分子生物学教案

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《分子生物学》教案

一、课程性质必修课二、教学目的要求

分子生物学是一门近年来发展迅速并且在生命科学领域里应用越来越广泛、影响越来越深远的一个学科。从学科角度来讲，分子生物学函盖面十分广，与生物化学和细胞生物学等生命科学主干课程有一些交织。在学习本课程之前，要求学生已把握了必要的数、理、化知识，并学习了植物学、动物学、微生物学与生物化学等基础课程。

通过对本课程的学习，使学生把握基因概念在分子水平上的发展与蜕变、基因的分子结构和特点、基因的复制、基因表达（在转录、翻译水平）的基本原理、基因表达调控的基本模式、基因发生突变与交换及DNA遗传多型性检测的分子生物学原理，了解新兴起的基因组学和后基因组学研究现状。通过与试验课相结合，系统地介绍与基因克隆相关的DNA技术，使学生们把握一些基本的分子生物学技术。

三、教材及有关参考书

朱玉贤等，《现代分子生物学》高等教育出版社，2023

BenjaminLewin编著余龙等主译，《GeneⅧ》科学出版社，2023赵寿元等，《现代遗传学》高等教育出版社，2023孙乃恩等，《分子遗传学》南京大学出版社，1990四、适用专业

生物科学、生物技术、生物工程、科学教育等专业五、授课学时36学时六、课程内容

第一章绪论

教学目的：使学生对分子生物学的发展简史、分子生物学的研究内容及发展前景有较全面的了解。

教学重点、难点：基因概念的发展与蜕变；对现代遗传学各发展阶段的认识。课时安排：4学时教学内容：一、

什么是分子生物学？

分子生物学是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学。

二、

分子生物学的发展简史

从1847年Schleiden和Schwann提出\细胞学说\，证明动、植物都是由细胞组成的到今天，虽然不过短短一百多年时间，我们对生物大分子--细胞的化学组成却有了深刻的认识。孟德尔的遗传学规律最先使人们对性状遗传产生了理性认识，而Morgan的基因学说则进一步将\性状\与\基因\相耦联，成为分子遗传学的奠基石。Watson和Crick所提出的脱氧核糖酸双螺旋模型，为充分透露遗传信息的传递规律铺平了道路。在蛋白质化学方面，继Sumner在1936年证明酶是蛋白质之后，Sanger利用纸电泳及层析技术于1953年首次说明胰岛素的一级结构，开创了蛋白质序列分析的先河。而Kendrew和Perutz利用X射线衍射技术解析了肌红蛋白（myoglobin）及血红蛋白（hemoglobin）的三维结构，论证了这些蛋白质在输送分子氧过程中的特别作用，成为研究生物大分子空间立体构型的先驱。

总结与分子生物学相关的诺贝尔奖。三、分子生物学的主要研究内容1．DNA重组技术基因工程

基因工程指将不同DNA片段（如某个基因或基因的一部分）依照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。

DNA重组技术有着广阔的应用前景：

①在生物技术制药领域中的应用。如：利用基因工程技术改造传统的制药工业；利用克隆的基因表达生产有用的肽类和蛋白质药物或疫苗。

②定向改造某些生物的基因组结构，使它们具备某些特别的经济价值。③在基础研究中的应用。如：基因的克隆与分析；启动子分析。2．基因表达调控

由于蛋白质分子参与并控制了细胞的一切代谢活动，而决定蛋白质结构和合成时序的信息都由核酸（主要是脱氧核糖核酸）分子编码，表现为特定的核苷酸序列，所以基因表达实质上就是遗传信息的转录和翻译。在个体生长发育过程中生物遗传信息的表达按一定的时序发生变化（时序调理），并随着内外环境的变化而不断加以修正（环境调控）。

原核生物的基因组和染色体结构都比真核生物简单，转录和翻译在同一时间和空间内发生，基因表达的调控主要发生在转录水平。真核生物有细胞核结构，转录和翻译过程在时间和空间上都被分隔开，且在转录和翻译后都有繁杂的信息加工过程，其基因表达的调控可以发生在各种不同的水平上。基因表达调控主要表现在信号传导研究、转录因子研究及RNA剪辑3个方面。

3．生物大分子结构功能结构分子生物学

生物大分子的结构功能研究（又称结构分子生物学）一个生物大分子，无论是核酸、蛋白质或多糖，在发挥生物学功能时，必需具备两个前提:首先，它拥有特定的空间结构（三维结构）；其次，在它发挥生物学功能的过程中必定存在着结构和构象的变化。

