第十三章色谱法导论

第十三章色谱法导论§13-1概论

AnIntroductiontoChromatography色谱：分离技术

分析：定性、定量分析

色谱分析法：是分离技术与适当的检测手段相结合，把各组分含量按顺序检测的方法。

一、色谱法的建立和发展

1906年，俄国植物学家茨维特(M.Tswett)在分离植物叶中色素的实验中，创立了色谱法。

固定相流出液CaCO3石油醚流动相不动的一相——固定相（CaCO3）

携带样品流过固定相的液体——流动相（石油醚）

为什么可以达到分离的目的？

二、分类

（从不同角度进行分类）

1、按两相状态分类

叶绿素A叶黄素螺菌黄质色素

根据混合物中各组分在互不相溶的两相（固定相和流动相)中吸附能力，分配能力或其它亲和力的差异而建立的分离和测定方法，称为色谱分析法。2、按分离机理分类

吸附色谱法

吸附能力

分配色谱法

溶解度

离子交换色谱法

亲和力

排阻色谱法

分子大小

3、按固定相的外形分类

固定相装于柱内的色谱法

固定相呈平板状的色谱法

薄层色谱：吸附剂粉末制成薄膜

纸色谱：滤纸上水分子做固定相

柱色谱法平板色谱法气相色谱法GC液相色谱法LC气固色谱法GSC气液色谱法GLC液固色谱法LSC液液色谱法LLC超临界流体色谱法反复多次（106次）地利用各组分性质上的差异，产生很大的分离效果。

2、灵敏度高：10-11

–10-13g3、分离速度快

4、应用范围广

5、定性困难

因为检测器不能按物质的不同给出不同的特征信号

克服：联用技术

色谱——质谱

色谱——红外

色谱——电化学

三、特点

1、分离效能高

同位素、顺-反异构体、旋光异构体，组分十分相近的物质

A、B两组分在色谱柱中的分离过程。

(1)B组分与固定相作用力>A组分与固定相的作用力

(2)组分既可以进入流动相，也可以进入固定相进行分配

A、B两组分分离是由于它们在色谱柱中的差速迁移。二、分配系数K和分配比k’

1、分配系数K——平衡常数

定义：在一定T、P下，组分在两相间达平衡时，在固定相和流动相中浓度比。

§13-2色谱分离原理

一、分离原理

假设：谱带为什么会展宽？分子的纵向扩散K是由组分和两相的热力学性质决定的，每一个组分有一个特征值。与两相体积、柱管的特征以及所使用的仪器无关。

K值的大小表示组分与固定相分子之间作用力的大小。（用K值的大小比较出峰先后）

意义：

K

与固定相作用力

滞留时间

出柱先后

大

大长后

小

小短先

0

不进入无很快

很大不出结论：

不同组分K的差异，是实现色谱分离的先决条件，K相差越大，越容易实现分离。2、分配比k‘

——容量因子定义：在一定的T、P下，组分在两相间达分配平衡，组分在固定相和流动相中的质量之比。k‘

也决定于组分及两相的热力学性质，不仅随柱温、柱压变化而变化，还与固定相和流动相的体积有关

在描述色谱分离时，K与k‘

是完全等效的。但因为k‘

能从色谱图中求得，故比K更有用。§13-3色谱图及常用术语

试样各组分经色谱分离后，从柱后流入检测器，检测器将各组分浓度（质量）的变化转化为电信号。由检测器输出的电信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线或色谱图。

一、基线

在实验操作条件稳定后，无样品通过时，检测器所反映的电信号-时间曲线。

稳定的基线是一条直线。

t电信号OO’色谱流出曲线二、保留值

保留值是试样中各组分在色谱中滞留时间的数值，通常用时间或将组分带出色谱柱所用的载气的体积表示。

1、保留值定义

组分从进样开始到出现色谱峰最大值时，所需要的时间。

就是某组分通过色谱柱所需要的时间。组分在柱内运行的时间。

（2）死时间不被固定相保留的组分，从进样开始到出现峰极大值所需要的时间。

（1）保留时间流动相流经色谱柱所需要的时间。对于GC组分实际在固定相中停留的时间流动相的平均线速度cm/s（3）调整保留时间

某组分的tR

扣除tM

后，称为调整保留时间

组分与固定相之间相互作用而引起组分在柱内滞留的时间

组分在流动相中所消耗的时间

（4）保留体积

对应于tR

所流过的流动相的体积

流动相的平均体积流速mL/min组分在流动相中所消耗的时间。

对应于tM

所流过的流动相的体积

色谱柱中没有被固定相占据的空隙体积。如柱管内固定相颗粒所剩余的空间，色谱仪管路和连接头之间的空间以及检测器空间的总和。后两项很小，可以忽略。

（6）调整保留体积组分停留在固定相时所消耗的流动相的体积。

反映各组分分子与固定相分子间作用力的大小

保留值是色谱分离过程中组分在柱内滞留行为的一个指标。它与分配过程有关，受热力学因素控制。

2、保留值与分配系数K的关系

（5）死体积本意：意义某组分的色谱峰最高点出现时，说明该组分一半洗脱在一定体积的流动相中，这个体积就是保留体积。一半仍留在柱内。物料平衡：

色谱过程基本方程

调整保留体积与分配系数成正比，K越大，VR’

