内蒙古大学基因工程大试验思考题

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本科生基因工程试验

(记录及课后思考题)

姓名:学号:专业:

完成日期:2023年9月9日

指导老师:

一、质粒DNA的小量制备

1.影响最终质粒产量的主要因素有哪些？①与菌的生长状况有关

②和提取时的温度有关，需要低温③加溶液Ⅱ、Ⅲ时操作要温柔

④要用酚和氯仿的混合液屡屡抽提去除蛋白质⑤要用冰乙醇沉淀

2.提取到的质粒纯度将直接影响到以后的酶切效果，如何操作才能尽可能的避免蛋白质的污染？

参与酚：氯仿：异戊醇去除蛋白质，氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分开。

二、质粒DNA电泳鉴定

1.泳道的质粒DNA有几条带？为什么？

质粒可能会有超螺旋构型，环状构型和线性构型。这三种构型中，迁移率最快的应当是超螺旋的，其次是线性和环状。寻常观测到的是超螺旋和环状质粒。2.溴酚蓝的迁移率相当于多少bp的DNA？

在0.7%、1%、1.4%、2%的琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝的迁移率分别与1000bp、600bp、200bp、150bp的双链线性DNA片段大致一致3.影响本试验结果的因素有哪些？

DNA的长度，结构，胶的浓度，电压等会对试验结果造成影响。

三、质粒DNA的酶切

1.酶切反应混合物的体积是否对酶切效果有影响？为什么？

有影响

参与反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。2.如何估计DNA用量和酶的用量？

DNA样品的浓度（μg/μl）:OD260×稀释倍数×50/10001U酶切割1ug的质粒，酶的量不要超过酶切体系的1/10。3.在吸取内切酶的时候如何操作才能避免浪费？

将枪头不要插入液体很深部位，刚过液面且可以吸取所需的体积的液体。

四、PCR扩增制备目的基因

1.复性温度是根据什么确定的？

可以根据公式：2（A+T）+4（C+G），再减5-10度,一般为55℃-60℃当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。

双链DNA中的G+C的比率越高，则双链DNA分开变性的温度也就越高。变性所需的时间与DNA分子的长度相关，DNA分子越长，在特定的变性温度下使双链DNA分子完全分开所需的时间就越长。若变性温度太低或变性时间太短，则只能使DNA模板中富含AT的区域产生变性，当PCR循环中的反应温度降低时，部分变性的DNA模板又重新结合成双链DNA，从而导致PCR的失败。非特异性条带数增多。

2.引物序列是根据什么设计的？为什么要加上酶切位点序列？

根据cDNA设计引物，为了更好地与载体连接。3.为什么要在最终延伸10min？

一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物。

4.试验中是否有非特异性扩增产物或引物二聚体带？如何才能消除？

有

①.重新设计引物

②加大模板用量或减少引物用量③扩大反应体系

④提高退火温度或Mg离子浓度

五、从琼脂糖凝胶中回收DNA片段

1.为何避免用EB染色及用紫外灯照射欲回收的目的DNA？

紫外照射对DNA有损伤，，为了保证DNA的完整性，尽量不用EB染色或紫外照射。

六、目的基因片段与载体连接

1．连接酶的最适活性温度是多少？

37℃

2．为什么要采用14℃下连接？

由于热稳定性较差，因此长时间反应时寻常需在14°C下进行3．如何确定插入片段的用量与质粒载体的用量？

一般参考T4连接酶的说明书，大多数人做的是插入片段：载体=3：1至5：1，是分子数的比值。可以先测出两者的质量浓度（分光光度计或者跑电泳），然后根据分子量大小可以算出。

七、感受态大肠杆菌的制备

1.制作感受态菌的过程中，应注意哪些关键步骤？

①操作是防止污染，这个最简单影响感受态制作的因素。②悬浮沉淀的过程，一定要轻轻悬浮，最好轻摇悬浮。2.CaCl2溶液的作用是什么？为什么要冰冷的？

作用：悬浮菌体

在0～4℃，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球状，转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸复合物黏附于细胞表面，较低的温度也降低了相关酶的活性较好的保存了DNA，冰浴过程中，原来加在溶液中的钙离子和细菌细胞膜结合，在低温下形成液晶结构，这样，在42度热激下，这种液晶结构收缩，将细胞膜扯开孔道，使DNA进入细菌细胞中。