结构分子生物学就是研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。它包括结构的测定、结构运动变化规律的摸索及结构与功能相互关系的建立3个主要研究方向。最常见的研究三维结构及其运动规律的手段是X射线衍射的晶体学（又称蛋白质晶体学），其次是用二维核磁共振和多维核磁研究液相结构，也有人用电镜三维重组、电子衍射、中子衍射和各种频谱学方法研究生物高分子的空间结构。

4．功能基因组学与生物信息学研究

先后完成了包括从大肠杆菌、酿酒酵母到线虫等十余种模式生物基因组全序列的测定工作，并于2023年2月12日完成人类基因组测序工作。世界两大最著名的学术刊物－nature和science同时发表了人类基因组全序列。

基因组测序工作的进展是十分令人昂扬的。但是也随之产生了新问题。大

量涌出的新基因数据迫使我们不得不考虑这些基因编码的蛋白质有什么功能这个问题。在这些基因组中寻常有一半以上基因的功能是未知的。因此读懂基因组称为后基因组时代的生命科学领域面临的巨大的挑战。

在功能基因组时代，应用生物信息学方法，高通量地解释基因组所有编码产物的生物学功能是一个重要的特征。生物信息学是在各种“组学〞研究的推动下发展起来的.传统的研究方法是只研究某一个基因或蛋白质或转录产物，而“组学“的研究是采用高通量的技术分析细胞中全部的基因和蛋白质，这样势必会产生海量的信息，因此，人们必需寻求一种高速度、高效率、大规模的方式积累数据处理分析方法。

四、分子生物学展望未来的发展方向：

不同模式生物基因调控网络的比较分析；RNA介导的基因表达调控网络；表观遗传（epigenetic）信息的整合；从数据整合到系统生物学（systemsbiology）。

其次章遗传的物质基础－DNA

教学目的：使学生了解并把握DNA的结构与功能

教学重点、难点：DNA的一级结构的测定，DNA的二级结构及超螺旋结构。课时安排：4学时教学内容：

第一节DNA的一级结构

一、一级结构的构成

所谓DNA的一级结构，就是指4种核苷酸的连接及其排列顺序，表示了该DNA分子的化学构成。核苷酸序列对DNA高级结构的形成有很大影响，如B-DNA中多聚（G-C）区易出现左手螺旋DNA（Z-DNA），而反向重复的DNA片段易出现发卡式结构等。

二、

一级结构的序列测定

目前所用的DNA测序方法是在末端终止法的基础上发展起来的。由英国科学家Sanger提出的。Sanger在生物大分子的序列测定方面做出了优良贡献。他曾在1953年利用小片段重迭法成功测定了胰岛素51个氨基酸序列，并获得诺贝尔奖。1977年又利用末端终止法测定了?X174噬菌体得DNA序列，其次次获得诺贝尔奖。

末端终止法又称为双脱氧法，基本原理是模拟体内DNA的复制过程在体外合成DNA，通过测定DNA片段的相对长度来推断核苷酸序列。

至于成分大家不要死记，可以回忆一下DNA复制过程需要哪几种组分：模板、dNTP、引物、DNA聚合酶，其中一种dNTP的磷酸基团用P32标记。除此之外还需要每个管中分别参与一种ddNTP。DDNTP是双脱氧核苷酸，由于在3?位上缺少-OH，无法与下一个单体之间形成磷酸二酯键，因此，一旦掺入DNA链的延伸后，便终止DNA的合成这样，在DNA聚合酶的作用下核苷酸链不断延伸，我们可以调整dNTP和ddNTP的浓度，使ddNTP在每个位置上都有一个掺入的机遇。每个管都会产生一系列长短不一的DNA片段，其共同特征是末端的最终一个碱基是一致的。我们将所得的所有DNA片段进行凝胶电泳，长度不同，泳动的速度不同。8%-20%的聚丙烯酰胺可将相差一个碱基的DNA片段区

分开，由于dCTP是放射性标记的，我们将凝胶放射自显影后，有DNA片段的位置就会显示出相应的信号带。自下而上依次将碱基序列读出。

其次节DNA的二级结构

一、二级结构的特点

DNA不仅具有严格的化学组成，还具有特别的高级结构，它主要以有规则的双螺旋形式存在，其基本特点是：

1、DNA分子是由两条相互平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的；

2、DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在内侧；

3、两条链上的碱基通过氢键相结合，形成碱基对，它的组成有一定的规律。这就是嘌呤与嘧啶配对，而且腺嘌呤（A）只能与胸腺嘧啶（T）配对，鸟嘌呤（G）只能与胞嘧啶（C）配对。如一条链上某一碱基是C，另一条链上与它配对的碱基必定是G。碱基之间的这种一一对应的关系叫碱基互补配对原则。组成DNA分子的碱基虽然只有4种，它们的配对方式也只有A与T，C与G两种，但是，由于碱基可以任何顺序排列，构成了DNA分子的多样性。例如，某DNA分子的一条多核苷酸链有100个不同的碱基组成，它们的可能排列方式就是4100。二、变性、复性及杂交