越大，组分在柱内停留时间越长

3、保留值与k’

的关系

4、相对保留时间（选择性因子）组分2与组分1的调整保留值之比

2，1>12,1值标志两个峰在色谱图上的相对位置，从色谱图上方便求得

（2）2，1用来讨论固定相对组分的分离能力（1）2，1是两组分在色谱体系中平衡分配差异的量度，是一个热力学参数。讨论三、峰高

峰顶点到基线的距离h四、峰面积

峰与基线延长线所包围的面积。A=1.065hW1/2

t电信号hWbW1/2½h2σ0.607h（3）2，1主要决定于固定相的性质，其次是柱温。还与组分和流动相的性质有关。（4）2，1与柱尺寸及流动相流速无关（5）2，1越大，两峰相距越大，即色谱柱的分离选择性越强，越容易实现分离。EF五、区域宽度区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，是组分在色谱柱中展宽因素的函数，是一个动力学参数，从色谱分离考虑，区域宽度越窄越好。峰高一半处的宽度。1/2h处宽度W1/2

。从色谱峰两侧拐点所作切线于基线交点之间距离，也称峰底宽度。正态分布曲线两侧拐点之间距离的一半。1、半峰宽W1/22、峰底宽度Wb3、标准偏差0.607倍峰高处的色谱峰宽度的一半。电信号时间由色谱流出曲线上，可得到以下信息:1根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析。2根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析。3根据色谱峰的区域宽度及保留值，评价色谱柱的分离效能。4根据色谱峰两峰间的距离，评价固定相（和流动相）的选择是否合适。§13-4色谱法基本理论A和B两组分完全分离的必要条件：第一：两组分的分配系数必须有差异；第二：区域扩宽的速度应小于区域分离的速度；溶质A和B在沿柱移动时不同位置处的浓度轮廓浓度LABAB一、塔板理论Martin等人于1952年提出的，将一根色谱柱当作一个精馏塔。用塔板的概念来描述组分在色谱柱内的分配行为。固定相流动相H假设：1、H是达成一次平衡分配所需柱长——理论塔板高度H。柱长L平衡分配的总次数2、组分流过色谱柱时在两相进行平衡分配总次数n——理论塔板数n4、分配系数为常数K3、分子纵向扩散可忽略。结论：1、当n>50时，流出曲线是对称峰形的曲线。GC103~106

符合高斯分配。2、n、H用来评价柱子的柱效n↑（H↓）塔板数越多，组分在柱内两相间达到分配平衡的次数越多，柱效越好，分离就越好。3、n与W1/2

的关系

5、流动相脉冲式进入色谱柱，每次进入一个板体积tR

与W1/2

单位相同

tR

cmsW1/2cms实际上，n值尽管很大，H很小，但与实际柱效相差甚远，为什么呢？

有效理论塔板数neff

和有效塔板高度Heff

4、5、neff与n的关系问题：

（1）峰变宽的原因

（2）不同流速下，有不同的理论塔板数

H1956年荷兰学者范第姆特

二、速度理论——色谱动力学理论

平均线速度，单位时间里流动相在柱中流动的距离cm/s

A涡流扩散项

B分子扩散系数

C传质阻力项系数

H峰展宽的量度1、涡流扩散项——A

##################原始谱带的宽度在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“涡流”的流动，故称涡流扩散。

dp

填充物的平均直径填充不规则因子#################最后谱带的宽度结论：细而均匀（筛分范围越窄越好）对于空心毛细管A=0A与流动相性质、u无关2、分子扩散项B/u（纵向扩散项）r：弯曲因子，反映了固定相颗粒的几何形状对分子自由扩散的阻碍情况。Dg：组分在流动相中的扩散系数cm2/s结论：（1）流动相t3>t2>t1

t3t1t2H(2)降低B，提高柱效使用分子量大的载气，N2、Ar降低柱温，增高柱压较高的载气线速度3、传质阻力项气液色谱气相传质阻力系数液相传质阻力系数（1）气相传质阻力系数Dg：组分在流动相中的扩散系数cm2/sdp

