药物分析11第十一章抗生素类药物

第一节概述一、抗生素药物的特点：抗生素（antibiotics）是指“在低微浓度下即可对某些生物的生命活动有特异性抑制作用的化学物质的总称”。1．低化学纯度－同系物多、异构体多、降解物多；2．活性组分易发生变异;活性组分的变异性－生产过程中条件的变化；3．稳定性差－不稳定性结构。第一页，共86页。二、抗生素类药物的质量分析QualityAnalysis/QualityControl-QA/QC鉴别试验Identification㈠1．显色反应——特殊基团的反应（β-内酰胺类的羟肟酸铁反应、麦牙酚反应、坂口反应）2．光谱法——特征吸收（IR、UV）3．色谱法——保留行为（标准对照法）4．生物学方法——抗菌能力（抗生素灭活前后的抑制菌能力）第二页，共86页。㈡检查（Investigation）1、影响产品稳定性的指标——结晶性、水份、酸碱度等2、有机和无机杂质检查——澄清度与颜色、有关物质、重金属等3、与临床安全性密切相关的指标——异常毒性、热原、降压物质等4、其他检查——“悬浮时间与抽针试验”、其他共存组分第三页，共86页。含量测定或效价测定(Potency)Determination㈢Potency:是指每ml或每mg中含有某种抗生素有效成分的多少，以u或μg表示。以抗生素对微生物的杀伤或抑制程度为指标来判断效价的一种方法。如：1mg的青霉素钠为1670单位；1mg的庆大霉素定为590单位。（以上仅为理论效价，实验样品低于该理论效价）第四页，共86页。1、微生物检定法稀释法－配制含不同浓度药物平板，使用多头接种器接种细菌，经孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含药物浓度测得最低抑菌浓度(MIC)。比浊法－标准曲线法。管碟琼脂扩散法－抑菌圈。标准曲线法或者标准对照法，以抑菌圈直径为横坐标，含药浓度为纵坐标。方法种类第五页，共86页。灵敏度高、需用量少适用范围广－纯品、不纯品、已知的和新的可一次测定同类型抗生素的总效价－无需分离纯化，与临床的应用要求一致操作繁琐、费时费力误差较大培养时间长是结构复杂和多组分抗生素效价测定的首先方法特点缺点第六页，共86页。2、物理化学法High-performanceliquidchromatography（HPLC）Liquidchromatography-Massspectrometry（LC-MS）UV容量法准确可靠、专属性高、操作简单、省时、样品用量少1、对结构已知或提纯的抗生素2、需要标准品对照仪器分析方法1、不一定代表生物效价2、易受杂质干扰缺点适用范围优点第七页，共86页。β－内酰胺类抗生素－青霉素、头孢菌素类氨基糖苷类抗生素－链霉素、庆大霉素、卡那霉素等四环素类抗生素－四环素、金霉素、土霉素等大环内酯类抗生素－红霉素、麦迪霉素、螺旋霉素等多烯大环类抗生素－制菌霉素、两性霉素B多肽类抗生素－放线菌素、多黏菌素苯烃胺类抗生素－氯霉素

蒽环类－阿霉素、紫红霉素等三、抗生素类药物的分类(Classification）第八页，共86页。四、抗生素的生产与杂质来源（一）抗生素的生产主要采用两种方法：（1）生物合成（发酵）：生物包括微生物（真菌、放线菌、细菌等）、植物、动物。（主要生产方法）（2）化学合成或半合成方法制取（少数生产方法）（二）抗生素杂质的主要来源：（1）生产过程中带入（2）贮藏过程中产生第九页，共86页。第二节-内酰胺类抗生素

（-LactamAntibiotics）

*

1.青霉素类（PC）

*

2.头孢菌素类（CEP）

3.头霉素

4.-内酰胺酶抑制剂

5.其他第十页，共86页。一、化学结构的特点：1、分子结构的母核由A环（-内酰胺环）与B环（氢化噻唑环式氢化噻嗪环）骈合而成：青霉素族（PC）的母核：6-氨基青霉烷酸（6-aminopenicillanicacid，简称6-APA）；头孢菌素（CEP）族的母核：7-氨基头孢菌烷酸（7-aminocephalosporanicacid，简称7-ACA）。第十一页，共86页。青霉素族（PC）头孢菌素族（CEP）β-内酰胺类抗生素结构6-APA7-ACA第十二页，共86页。β-内酰胺类抗生素结构示例：