变性：指双螺旋区氢键断裂，空间结构破坏，只涉及次级键的破坏。常用的DNA变性方法：热变性和用变性剂处理。

如何判断DNA是否发生变性了呢？常用的方法是测定DNA的光吸收值。在碱基的嘌呤环和嘧啶环中存在共扼双键，在240－290nm波长有一猛烈的吸收峰，最大吸收值在260nm。（蛋白质由于存在肽键，在280nm有明显的吸收峰）当DNA变性时，有序的碱基排列被破坏，光吸收值显著增加，该现象称为增色效应。当缓慢增加DNA溶液的温度时，记录不同温度下的A260的数值，即绘制成DNA的变性曲线。以温度为横坐标，以A260为纵坐标。当A260增加到最大值的一半时，这时的温度称为DNA的溶解温度或熔点，Tm表示。

除此之外，光吸收法也是试验室定量测定DNA和RNA浓度和纯度的一种方法。从某种样品中提取了基因组DNA，可根据A260/A280的比值判断其纯度。

复性：变性核酸的互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋的过程。

杂交：在退火条件下，带有互补核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的互补区段会形成双链结构。分子杂交是分子生物学常用的技术，可用来检测某一特定基因的时空表达状况和在基因组中的。

分子杂交最初是由Southern设计出来的。当时是用DNA探针检测的DNA，也就是DNA与DNA的杂交，人们就将这种方法称为是Southernblotting。在此基础上，人们设计出DNA探针检测RNA，称为Northernblotting。

基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法（southern、northern）是一致的，都是探针和互补的靶基因结合，通过随后的信号检测进行定性与定量分析。基因芯片（DNAmicroarray）指将N个目的DNA用自动化设备点在固体支持物上，DNA经固化后，用不同颜色的荧光标记的探针对这些DNA同时进行杂交，根据杂交结果浮现的不同颜色，经计算机分析后得到关于N个基因表达状况的数据。

第三节DNA的高级结构

一、

超螺旋结构及拓扑异构体

双螺旋DNA进一步扭曲盘绕则形成其三级结构，超螺旋是DNA三级结构的主要形式。自从1965年Vinograd等人发现多瘤病毒的环形DNA的超螺旋以来，现已知道绝大多数原核生物都是共价封闭环(covalentlyclosedcircle,CCC)分子，这种双螺旋环状分子再度螺旋化成为超螺旋结构(superhelix或supercoil)。有些单链环形染色体(如φ×174)或双链线形染色体(如噬菌体入)，在其生活周期的某一阶段，也必将其染色体变为超螺旋形式。对于真核生物来说，虽然其染色体多为线形分子但其DNA均与蛋白质相结合，两个结合点之间的DNA形成一个突环(loop)结构，类似于CCC分子，同样具有超螺旋形式。超螺旋按其方向分为正超螺旋和负超螺旋两种。真核生物中，DNA与组蛋白八聚体形成核小体结构时，存在着负超螺旋。研究发现，所有的DNA超螺旋都是由DNA拓扑异构酶产生的。

二、

拓扑异构变化的生物学意义

DNA拓扑异构的变化是DNA的复制和转录过程所必需的。

一个闭合的DNA分子可以用其连环数进行描述，连环数(Linkingnumber)

是指一条链空间跨越另一条链的次数。顺序一致的闭合DNA分子可能有不同的连环数，这反映了超螺旋程度的差异。连环数不同的一致DNA分子称为拓扑异构体(Topologicalisomers)。

连环数由两个成分组成：缠绕数(Writhingnumber,W)和扭转数(Twistingnumber,T)。扭转数T是双链螺旋结构自身的一种性质，代表一条链绕另一条链旋转的双螺旋总圈数。它由每一圈配对的碱基数决定。对于平放在平面上的一个松弛的闭合环状DNA来说，用碱基对的总数除以每一圈的碱基对数就是它的扭转数。

缠绕数W代表双螺旋轴在空间上的弯曲，在直观上与超螺旋的概念相对应，但并非具有完全一致的数量上的定义或衡量。对于一个松弛分子，W=0时连环数等于扭转数。我们经常用下面的公式计算连环数的变化量：