填充物的平均直径提高柱效，减小Cg粒度小的填充物使用分子量小的载气H2（2）液相传质阻力系数df

固定相液膜厚度Dl组分在液相的扩散系数一般采用比表面积较大的载体来降低液膜的厚度。范第姆特方程速度方程影响峰展宽因素：（1）填充物的粒度（2）填充的均匀程度（3）流动相的种类和流速（4）固定相液膜厚度（5）适当的柱温三、范氏方程曲线（气相色谱）H结论：（1）涡流扩散与流动相线速度无关（4）最低点：Hmin

最佳流速uopt

此时可得到最高的柱效。（3）在流动相线速度大时，传质阻力占主导地位，选相对分子量小H2

、He

作载气，使组分有较大的扩散系数，提高柱效（2）在流动相线速度小时，纵向分子扩散占主导地位，此时选相对分子量大N2

、Ar作载气。§13-5分离度H↓n↑选择性选择性和柱效均差选择性好但柱效低选择性好，柱效高，分离理想柱效能一、分离度RS

定义：相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽总和一半的比值对于相邻峰，峰宽可大致认为相等，即讨论：①当RS<1两峰部分重叠RS=1分离2%重叠分离<1%重叠RS=1.5认为完全分离②认为二、基本色谱分离方程式

(1)(2)(3)(4)(5)将（3）、（4）、（5）式代入（1）式，得基本色谱分离方程式色谱法最重要公式之一基本色谱分离方程式的又一表达式1、分离度与柱效的关系提高柱效是提高分离度最直接也是最有效的手段增加n增加柱长L增长分析时间减小H提高分离度最好的办法采用直径较小，粒度均匀的固定相，均匀地填充色谱柱，分配色谱还需控制较薄的液膜厚度。适宜的操作条件，如流动相的性质、流速、温度510洗脱时间2、分离度与容量因子的关系3、分离度与选择因子的关系LC通过控制流动相的强度（极性），控制分配比，极性大，分配比小。增大，Rs也增大实验证明，微小的变化，就能引起Rs显著的变化GC增加固定相用量，降低柱温，分配比增加。最佳值2~5从分离度和分离时间及峰的检测等方面综合考虑§13-6色谱定性和定量分析

定性：保留值

定量：峰面积

一、定性分析2,11.101.20Rs1.8933.473增加2,1

值，是改善Rs最有利的手段。但2,1的变化不象n和k‘有规律可循。电信号时间依据:保留值

1、利用已知纯物质对照定性

只适用于组分性质有所了解（来源、性质、分析目的、样品组成初步了解等），组成比较简单，且有未知物的标准物。

缺点：对操作条件要求严格

2、相对保留值法

用相对保留值定性时，只要保持柱温和固定相不变即可。

这种方法要求找一个基准物S，一般选用苯，正丁烷、环己烷等作为基准物。所选用的基准物的保留值尽量接近待测组分的保留值。文献对照，即可定性

3、保留指数定性法

保留指数又称柯瓦指数，是一种重现性较其他保留数据都好的定性参数，可根据所用固定相和柱温直接与文献值对照，而不需标准样品。

人为规定正构烷烃的保留指数为其碳数乘100，如正己烷600、正辛烷800。

至于其他物质的保留指数，则可以采用两个相邻正构烷烃保留指数进行标定。

如何测样品X的保留指数？将碳数为n和(n+1)的正构烷烃加于样品X中，测得它们的调整保留时间分别为

电信号时间则组分x的保留指数可按下式计算，即

文献值定性鉴定（柱温、固定液相同），不必用标准样品

4、双柱、多柱定性法

若所选的两个正构烷烃的碳原子数相差Z5、与其他方法结合定性法

气相色谱与质谱、Fourier红外光谱、发射光谱等仪器联用是目前解决复杂样品定性分析的最有效工具之一

二、定量分析

求出混合样品中各组分的百分含量P（％）

当操作条件一定时，被测组分的质量（或浓度）与检测器给出的响应信号（色谱图中的峰面积Ai或峰高hi）成正比

任务依据mi

被测组分i的质量

Ai被测组分i的峰面积

fi

被测组分i的校正因子

需要（1）准确测量检测器的响应信号——峰面积或峰高

（2）准确求得比例系数——校正因子

（3）合适的定量计算方法，将测得的峰面积或峰高换算为组分的百分含量

1、峰面积的测量

（1）对称峰

A=1.065hw1/2

（2）不对称峰

A=1/2(w0.15+w0.85)（3）自动积分仪

（4）痕量分析用峰高

2、校正因子

色谱定量是基于被测物质的量与其峰面积成