青霉素类头孢菌素类碳青霉烯类头霉素类单环β-内酰胺类第十三页，共86页。理化性质（1）酸性与溶解度；（2）旋光性；（3）紫外吸收光谱；（4）-内酰胺环的不稳定性第十四页，共86页。酸性结构特点与性质与碱金属(Na+、K+)成盐

（一）羧基

易溶于水

Na第十五页，共86页。（二）手性C

头孢菌素类

C6C7青霉素类C3C5C6

旋光性﹡﹡﹡﹡﹡第十六页，共86页。

（三）共轭体系

头孢菌素类

母核有共轭体系

青霉素类

母核无明显UV

多数有苯环取代基

UV第十七页，共86页。（四）β–内酰胺环

水溶液

不稳定

干燥纯净

稳定

不稳定性因素四元环张力大

酰胺键易水解

放置环境青霉素类

某些氧化剂酸、碱、青霉素酶（某些金属离子）（温度）降解失效第十八页，共86页。二、鉴别反应1、TLC法2、HPLC法比较Rf和斑点颜色供试品对照品相同条件Rt比较供试品对照品相同条件（一）色谱法第十九页，共86页。（二）光谱法1．红外光谱（IR）吸收波数cm-1归属波数cm-1归属3470，3180酚羟基和酰胺γO-H，N-H1585，1400羧基离子γCOO-3100~2600胺盐γN+-H1620苯环γC=C1780Β-内酰胺γC=O1250酚羟基γC-O1690仲酰胺γC=O第二十页，共86页。β-内酰胺环酰胺115251680-=cm、VOC117501800-=cm~VOCNHV=13300-cmCOOHV-114101600-cm、羧基第二十一页，共86页。3180cm-1N-Hβ–内酰胺C=O1780cm-13470cm-1O-H1690cm-1仲酰胺C=O1250cm-1C-O以阿莫西林IR图谱为例第二十二页，共86页。2、UV法样品、分解产物

①利用最大吸收波长鉴定法；②水解产物的最大吸收波长鉴定法。头孢氨苄λmax=262nm青霉素V钠A280nm/A264nm=1.30～1.50Cu2+苯唑青霉烯酸苯唑西林钠+HnmA339®A,Emin,max,,%cm11λ光谱图λ第二十三页，共86页。第二十四页，共86页。（三）呈色反应1、羟肟酸铁反应β-内酰胺类NaOH呈色Fe3+/3H+羟肟酸衍生物H2NOH·HClβ-内酰胺类H2NOHHClNaOH，C2H5OH第二十五页，共86页。2.类似肽键的反应——茚三酮反应

α-氨基蓝紫色-氨基茚三酮第二十六页，共86页。3.双缩脲反应似肽键（开环分解）-内酰胺类碱性酒石酸铜紫色4.与重氮苯磺酸反应头孢哌酮酚羟基橙黄色重氮苯磺酸--56OHHC（偶合）第二十七页，共86页。5.与变色酸-硫酸反应活泼“-CH2-”青霉素阿莫西林氨苄西林变色酸显色△（分解）第二十八页，共86页。1.K+、Na+的火焰反应（四）各种盐的反应

焰色→鲜黄色

+醋酸氧铀锌→↓黄

Na+

焰色→紫色

+0.1%四苯硼钠

+Ac→↓白

K+第二十九页，共86页。三、特殊杂质的检查本类抗生素的特殊杂质主要有高分子聚合物、有关物质、异构体等，一般采用HPLC法控制其限量，也有采用测定杂质的吸收度来控制杂质量的。

