿酸

大多数鱼死后5～20h，ATP，ADP和AMP已分解尽，超过24h，鲜度主要取决于IMP--肌苷---次黄嘌呤---尿酸。

将这三个步骤的三种酶（5’－核苷酸酶、核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶）固定在氧电极上，制成鱼鲜度测定仪。

当K＜20时，鱼极新鲜，可供生食。K在20～40之间为新鲜，必须熟食。K大于40，不新鲜，不宜食用，这与嗅觉检验结果相一致。肉鲜度传感器肉类在腐败过程中会产生各种胺类，故胺类测定能反映肉类的新鲜程度。用腐胺氧化酶与过氧化氢电极构成多胺生物传感器，或用单胺氧化酶膜和氧电极组成的酶传感器测定肉在贮藏过程中的鲜度。污染微生物及病原菌的检测1通过免疫学方法，即获得相应的特异性抗原和抗体进行分析和检测。(1)将适宜的酶与抗原或抗体结合在一起。制成酶标抗体（或酶标抗原）；(2)将酶标抗体（或酶标抗原）与样品中的待测抗原（或抗体）混合，通过免疫反应二者即可特异性地结合在一起，形成酶－抗体－抗原复合物。通过酶催化反应的速度即可测定复合物中酶的含量，进而测出样品中的待测抗原（或抗体）的量。

2.酶联免疫测定

思考题：附录资料：不需要的自行删除儿科疑难病例讨论病例资料一般情况患儿，男，8月，因“发热1天”由门诊拟“上呼吸道感染”于2013年2月17日

收入院。病例资料现病史：

患儿于昨夜无明显诱因下于家中出现发热，体温39.2℃左右，无咳嗽，无鼻塞，自服“小儿柴桂颗粒”后仍有发热，且喂药后患儿呕吐1次，非喷射性，呕出胃内容物，无腹泻，无面色发绀，无抽搐，即来我院就诊。

病来患儿精神偏软，胃纳一般，夜寐欠安，大小便无殊。病例资料个人史、既往史及家族史:未见明显异常情况。病例资料体格检查：T

39.7℃，P

122次/分

,R

28次/分，Wt

10kg，神清，精神尚可，前囟未闭，1.0cm*1.0cm，平坦，气尚平，三凹征阴性，全身未见皮疹，浅表淋巴结未及肿大，巩膜无黄染，外耳道无异常分泌物，鼻不塞，咽红，双侧扁桃未见肿大，颈软，无抵抗，两肺呼吸音粗，未及明显干湿性啰音，心率122次/分,律齐，未及明显病理性杂音，腹平软，未及包块，肝脾肋下未及，脊椎及四肢无关节红肿疼痛，活动自如，神经系统检查病理征未引出。病例资料入院前辅助检查：（2013-02-17我院）血常规+CRP示WBC20.6G/L,N55.3%,L39.47%,HB109g/L，PLT385G/L

，CRP19MG/L。

病例资料初步诊断

急性上呼吸道感染33.47106.615121CRP(mg/L)

41091199352PLT(10^9/L)0.2360.2610.3070.318HCT

8089104105HGB(g/L)2.993.373.894.01RBC(10^12/L)

36.937.924.830.2LY%54.859.974.760.4NE%

22.211.813.624.3WBC(10^9/L)2.252.222.192.17

日期BRT+CRP辅助检查

日期BRT+CRP2.262.273.043.053.07WBC(10^9/L)14.114.317.918.410.5NE%51.72738.942.623.1LY%33.953.839.839.362.8RBC(10^12/L)2.812.712.822.932.99HGB(g/L)7773787979HCT0.2240.210.2260.2340.238PLT(10^9/L)410535814818683CRP(mg/L)19.721722.4918.32<1辅助检查

日期ESR2.172.222.263.10ESR(mm/h)143393101

日期肝功能2.172.232.263.053.10TP(60.0-83.0g/L)68.304773.18083.9ALB(34.0-54.0g/L)44.126.725.832.734.8BIB24.220.347.347.319.1辅助检查辅助检查病毒类：巨细胞病毒抗体IgG陽性(AU/mL)，余均阴性。辅助检查2.21心脏B超：1.心内结构、房室大小、瓣膜活动及血流信号未见明显异常；2.左心室功能测定正常；3.心包少量积液。B超测定左右冠状动脉内径返回未见明显扩张（左冠状动脉起始段内径1.52mm，右冠状动脉起始段内径1.81mm）3.8复查心脏B超：左冠状动脉起始段内径2.5mm，右冠状动脉起始段内