基因工程常用的工具酶课件

第二章基因工程常用的工具酶第一节限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶：简称限制酶。是一类能识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶

20世纪50年代发现：λ噬菌体E.coliBPFU10-4E.coliB

PFU1λ噬菌体DNA被降解DNA被修饰E.coliB限制性核酸内切酶：降解外来DNA防御修饰酶：DNA甲基化保护寄主细胞控制的限制与修饰系统（R/M体系）！一、限制酶的种类限制修饰活性酶蛋白结构相对分子质量切割位点切割作用辅助因子实用性代表Ι型酶Ⅱ型酶

Ⅲ型酶同时存在单独存在同时存在多亚基结构单亚基结构两个亚基30万dal2-10万dal

Ι、Ⅱ之间

与识别位点不一致与识别位点一致与识别位点不一致Mg2+、ATP、SAMMg2+

Mg2+、SAM

低高低EcoK、EcoBHindⅡ

EcoPΙ三、Ⅱ型限制酶的特性-识别序列识别双链DNA分子中特定的4-8对核苷酸序列5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的识别序列EcoRI的切割位点5‘…GAG

GC

CGAG…3’3‘…CTCCG

GCTC…5’HaeⅢ的识别序列HaeⅢ

的切割位点大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧部分限制酶能识别多种核苷酸序列5‘…GCGT

PyPuACGAG…3’3‘…CGC

APuPy

TGCTC…5’HindⅡ的识别序列PydCMP、dTMPPudAMP、dGMP识别序列呈典型的旋转对称型回文结构5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的识别序列EcoRI的切割位点回文结构:两条核苷酸链的核酸序列呈双重旋转对称排列的DNA双螺旋结构三、Ⅱ型限制酶的特性-同尾酶、同裂酶同尾酶:来源各异、识别序列也不相同，但都产生相同粘性末端的一类限制酶5‘…GTGGATCCGA…3’3‘…CACCTAGGCT…5’BamHI5‘…GTGGATCCGA…3’3‘…CACCTAGGCT…5’5‘…GTTGATCAGA…3’3‘…CAACTAGTCT…5’BclI5‘…GTTGATCAGA…3’3‘…CAACTAGTCT…5’BamHI、BclI为一组同尾酶同裂酶:来源各异，但识别相同核酸序列的一类酶5‘…GTGATCGA…3’3‘…CACTAGCT…5’Sau3AI5‘…GAGATCCA…3’3‘…CTCTAGGT…5’MboI5‘…GTCCCGGGGA…3’3‘…CAGGGCCCCT…5’XmaI5‘…GTCCCGGGGA…3’3‘…CAGGGCCCCT…5’SmaI四、影响限制酶活性的因素DNA的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、EDTA、SDS增加限制酶用量扩大酶催化反应体系延长酶催化时间DNA的甲基化程度：反应温度：DNA的分子结构：酶缓冲液组成：甘油浓度：MgCl2：NaCl/KCl：Tris-HCl：β-巯基乙醇/二硫苏糖醇（DTT）：牛血清白蛋白（BSA）：DNA连接酶：能够催化双链DNA片段相邻的3‘羟基与5’磷酸基形成磷酸二酯键的酶作用特点只能连接双螺旋DNA分子，不能连接单链DNA分子；DNA链上必须具有游离的3’-OH和5‘-P；只能封闭DNA链上磷酸二酯键切口，不能封闭多个核酸分子缺失形成的裂口；需要吸能：ATP/NAD+连接方式缺口DNA:平齐末端DNA：粘性末端DNA：5’5’3’3’OHP5’5’3’3’OHPPOH5’5’3’3’基因工程中常用的连接酶T4噬菌体DNA连接酶（T4连接酶）大肠杆菌DNA连接酶热稳定性DNA连接酶第三节DNA聚合酶一、大肠杆菌DNA聚合酶Ι（DNApolI）酶特性：5’→3’聚合酶活性5’→3’核酸外切酶活性3’→5’核酸外切酶活性3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’dNTPMg2+DNApolI3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH5‘…C-G-A-G-T-OH切口平移反应（Nicktranslation）用途：制备32P标记的DNA探针5’→3’核酸外切酶活性5’→3’核酸聚合酶活性5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘DNaseIDNApolIMg2+dNTPa-32P-dATP二、Klenow大片段酶DNA聚合酶一个片段：5’→3’核酸外切酶活性另一个片段：

5’→3’聚合酶活性、3’→5’核酸外切酶活性枯草杆菌蛋白酶Klenow大片段酶Klenow大片段酶特性：5’→3’聚合酶活性

3’→5’核酸外切酶活性用32PdNTP对3‘凹端进行末端同位素标记5‘…G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C…5’Klenowa-32P-pppdAdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’cDNA克隆中，合成cDNA第二链应用sanger双脱氧末端中止法进行DNA测序三、TagDNA聚合酶来源嗜热水生栖热菌酶特性5’→3’聚合酶活性、3’→5’核酸外切酶活性耐高温：75~80℃应用：PCR技术（聚合酶链式反应）94℃变性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）温度（℃）时间（min）947260循环1循环2循环3PCR反应的温度循环周期特点待扩增的DNA链限定在模板上的退火位点之间待扩增DNA链得到迅速大量扩增反应体系组成影响因素模板dNTPDNA聚合酶引物A、BMgCl2引物的设计退火温度MgCl2浓度作用底物：带3’-OH末端的单链DNA5‘pOH3‘TDTMg2+

dATPAAAAAAAAAAAAOH3‘5‘p带3’-OH单链突出末端的双链DNA5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TDTMg2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAA

OH3‘

p5‘

带3’-OH平齐末端的双链DNA5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TDTCo2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOH3‘

p5‘

用途：外源DNA与载体的重组DNA片段3‘端标记二、碱性磷酸酶细菌碱性磷酸酶（BAP）：来自E.coli小牛肠碱性磷酸酶（CIP）：来自小牛肠作用：催化核酸分子脱去5’-P5‘pOH3‘

DNAorRNA5‘pppdNTP5‘pppNTPBAP/CIPOH3‘

5‘HO5‘HO