药物检查项目检查方法

头孢他啶聚合物HPLC法

头孢曲松钠

头孢哌酮钠

头孢噻肟钠

头孢呋辛酯有关物质和异构体HPLC法

头孢氨苄有关物质反相TLC法

青霉素钾（钠）吸收度紫外分光光度法

第三十页，共86页。

（一）聚合物

示例：以头孢他啶中头孢他啶聚合物的测定。固定相：葡聚糖凝胶G-10（40-120µm）

流动相A：3.5%硫酸铵的0.01mol/L磷酸盐缓冲液

流动相B：0.01%十二烷基硫酸钠

对照品溶液：头孢他啶对照品100µg/ml1）系统适用性试验：N不低于900，拖尾因子，峰面积的RSD应小于5.0%。

2）测定方法：以外标法计算，含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得超过0.3%第三十一页，共86页。

（二）有关物质和异构体

示例1：头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查

固定相：ODS

流动相：0.2mol/L磷酸二氢铵-甲醇（62:38）

1）头孢呋辛酯Δ2-异构体的制备：头孢呋辛酯对照品+流动相头孢呋辛酯Δ2-异构体。

2）系统适用性试验：各异构体之间的R>1.5，以头孢呋辛酯A异构体计算n>1500。第三十二页，共86页。

3）异构体：

相对保留时间1--被测物

2--标准物异构体相对保留时间判断B异构体0.85供试液谱图中A异构体的峰面积A异构体1.0与A、B异构体峰面积和之比应为0.48~0.55。异构体A异构体B头孢呋辛第三十三页，共86页。示例2：头孢氨苄中有关物质的检查-反相TLC法

固定相：活化后的硅胶G板置5%（V/V）正十四烷的正己烷溶液中，展至顶部，凉干展开剂:0.1M枸橼酸-0.2M磷酸氢二钠-丙酮（120：80：3）

供试液：本品50mg/ml

对照液（1）:本品0.5mg/ml

对照液（2）:α-苯甘氨酸0.5mg/ml

对照液（3）:7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸0.5mg/ml结果判断：供试液如显杂质斑点，与对照液（2）（3）位置相同上所的斑点比较，其颜色不得更深；如显其他杂质斑点，与对照液（1）所显的主斑点比较，其颜色不得更深。第三十四页，共86页。（三）吸收度：ChP中常用来控制本类抗生素的杂质含量。示例：青霉素钠（钾）的吸收度检查：供试液：1.80mg/ml，

结果判断：A280不得大于0.10（控制杂质量）；A264（检查药物量）。第三十五页，共86页。本类药物多采用理化测定方法进行含量测定，Ch.P收载的主要方法有：HPLC法、电位配位滴定法、可见–紫外分光光度法、碘量法等。

2005年版Ch.P中收载的抗生素品种共有284个，其中使用了HPLC法的品种有205个，约占70%。用于检测的项目有：鉴别、有关物质检查、组分测定、含量均匀度和含量测定。四、含量测定-仪器分析法

第三十六页，共86页。（一）高效液相色谱法原理：利用青霉素类抗生素在一定条件下在反相硅胶上的保留行为的不同而实现高效分离，并与标准品相对照，而对其进行定量的一种方法。优化色谱分析条件（1）Column-CNODSC18C8-Ben（2）mobilephase/flowrate（3）columntemperature（4）detectionwavelength（5）workstationsamplepreparation第三十七页，共86页。实验注意事项（1）色谱峰要达到较好的分离－基线分离(baseseparation)（2）需要标准品对照，用外标法定量（3）可同时测定多个组分的含量（4）需要排除制剂中辅料等杂质对测定的干扰SelectivityLinearity-CalibrationcurvePrecisionandaccuracyRecoveryStability第三十八页，共86页。内标法＋校正因子外标法方法快速、高效、灵敏专属性强、重现性好一法多用（鉴别、检查、含测）特点HPLC法的定量方法和特点第三十九页，共86页。第三节氨基糖苷类抗生素

