干细胞与组织工程间充质干细胞及其应用

干细胞与组织工程间充质干细胞及其应用第1页，共36页，2023年，2月20日，星期四间充质干细胞与骨关节疾病一.概述二.间充质干细胞的来源三.间充质干细胞的生物学特性四.间充质干细胞的分离培养五.间充质干细胞的诱导分化六.间充质干细胞的临床应用研究第2页，共36页，2023年，2月20日，星期四一.概述何谓间充质干细胞？

间充质干细胞（MesenchymalStemCell，

MSC）具有亚全能分化潜能，在特定的体内外环境下，具有向多种类型细胞分化的能力，可以分化为骨、软骨、肌腱、脂肪、心脏、肝脏、神经、上皮等多种细胞。由于能分化为多种中胚层来源的间质细胞而得名。MSC应用广泛第3页，共36页，2023年，2月20日，星期四二.间充质干细胞的来源骨髓来源的MSC肌肉来源的MSC

骨来源的MSC

软骨来源的MSC

腱来源的MSC

脂肪来源的MSC

脐带血来源的MSC

第4页，共36页，2023年，2月20日，星期四二.间充质干细胞的来源

间充质干细胞广泛分布于胎儿和成体的骨膜、松骨质、脂肪、滑膜、骨骼肌、胎肝、乳牙、脐带、脐带血中。骨髓来源的MSC

仅占骨髓细胞的0.001‰～0.1‰

第5页，共36页，2023年，2月20日，星期四二.间充质干细胞的来源骨髓来源的MSC第6页，共36页，2023年，2月20日，星期四二.间充质干细胞的来源脐带血来源的MSC

第7页，共36页，2023年，2月20日，星期四三.间充质干细胞的生物学特性（一）MSC形态特征及生长特性第8页，共36页，2023年，2月20日，星期四三.间充质干细胞的生物学特性（二）MSC分化潜能

具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下不仅可分化为造血细胞，还具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。第9页，共36页，2023年，2月20日，星期四过氧化物酶体增殖激活受体-2第10页，共36页，2023年，2月20日，星期四第11页，共36页，2023年，2月20日，星期四三.间充质干细胞的生物学特性(三)

MSC的表面标志及鉴定MSC没有一个独特的已知表面标志物。

目前比较公认的鉴定方法是：

MSC缺乏：造血干细胞标志CD34,CD45,CD11b

MSC表达：CD90，CD71，CD44第12页，共36页，2023年，2月20日，星期四三.间充质干细胞的生物学特性（四）MSC免疫学特性

1.MSC低免疫原性不表达MHC-II类分子和Fas-L;也不表达B7-1,B7-2…..

2.MSC具有免疫调节功能

通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能。

正是由于间充质干细胞所具备的上述免疫学特性:

*

MSC在自身免疫性疾病以及各种替代治疗等方面具有广阔的临床应用前景。

*通过自体移植MSC可以重建组织器官的结构和功能，并且可避免免疫排斥反应。

第13页，共36页，2023年，2月20日，星期四三.间充质干细胞的生物学特性（五）MSC具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性。

第14页，共36页，2023年，2月20日，星期四四.间充质干细胞的分离培养（一）间充质干细胞的分离1.贴壁分离法（全骨髓法或一步法）：例：小鼠骨髓间充质干细胞的分离1)取4~6周龄正常昆明鼠2只的股骨和胫骨，用PBS洗净，去掉干骺端2)用1ml无菌注射器，吸取1ml含9%FBS的RPMI-1640，12μM的L-谷氨酰胺、1%青霉素和1%链霉素的筛选培养基（CIM），冲出骨髓

第15页，共36页，2023年，2月20日，星期四（一）间充质干细胞的分离

1.贴壁分离法：

3)将骨髓吹打均匀后，静置5分钟，以2×106/ml接种到25cm2培养瓶内，于37℃、5%CO2培养箱中培养.4）24~48h后，换液，弃去未贴壁细胞，PBS洗3次，每3~4天换一次液.