ΔL=ΔW+ΔT

第三章染色体和基因

教学目的：使学生把握基因组的概念、原核生物基因组的特点和真核生物染色体及基因组特点。

教学重点、难点：真核生物染色体的基本特征；卫星DNA及在分子标记中的应用；断裂基因；基因家族及串连重复基因簇。

课时安排：4学时教学内容：

第一节基因组大小与C值矛盾

一、基因组概念

一个物种单倍体的染色体的数目，称为基因组。基因组中DNA的总量是物种所特有的，称为C值(C-value)。C值的范围变化很大，从微生物中的1011。图3.1总结了进化中不同门类生物的C值范围。随着繁杂度增加，每组中最小基因组大小也会随着增加。

三、

C值矛盾现象

单倍体基因组DNA含量在低等真核生物中与形态繁杂性有一定的正相关，但在高等真核生物中却非如此，它们的单倍体基因组DNA含量变化不定。基因组大小与遗传繁杂性并非线性相关，称为C值矛盾(Paradox)。它涉及到真核基因组绝对和相对的DNA数量。例如，蟾蜍Xenopus和人类基因组大小差不多，但是人类遗传发育上更为繁杂。在表面繁杂程度相像的种属间(见图)也存在C值矛盾，这个问题局限于一些种族内，昆虫、两栖和植物最为明显。在两栖中，最小的基因组

着丝粒的DNA顺序称为CEN顺序。CEN区域中存在三种类型的序列元件(图)：CDE-Ⅰ是所有中心粒左侧边界变化很少的9bp保守序列。CDE-Ⅱ是所有中心粒中都存在的A?T比例大于90%的80-90bp长序列，其功能依靠于其长度而非确凿序列，其成份是一些真核生物中短的随机重复(卫星)DNA序列的遗迹，其碱基成分可能产生一些DNA双螺旋结构上的特征性的弯曲。CDE-Ⅲ是所有中心粒右侧边界的11bp长的高度保守序列，此类元件的两侧序列保守性较低，对于中心粒功能可能是必需的(CDE-Ⅲ在侧翼序列必需的状况下可能长于11bp)。2．端粒

通过断裂产生的染色体末端，会与其它染色体发生作用，然而自然染色体是稳定的，因此，染色体末端一定具有某种特别结构，可以稳定染色体，该结构称为端粒。

我们可以用两特性质来定义端粒序列：必需存在于染色体的端部(或至少在线性DNA分子的末端)；它必需赋予线性分子稳定性。

大量低等真核生物基因组中的线性DNA分子，其端粒结构都是已知的。同样类型的序列也在植物和人类中发现，所以端粒的构建似乎遵循着普遍的规律。每个端粒由一系列短的随机重复序列组成。所有端粒序列能写成Cn(A/T)m的一般形式，其中n>1而m为1-4；3?端具有单链尾，且富含GT。

端粒一方面可保护线性DNA免受核酸酶攻击，另一方面，利用用从头合成的方式参与重复，能抵消在染色体端部无法复制所导致的重复丢失。探讨端粒与寿命的关系。

第四节真核生物的基因

一、

真核生物基因组中包含非重复序列和重复序列

1．重复序列在单倍体基因组里，这些序列一般只有一个或几个拷贝，它占DNA总量的40%－80%。多为结构基因。

2．中度重复序列这类重复序列的重复次数在10－104之间，占总DNA的10%－40%。各种rRNA、tRNA及组蛋白基因等都属这一类。该类基因一般不编码。3．高度重复序列——卫星DNA这类DNA只在真核生物中发现，占基因组的10%—60%，由6—100个碱基组成，在DNA链上串联重复几百万次。由于碱基

的组成不同，在CsCl密度梯度离心中易与其他DNA分开，形成含量较大的主峰及高度重复序列小峰，后者又称卫星区带（峰）。该类基因一般不转录。

小卫星和微卫星序列是由比卫星序列的重复序列单位更短的单位构成，其重复单位的长度分别为10~100bp和10bp，而重复序列单位的数目寻常为5~50个，不同个体间重复序列单位数目变化很大。

在人类中小卫星位点是1－5kb的顺序，此顺序由长15-100nt的重复单位组成。当将人类的总DNA提出后，用限制性内切酶切成不同长度的片断（各种小卫星上都没有酶切位点），然后以小卫星DNA中的特异顺序为探针进行Southern杂交，可发现阳性片断的长度各不一致。由于不同个体的这种串联重复的数目和位置都不一致，所以小卫星DNA的Southern杂交带谱就具有高度的个体特异性，人们就称其为DNA指纹分析技术（DNAfingerprints）。