（aminoglycosidesantibiotics）【药理作用】

氨基糖苷类抗生素可起到杀菌作用，属静止期杀菌药。其杀菌作用具有如下特点：

1.杀菌作用呈浓度依赖性。

2.仅对需氧菌有效，尤其对需氧革兰氏阴性杆菌的抗菌作用强。

3.具有明显的抗生素后效应。

4.具有初次接触效应。

5.在碱性环境中抗菌活性增强。

第四十页，共86页。一、共性

1.抗菌谱相似主要抗G-杆菌，某些对铜绿假单胞菌、结核杆菌有效2.抗菌机制相似杀菌药

①多环节阻碍细菌蛋白质合成始动复合物形成肽链延伸肽链终止

②通过离子吸附作用，增加膜通透性第四十一页，共86页。3.理化性质相似

呈碱性（极性大），其盐易溶于水（脂溶性差），性质稳定。4.体内过程相似

口服难吸收，可作胃肠消毒;肌肉或静脉注射用于全身感染；蛋白结合率低，主要分布于细胞外液（胸、腹腔液及心包液浓度较高）原形经肾排泄（但肾功损害者,多次口服仍可中毒）第四十二页，共86页。化学结构都是以碱性环已多元醇为苷元，与氨基缩合而成的苷，故称为氨基糖苷类抗生素（aminoglycosidesantibiotics）。这类抗生素主要有：链霉素、庆大霉素、新霉素及巴龙霉素、硫酸奈替米星、硫酸西索米星、硫酸依替米星等，它们的抗菌谱和化学性质都有共同之处。一、化学结构与性质第四十三页，共86页。天然类链霉素(streptomycin)

庆大霉素(gentamicin)

卡那霉素(kanamycin)妥布霉素(tobramycin)

西索米星(sisomicin) 新霉素(neomycin)

小诺米星(micronomicin)大观霉素(spectinomycin)半合成类阿米卡星 (amikacin)奈替米星(netilmicin)第四十四页，共86页。1.链霉素（strepotomycin即链霉素A）的结构为一分子链霉胍和一分子链霉双糖结合而成的碱性苷。结构如下：苷元糖链霉双糖胺链霉胍+链霉糖+N-甲基-L-葡萄糖胺

（一）化学结构第四十五页，共86页。临床应用

①鼠疫、兔热病

②布氏杆菌病

③感染性心内膜炎

④抗结核’不良反应

①第八对脑神经损害

②过敏性休克

③神经肌肉阻滞

④口周、面部、四肢麻木第四十六页，共86页。巴龙霉素D-葡萄糖胺+脱氧链霉胺+D-核糖+巴龙霉糖巴龙胺苷元巴龙二糖胺糖

第四十七页，共86页。2.庆大霉素（gentamycin）是由绛红糖胺、脱氧链霉胺和加洛糖胺缩合而成的苷。它是庆大霉素C复合物，尚有少量次要成分（如庆大霉素A1、A2、A3、A4、B、B1、X……）。主要成分C1、C2、C1a及C2a的结构如下：第四十八页，共86页。庆大霉素C复合物庆大霉素C1

R=HR1、R2=CH3

庆大霉素C2

R=R2=H

R1=CH3

庆大霉素C1a

R、R1、R2=H

庆大霉素C2a

R=CH3R1=R2=H

庆大霉素C2b

R=R1=HR2=CH3第四十九页，共86页。抗菌作用

G+：金葡菌、白喉杆菌、炭疽杆菌

G-：球菌、杆菌、铜绿假单胞菌临床应用

可与羧苄西林合用

①严重G-杆菌感染

②铜绿假单胞菌感染如心内膜炎

③原因未明的G-菌混合感染

④口服用于肠道感染或术前准备不良反应

肾毒性前庭功能损害第五十页，共86页。多与硫酸成盐链霉素

3个庆大霉素5个碱性中心碱性（一）水溶性溶解性（二）（二）性质第五十一页，共86页。链霉素

pH5～7.5庆大霉素

pH2～12

稳定稳定性（四）UV（三）第五十二页，共86页。二、

鉴别

茚三酮反应（一）△羟基胺结构第五十三页，共86页。（二）Molisch反应（糖类反应）

蓝紫色庆大霉素（六碳糖）链霉素（五碳糖）α-萘酚H®¾¾+糠醛羟甲基糠醛蒽酮红紫色第五十四页，共86页。N-甲基葡萄糖胺反应（三）（Elson-Morgan反应）乙酰丙酮OH-吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛H+红色甲基葡萄糖胺庆大霉素链霉素水解-N第五十五页，共86页。链霉糖特有反应麦芽酚反应（四）