八、感受态细菌的转化

1.影响转化效率的因素有哪些？①细菌的生长状态：试验中应密切凝眸细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5α菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）；

②所有操作均应在无菌条件和冰上进行；

③经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加,24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；

④化合物及无机离子的影响：Ca2+的基础上联合其他二价金属离子在（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；

⑤所使用的器皿必需清白。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；

⑥质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA;⑦一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；2.白色菌落出现的原理是什么？

由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。

九、转化克隆的筛选与鉴定

1.PCR法筛选的优点和缺点是什么？

酶切法与PCR法PCR可以直接以菌落做模板，比较便利，但有时候有假阳性；酶切鉴定需要提取质粒才能酶切，比较费时，且插入片段里不能有所选酶的酶切位点，在片段序列未知时不宜判定，但在序列已知时相对可靠筛选方案哪个更可靠？

2.酶切法与PCR法筛选方案哪个更靠谱一些？酶切法，但是比较费时间3.最终确认克隆的方法有哪些？

①直接筛选：有些载体带有可鉴别的遗传标记，能有效地将重组分子与本底区分。

②间接筛选：有引起载体分子带有一个或多个抗药性标记基因，当外源DNA插入到抗药基因区后，基因失活，抗性消失。如一质粒有A和B两个抗药性基因，当外源基因插入到B基因区后，便只抗A药而不抗B药。因此能在A药培养基上正常生长而不能在B药培养上生长的便是重组分子。③核酸杂交：广泛用于筛选含有特异DNA顺序的克隆。方法是将菌落或噬菌斑“印迹〞到硝酸纤维膜等支持物上，变性后固定在原位，然后与标记的核酸探针进行杂交。阳性点的位置就是所需要的克隆。

④免疫学方法：假使重组克隆能在宿主菌中表达，就可以用特异的蛋白质抗体为探针，进行原位杂交，选择特异的克隆。

十、外源基因的诱导表达

1.IPTG的作用原理是什么？

E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调理基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调理，实现基因产物的协调表达2.为什么要增加抗菌素的用量？

携带载体的菌体在正常状况下，由于自身保护作用，会丢失载体，含有载体的菌体由于代谢负担过重，比生长速率小于空载菌体！含有载体的菌体在表达外源基因的同时，也能表达AMP分解酶类。此类酶可以分解青霉素，降低危害。不

含质粒的菌体则无此功能。当菌体接种量很小的时候，不带质粒的菌体生长迅速，很快成为优势菌株，当参与足够量AMP时，就具有选择压力，抑制不带质粒的菌体生长，使得含质粒菌体在种群中占有优势。

十一、SDS检测表达蛋白

1，影响表达的因素都有哪些？（1）外源基因的拷贝数（2）外源基因的表达效率①启动子的强弱

②核糖体接合位点的有效性

③SD序列和起始密码ATG的间距④密码子组成

（3）表达产物的稳定性（4）细胞代谢负荷（5）工程菌的培养条件

2，如何确定凝胶上的某条蛋白质带就是所要表达的外源基因产物？

电泳检测时，加个空白的大肠杆菌蛋白做对照，根据已知的目的蛋白的大小，再加个蛋白，进行对比，一般来说诱导出来的蛋白浓度明显会高于其他蛋白的.3，pET-his载体为什么必需在BL21(DE3)菌，而不能在DH5α中表达？

大肠杆菌DH5α一般做克隆或保存质粒用，BL21用来做原核表达用。BL21(DE3)菌株用于高效表达含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因，表达效率高。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。DH5α可以表达抗性基因，应当也能表达外源基因，但是我们一般不用该菌作为表达菌，可能与表达量、表达产物活性有关。4，表达产物的形式是包涵体还是可溶性蛋白？如何设计