二、

断裂基因

大多数真核生物的基因（包括编码蛋白质、rRNA、tRNA的基因）由间隔的外显子（表现在最终RNA产物中的序列）和内含子（从初始转录物中去除的序列）组成。

“一条基因，一种蛋白质〞应修正为“一种蛋白质，一条基因〞。由于一些DNA序列编码一种以上蛋白质。

三、

基因家族与基因簇

真核生物的基因组中有大量来源一致、结构相像、功能相关的基因，这样一组基因称为基因家族（genefamily）。

同一基因家族的不同成员紧凑排列在一起，称为基因簇（genecluster）。但更多状况下是散布在不同染色体上。如：珠蛋白基因α、β、γ、δ。同一家族成员是由同一个祖先基因经过复制和变异传递下来的。

四、

串连重复基因簇

串连重复基因出现在其产物被极度需要的状况下，如组蛋白基因、rRNA基因和tRNA基因。如：组蛋白基因，编码H1/H2A/H2B/H3/H4五种组蛋白的基因彼此靠近构成一个重复单位，这样的重复单位串连在一起。rRNA基因，真核生物中的5.8S/18S/28SrRNA（主体rRNA）基因组成重复单位，转录出一个45S

rRNA前体，然后通过转录后处理。此外，还有，tRNA基因也是串连重复排列，但各重复单位中的各tRNA可以不同。

五、

假基因

基因组中因突变而失活的基因，它和同一家族的活跃基因在结构和DNA序列上有相像性。

第三章DNA复制

教学目的：使学生把握DNA复制的机理及一般过程、复制的各阶段的主要生物学事件、复制的方式、复制的调控、DNA修复系统。

教学重点、难点：复制的机理；复制的起始；端粒的复制。课时安排：6学时教学内容：

第一节DNA复制的机理及一般过程

一、半保存复制

半保存复制：Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型时即推测，DNA在复制时首先两条链之间的氢键断裂两条链分开，然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的DNA链，这样新合成的子代DNA分子中一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式为半保存复制。

1957年，梅塞尔和斯塔尔利用大肠杆菌（E．Coli）研究遗传物质DNA。在这项经典试验中，他们先将大肠杆菌放入只含有既氮15（氮14的同位素）的营养基中培养，然后将这些大肠杆菌转移到只含氮14的营养基中。提取不同培养代数细菌的DNA，用CsCl密度梯度离心。试验结果说明：在全部由15N标记的培养基中得到的15N-DNA显示为一条重密度带位于离心管的管底。当转入14N标记的培养基中繁殖后第一代，得到了一条中密度带，这是15N-DNA和14N-DNA的杂交分子。其次代有中密度带及低密度带两个区带，这说明它们分别为15N14N－DNA和14N14N-DNA。随着以后在14N培养基中培养代数的增加，低密度带加强，而中密度带逐渐减弱，离心终止后，从管底到管口，CsCl溶液密度分布从高到低形成密度梯度，不同重量的DNA分子就停留在与其相当的CsCl密度处，在紫外光下可以看到DNA分子形成的区带。为了证明第一代杂交分子确实是一半15N-DNA－半14N－DNA，将这种杂交分子经加热变性，对于变性前后的DNA分别进行CsCl密度梯度离心，结果变性前的杂交分子为一条中密度带，变性后则分为两条区带，即重密度带(15N－DNA)及低密度带(14N－DNA)。它们的试验只有用半保存复制的理论才能得到圆满的解释。

二、

半不连续复制

DNA双螺旋的两条链是反向平行的，因此，在复制起点处两条DNA链解开

成单链时，一条是5'→3'方向，另一条是3'→5'方向。当以这两条链为模板时，新生链延伸方向一条为3'→5'，另一条为5'→3'。但生物细胞内所有催化DNA聚合酶都只能催化5'→3'延伸，这是一个矛盾。冈崎片段(Okaxakifragments)的发现使这个矛盾得以解决。在复制起点两条链解开形成复制泡(replicationbubbles)，DNA向两侧复制形成两个复制叉(replicationforks)。以复制叉移动的方向为基准，一条模板链是3'→5'，以此为模板而进行的新生DNA链的合成沿5'→3'方向连续进行，这条链称为前导链(leadingstrand)。另一条模板链的方向为5'→'3'，以此为模板的DNA合成也是沿5'→3'方向进行，但与复制叉前进的方向相反，而且是分段，不连续合成的，这条链称为滞后链(laggingstrand)，合成的片段即为冈崎片段。这些冈崎片段以后由DNA连接酶连成完整的DNA链。这种前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物是普遍存在的，称为DNA合成的半不连续复制。