H+分子重排链霉糖链霉素¾¾®¾-OH麦芽酚紫红色¾¾¾¬+3Fe第五十六页，共86页。8-羟基喹啉α-萘酚（或α-萘酚）橙红羟基喹啉链霉胍链霉素次溴酸钠¾¾¾¾®-¾¾®¾-8OH链霉胍特有反应坂口反应（五）第五十七页，共86页。（六）硫酸盐反应（七）色谱法1．薄层色谱法：ChP、USP（25）、BP（2000）采用该法对硫酸庆大霉素、硫酸奈替米星、硫酸巴龙霉素、链霉素等进行鉴别。多以硅胶为薄层板，氯仿-甲醇-浓氨水为展开剂，茚三酮或碘蒸气为显色剂。H+白¯¾¾®¾4-24+2BaSOSOBa（八）UV法庆大霉素无UV吸收nmmax230=λ链霉素第五十八页，共86页。（八）HPLC法BP（2000）采用HPLC法鉴别庆大霉素，根据组分检查项下色谱图，比较供试液和标准品溶液的色谱图，庆大霉素C1、C2、C1a、C2a四组分的保留时间应一致。第五十九页，共86页。三、特殊杂质检查及组分分析（一）链霉素中链霉素B的检查薄层板：硅胶G薄层。展开剂：甲苯-冰醋酸-甲醇（50：25：25）方法：以D-甘露醇为对照品进行标准对照法比较斑点的颜色。（二）奈替米星中有关物质检查各国药典已对该类部分抗生素采用色谱法（HPLC或TLC法）进行有关物质的检查。如硫酸奈替米星中有关物质检查采用标准品对照法，比较斑点颜色的深浅。第六十页，共86页。（三）庆大霉素C组分测定中、英、美、日等国药典均规定控制庆大霉素中C1、C2、C1a、C2a各组分的相对百分含量。均采用HPLC法测定庆大霉素C各组分的含量。色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水-冰醋酸-甲醇（25：5：70）配制的0.02mol/L庚烷磺酸钠溶液为流动相；检测波长为330nm；理论塔板数按C2组分计算应不低于2000。C2a和C2峰的分离度应符合要求。重复进样，其相对标准差（RSD）应小于2.0%。以内标-峰面积归一化法计算各组分的相对含量。图谱第六十一页，共86页。讨论：（1）柱效：以C2峰计算，理论塔板数不得低于2000。（2）流动相：流动相极性应适当控制（适当调节甲醇比例）：极性过强，出峰快，分离不佳；流动相极性过弱，出峰太慢。（3）衍生化试剂与衍生物的稳定性；（4）离子对试剂浓度影响；(四)硫酸盐测定本类抗生素临床应用的主要为硫酸盐，各国药典规定EDTA络合滴定法测定硫酸盐，作为组分分析。

第六十二页，共86页。四、含量测定本类抗生素的效价测定目前各国药典主要采用微生物检定法。近年来国内外又有各种免疫法、色谱法等定量分析方法。由于本类抗生素多数无紫外吸收，不能直接用紫外或荧光检测器，需进行柱前或柱后衍生化，采用的衍生化试剂有邻苯二醛、1、2-萘醌-4-磺酸、2、4、6-三硝基磺酸、1-氟-2、4-二硝基苯、9-芴甲基氯甲酸酯、茚三酮等。第六十三页，共86页。示例猪组织中庆大霉素和新霉素的HPLC法 色谱条件：HypersilBDSC18分析柱；乙腈-水（85：15）为流动相；流速1.0ml/min；荧光检测器，λex=260nm，λem=315nm。样品处理：取样品（肝、肾、肌肉）适量，加磷酸盐缓冲液（Ph=7.4），室温孵育1h，然后加