5）待细胞90%融合后传代（大约10~14天），用0.05%的胰酶和0.02%EDTA消化3分钟，含血清的培养基终止消化，1000rpm，5min离心，收集细胞,1：2传代。四.间充质干细胞的分离培养第16页，共36页，2023年，2月20日，星期四（一）间充质干细胞的分离单纯上述贴壁分离法难以获得纯的MSC。2.密度梯度离心法：

人骨髓间充质干细胞的培养常用此法。根据各种骨髓细胞比重不同获取单个核细胞进行贴壁培养。3.差速贴壁4.FCM5.免疫磁珠法四.间充质干细胞的分离培养第17页，共36页，2023年，2月20日，星期四四.间充质干细胞的分离培养（二)间充质干细胞的二维培养1.低氧张力下的培养2.极低密度传代培养3.基因转染的MSC培养第18页，共36页，2023年，2月20日，星期四四.间充质干细胞的分离培养(三）间充质干细胞的三维培养由于二维培养存在着如下缺点：1.贴壁的表面积有限，细胞产量低；2.无菌操作过程繁琐，容易污染；3.代谢产物排除不及时，细胞生长不良；4.细胞离开体内三维结构，生物学行为受影响有学者采用胶原海绵进行三维灌注培养，较好。但尚有诸多问题待解决。第19页，共36页，2023年，2月20日，星期四五.间充质干细胞的诱导分化（一）间充质干细胞的定向诱导分化1.向骨组织的诱导分化

地塞米松

－甘油磷酸抗坏血酸

1,25-（OH）2-D3TGF-IL-6BMP-2

透明质酸诱导因素鉴定标志碱性磷酸酶；骨桥蛋白；骨钙蛋白；第20页，共36页，2023年，2月20日，星期四碱性磷酸酶染色显示成骨作用第21页，共36页，2023年，2月20日，星期四VonKossa染色显示含钙组织细胞第22页，共36页，2023年，2月20日，星期四五.间充质干细胞的诱导分化（一）间充质干细胞的定向诱导分化2.向软骨组织的诱导分化分离得到的MSC先经低速离心形成细胞微团，之后加入无血清培养体系。诱导因素TGF-3Cartilage-derivedmorphogeneticprotein-1,CDMP-1integrin鉴定标志CollagenIICollagenIXCartilageoligomericmatrixprotein,COMP第23页，共36页，2023年，2月20日，星期四五.间充质干细胞的诱导分化（一）间充质干细胞的定向诱导分化3.向脂肪组织的诱导分化诱导因素地塞米松胰岛素吲哚美辛(消炎痛)鉴定标志脂肪染色过氧化物酶体增殖激活受体-2脂蛋白脂肪酶脂肪酶结合蛋白aP2第24页，共36页，2023年，2月20日，星期四油红O染色鉴定成脂作用第25页，共36页，2023年，2月20日，星期四油红O染色鉴定成脂作用第26页，共36页，2023年，2月20日，星期四五.间充质干细胞的诱导分化（一）间充质干细胞的定向诱导分化4.向肌肉组织的诱导分化

诱导因素鉴定标志两性霉素B5-氮杂胞苷5-氮-2’脱氧胞苷多核细胞（形态）肌球蛋白肌细胞生成素等第27页，共36页，2023年，2月20日，星期四五.间充质干细胞的诱导分化（一）间充质干细胞的定向诱导分化5.向其他中胚层组织的分化

6.检测细胞分化的其他方法上述组织化学…..分子生物学….

第28页，共36页，2023年，2月20日，星期四五.间充质干细胞的诱导分化（二）间充质干细胞与相关因子1.TGF-家族对MSC的作用

TGF-促进MSC分化（成骨）

TGF-与其他因子的协同作用，如与IGF-I的协同作用（成软骨）2.BMP对MSC的作用

BMP-2可诱导MSC向成骨和成脂肪方向分化第29页，共36页，2023年，2月20日，星期四五.间充质干细胞的诱导分化（二）间充质干细胞与相关因子3.FGF对MSC的作用

MSC表面有FGF1和FGF2的受体（促增殖)*bFGF单独作用具有有丝分裂原作用*bFGF与BMP-2协同作用可促进MSC的成骨能力第30页，共36页，2023年，2月20日，星期四六.间充质干细胞的临床应用研究（一）MSC在软骨组织修复中的应用（1）软骨表型的诱导分化前述（2）工程化软骨组织的体外构建

（3）细胞-支架复合物植入组织缺损处第31页，共36页，2023年，2月20日，星期四

分离得到的MSC先经低速离心形成细胞微团，之后加入无血清培养体系。诱导因素TGF-3Cartilage-derivedmorphogeneticprotein-1,CDMP-1integrin鉴定标志CollagenIICollegenIXCartilageoligomericmatrixprotein,COMP软骨表型的诱导分化第32页，共36页，2023年，2月20日，星期四软骨组织工程基本方法示意图A获取骨髓组织B分离、培养MSCC制备三维支架D将种子细胞种植于支架E将细胞-支架复合物植入组织缺损处第33页，共36页，2023年，2月20日，星期四实验中的组织工程耳第34页，共36页，2023年，2月20日，星期四六.间充质干细胞的临床应用研究（二）MSC在骨组织修复中的应用1.骨组织工程种子细胞的来源骨髓来源的MSC最有优势。2.MSC