其次节复制的过程

复制的过程总的说来包括起始、延伸和终止三个阶段。一、复制的起始

1．复制的起始原点好多试验都证明：复制是从DNA分子上的特定部位开始的，这一部位叫做复制起始点(originofreplication)常用ori或O表示。细胞中的DNA复制一经开始就会连续复制下去，直至完成细胞中全部基因组DNA的复制。DNA复制从起始点开始直到终点为止，每个这样的DNA单位称为复制子或复制单元(replicon)。在原核细胞中，每个DNA分子只有一个复制起始点，因而只有一个复制子，而在真核生物中，DNA的复制是从大量起始点同时开始的，所以每个DNA分子上有大量个复制子。

DNA复制起始点有结构上的特别性，例如：大肠杆菌染色体DNA复制起始点Oric由422个核苷酸组成，是一系列对称排列的反向重复序列，即回文结构(palindrome)，其中有9个核苷酸或13个核苷酸组成的保守序列，这些部位是大肠杆菌中DnaA蛋白识别的位置，大肠杆菌染色体DNA是环状双链DNA，它的复制是典型的“ζ〞型复制(由于形状像希腊字母ζ，见下图)。从一个起点开始，同时向两个方向进行复制，当两个复制方向相遇时，复制就中止。而有些生物的DNA复制起始区是一段富含A·T的区段。这些特别的结构对于在DNA复制起

始过程中参与的酶和大量蛋白质分子的识别和结合都是必需的。

2．复制的方向

3．DNA复制起始引发体的形成及所参与的酶和蛋白质

解链酶：DNA开始复制时首先在起始点处解开双链，反应是在一种解链酶(helicase)的催化下进行的。解链酶需要ATP分解供给能量。大肠杆菌中DnaB蛋白就有介链酶活性，与随从链的模板DNA结合，沿5'→3'方向移动，还有一种叫做Rep蛋白和前导链的模板DNA结合沿3'→5'方向移动。解链酶的作用就是开启DNA双链之间的氢键。

单链结合蛋白质：它与解开的单链DNA结合，使其稳定不会再度螺旋化并且避免核酸内切酶对单链DNA的水解，保证了单链DNA做为模板时的伸展状态，SSBP可以重复利用。

DNA复制起始的关健步骤是前导链DNA的合成，一旦前导链DNA的聚合作用开始，随从链DNA的合成也随着开始。由于前导链的合成是连续进行的，所以它的起始相对简单，而随从链的合成是不连续进行的，所以引发阶段比较繁杂。大肠杆菌的引发前体由DnaB.DnaC和单链结合蛋白组成。

引物酶

是一种特别的RNA聚合酶，可催化短片段RNA的合成。

这种短RNA片段一般十几个至数十个核苷酸不等，它们在DNA复制起始处做为引物。RNA引物的3'-OH末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一个磷酸二酯键的位置。高度解链的模板DNA与多种蛋白质因子形成的引发前体促进引物酶结合上来，共同形成引发体，引发体主要在DNA随从链上开始，它连续地与引物酶结合并解离，从而在不同部位引导引物酶催化合成RNA引物，在引物RNA的3'-OH末端接下去合成DNA片段，这就是随从链不连续合成的开始。

二、DNA的延伸

由DNA聚合酶催化完成。1957年，Arthurkornberg首次在大肠杆菌中发现DNA聚合酶Ⅰ，(DNApolymeraseⅠ,简写DNApolⅠ)后来又相继发现了DNA聚合酶Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ，其中主要的复制酶是DNA聚合酶Ⅲ。当聚合酶的一个亚基连续合成先导链时，另一个亚基在模板链所形成的大单链环中，循环式起始、终止后随链上冈崎片段的合成。真核生物的NA聚合酶可分为复制所需的

酶如：α、δ、ε、γ和损伤修复所需的酶β、δ、ε、η、θ，其中，DNA聚合酶α起始DNA链的合成，DNA聚合酶δ延伸先导链，另一个DNA聚合酶δ或ε延伸后随链。DNA聚合酶γ负责线粒体DNA的复制。

真核生物线性DNA末端的端粒是怎样合成的呢？四膜虫抽提物中有一种酶，称端粒酶(Telomerase)，它使用端粒链的G+T的3?-OH作为引物合成随机的TTGGGG重复。此反应只需要dGTP与dTTP。端粒酶是一个大的核糖核蛋白，它含有一个短RNA组分，四膜虫中长159nt而在Euplotes中长192nt。每个RNA都含有一个15-22nt的序列和一个富含C的重复序列的重复一致。这种RNA为合成富含G的重复序列提供模板。

三、复制的终止

当子链延伸达到terminusregion（ter，带有多个20bp序列）时，DNA复制就终止了。Ter有点像一个陷井（trap），使复制叉只能进入，不能出来。Ter的功能主要是由Ter-Tus复合物（terutilizationsubstance）来完成的。

第三节复制的方式

一、线状DNA的复制方式1．中间起始：如前所述.