三氯乙酸，匀浆30s，于4℃下离心（3500r/min）15min，将上清液移置另一试管中，加离子对试剂（已烷磺酸钠溶液）。再经固相柱提取纯化，用乙腈-0.02mol/L已烷磺酸钠（55：45）洗脱。洗脱液与9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC-Cl）混合，进行衍生化反应，15min后加甘氨酸中止反应，取适量进样测定。图谱第六十四页，共86页。结果与讨论：用FMOC-Cl衍生化可获得强荧光的衍生物，在pH8.0的条件下反应，衍生物可稳定在12h。见图11-7。测得庆大霉素各组分和新霉素的提取回收率在75%-86%之间；日内、日间RSD小于10%；检测限分别为0.05μg/g和0.1μg/g（S/N=5）；定量限为检测限2倍。在0.1μg/g-1.0μg/g范围内，被测组分浓度与响应值之间呈良好的线性关系，r>0.999。第六十五页，共86页。第四节四环素类抗生素

（tetracyclinesantibiotics）这类抗生素有四个环构成，故统称为四环素类抗生素。一、化学结构与性质结构中各取代基R、R′、R″及R的不同构成各种四环素类抗生素。常见结构如下：第六十六页，共86页。2．性质（1）酸碱性与溶解度：显弱碱性和显弱酸性，是两性化合物。（2）旋光性：具有不对称碳原子，因此有旋光性；（3）紫外吸收和荧光性质：（4）与金属离子形成配位化合物：（5）稳定性：四环素类抗生素对各种氧化剂（包括空气中氧在内）、酸、碱都是不稳定的。本类抗生素具有氢化骈四苯的共同基本母核，均是化学两性物质，可与酸、碱成盐，但在碱性水溶液易降解，在酸性水溶液稳定，一般以盐酸盐应用于临床。第六十七页，共86页。A差向异构化性质：四环素类抗生素在弱酸性（pH2.0-6.0）溶液中会发生差向异构化。差向四环素四环素第六十八页，共86页。B降解性质：酸性降解，在酸性条件下（pH<2）生成脱水四环素（anhydrotetracycline，ATC）。反应式如下：四环素脱水四环素第六十九页，共86页。碱性降解：在碱性溶液中生成无活性的异构体。反应如下：异四环素类抗生素四环素类抗生素第七十页，共86页。二、鉴别试验

1．浓硫酸反应；2．三氯化铁反应；3．薄层色谱法：应用示例盐酸土霉素的鉴别薄层板的制备：硅藻土EDTA-2Na溶液-甘油（95：5）为粘合剂；展开剂：取4%EDTA-2Na溶液（pH7.0）5ml，加至醋酸乙酯-氯仿-丙酮（2：2：1）200ml中为展开剂，展开后，氨薰后，置紫外光灯下（365nm）下检视。

第七十一页，共86页。4．HPLC法：ChP和USP（25）采用HPLC法鉴别盐酸土霉素、盐酸四环素、盐酸多西霉素、盐酸金霉素等。在含量测定项下记录的色谱图中，供试品主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致。第七十二页，共86页。三、特殊杂质检查1．有关物质：四环素类中的有关物质主要是异构体杂质、降解杂质（ETC、ATC、EATC）等。2．杂质吸收度：如ChP规定的盐酸四环素的杂质吸收度测定方法如下：取本品加0.8%氢氧化钠溶液制成每1ml中含10mg的溶液，照分光光度法，置4cm的吸收池中，在530nm的波长下测定，自加0.8%氢氧化钠溶液起5min，其吸收度不得过0.12（供注射用）。第七十三页，共86页。四、含量测定四环素类抗生素的含量测定，目前各国药典多采用HPLC法。示例：盐酸四环素的含量测定方法：色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基键合硅胶为填充柱（pH值适应范围大于8.0）；0.1mol/L草酸铵溶液-二甲基甲酰胺-0.2mol/L磷酸氢二铵溶液（68：27：5），用氨试液调节pH至8.3为流动相；流速1ml/min；柱温35℃；检测波长为280nm。取盐酸四环素及有关物质的混合溶液20μl，注入液相色谱仪测定，4-