2．末端起始：腺病毒的形态是特征性的二十面体病毒壳体，腺病毒基因组是一个线性的双链DNA，其5’端与一种末端蛋白（TP）共价结合（Rekoshetal.,1977），5’端上还具有末端反向重复序列（ITRs）。

在腺病毒的每个5?末端都共价连接一个55Kda的蛋白质，该蛋白质称为末端蛋白质（terminalproteinTP），以其丝氨酸羟基通过磷酸二酯键与5?端的胞嘧啶共价连接。TPC核苷酸的自由末端3-OH通过DNA聚合酶引导延伸反应。这就产生了一条新链，其5‘末端与起始核苷酸C共价相连。

二、环状DNA的复制方式

1．?复制：具有双链环状DNA分子的细菌和病毒所采用的复制方式。DNA在复制原点解开成单链状态，分别作为模板，合成其互补链，则出现两个叉子状的生长点，叫做复制叉，因此也称为复制叉式复制。可双向or单向，若是双向，可等速or不等速。

2．滚环复制：随后缺口产生的自由3’-OH末端被聚合酶延伸。新合成的链取代

原母链。这种结构被称为滚环，由于延伸点围绕环形模板链滚动，形成一个多聚单链的尾巴。当这条链甩到一定程度时开始以半不连续的方式合成其互补链。

滚环复制在噬菌体中普遍存在。例如：噬菌体φX174含有单链环形DNA，称为正（+）链。在复制前首要合成其互补链即负（-）链，产生了双链环形DNA分子，以滚环方式复制。

噬菌体的基因组编码的A蛋白结合在复制原点，在正链上产生切断磷酸二酯键。切割后A蛋白依旧与5’末端相连，而3’末端则在DNA聚合酶的作用下延伸。SSB蛋白不断地结合到甩出的单链上，并改变其构型，趋向环化。当被置换链达到一个单位长度时，A蛋白可识别复制原点，将链切断，进一步将切下的单位的长度的DNA环化。A蛋白释放，开始另一循环。环化后被取代的正（＋）链可以作为模板合成互补负（—）链或被包裹到病毒体中。

另外，滚环复制为基因扩增提供了一种方式。见《分子遗传学》P109-110。3．D环复制：

真核生物线粒体DNA的复制方式。线粒体的H和L链上各有一个复制原点，在复制开始时，H链起始位点的复制像寻常一样通过转录激活过程。RNA聚合酶转录出的RNA可作为引物，再由DNA聚合酶在引物的3’末端进行DNA聚合反应。随着链的延伸，新合成的L链取代了亲本L链，而产生一个替换环，称为D环。D环不断伸展，当伸展到环三分之二处时，被取代的L链上的复制起始点暴露出来，随后由特异的引发酶在该位点合成一段RNA引物，开始H链的复制。由于启动的延迟，当新L链合成终止时，新H链合成仅绕环三分之一圈。这样就释放出一个完整的双链环和一个开环结构。

第四节复制的调控

一、原核生物复制的调控

原核生物复制的起始主要是由起始位点的甲基化状态来控制的。起始位点的A可被Dam甲基化酶所甲基化。在复制之前，起始位点的两条链都被甲基化，而复制后产生的DNA是半甲基化的。半甲基化的子链起始点只有在它们重新全部甲基化后才有起始功能。

二、真核生物复制的调控

在真核生物中，DNA的复制同样受到细胞周期的严格控制。在每一个起始点都需要执照因子来起始复制。执照因子是一种特别的蛋白质，不能随意的穿越核膜。它在复制之前就已存在于细胞核中，一轮复制就会将这个因子失活或破坏。而细胞质中的执照因子也不能进入，因此DNA的复制不会被重复起始。只有在细胞发生有丝分裂期间，核膜发生破碎，执照因子才趁机进入核内，DNA的复制才可被起始。这样，就保证了复制的起始必需在经历整个细胞分裂过程之后才能重新发生。

第五节DNA的修复系统

一、复制修复

1、错配修复系统：错配矫正酶、PolⅠ、DNA连接酶

2、尿嘧啶糖基酶系统：尿嘧啶－N－糖基酶、AP内切酶、PolⅠ、DNA连接酶

二、损伤修复

1、光复活：在可见光的活化之下由光复活酶催化胸腺嘧啶二聚体分解成单体的过程。

2、切除修复：修复内切酶能识别引起DNA双螺旋变性的损伤，由UvrA、UvrB和UvrC三种亚基构成

3、重组修复：RecA具有催化DNA分子之间同源联会和交换单链的功能。

4、SOS修复：允许新生的DNA链越过TT二聚体而生长，其代价时保真度极大降低。SOS修复是导致突变的修复,它的介入时紫外线诱导突变的主要原因。

第五章转录

教学目的：使学生把握RNA合成的酶学特征、启动子的结构、转录的过程、转录后加工过程及逆转录。

教学重点、难点：启动子结构；RNA的剪接；核酶。课时安排：6学时教学内容：

第一节RNA合成的酶学

执行生命功能、表现生命特征的主要物质是蛋白质分子。DNA贮存着决定生物特征的遗传信息，只有通过蛋白质才能表达出它的生命意义，直接决定蛋白质合成及蛋白质特征的不是RNA而是DNA，因而人们确定DNA是遗传信息贮存者后就推测DNA是通过RNA去决定蛋白质合成的。50年代末RNA聚合酶的发现开始证明白这一推测。

以DNA为模板合成RNA的过程称为转录（transcription），由RNA聚合酶催化完成。

一、RNA合成的基本特征

RNA的转录合成从化学角度来讲类似于DNA的复制，多核苷酸链的合成都是以5'→3'的方向，在3'-OH末端与参与的核苷酸磷酸二酯键，但是，由于复制和转录的目的不同，转录又具有其特点：（1）对于一个基因组来说，转录只发生在一部分基因，而且每个基因的转录都受到相对独立的控制；（2）转录是不对称的；（3）转录时不需要引物，而且RNA链的合成是连续的；（4）都以四种三磷酸核苷的底物；（4）RNA聚合酶缺乏3'→5'外切酶活性，所以没有校正功能。

二、原核生物的RNA聚合酶

大肠杆菌RNA聚合酶的研究得比较透彻的，这是一个分子量达50多万，全酶由五咱亚基组成，去掉δ亚基的部分称为核心酶，核心酶本身就能催化苷酸间磷酸二酸键形成。利福平和利福霉素能结合在β亚基上而对此酶发生猛烈的抑制作用。β亚基似乎是酶和核苷酸底物结合的部位。细胞内转录是在DNA特定的起始点上开始的，δ亚基的功能是鉴别转录起始点的。β'亚基是酶与DNA模板结合的主要成分。α亚基可能与转录基因的类型和种类有关。

二、真核生物的RNA聚合酶

真核生物中已发现有四种RNA聚合酶，分别称为RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和线粒体RNA聚合酶，分子量大致都在50万道尔顿左右，它们专一性地转录不同的基因，因此由它们催化的转录产物也各不一致。RNA聚Ⅰ合成RNA的活性最显著，它位于核仁中，负责转录编码rRNA的基因。而细胞内绝大部分RNA是rRNA是RNA。RNA聚合酶Ⅱ，位于核质中，负责核内不匀一RNA的合成，而hnRNA是mRNA的前体。RNA聚合酶Ⅲ负责合成tRNA和大量小的核内RNAs。鹅膏蕈碱是真核生物RNA聚合酶特异性抑制剂，三种真核生物RNA聚合酶对鹅膏蕈碱的反应不同。原核生物靠RNA聚合酶就可完成从起始、延长、终止的转录全过程，真核生物转录除RNA聚合酶外还需另一此叫做转录因子的蛋白质分子参与转录的全过程，

其次节控制转录起始的DNA序列－启动子的结构

一、原核生物启动子的结构

Pribnow框：在起始点上游，几乎在所有启动子都存在一个6bp富含A/T区域TATAAT。寻常位于－18位到－9位，称为Pribnow框。该区域是RNA聚合酶稳固结合位点，RNA聚合酶结合后，这一富含A/T的DNA双链解开。

Sextama框：位于－35区附近有一TTGACA序列，是RNA聚合酶中的ζ因子识别位点。以上这两个位点对于转录起始都是十分重要的。ζ因子识别－35区并与之结合。由于RNA聚合酶分子覆盖面积能达到70bp，因此酶分子上的一个适合部位能接触－10区。酶分子一旦与－10区结合以后，就从识别位点上解离下来。此外，－35序列的重要性还在于在很大程度上决定了启动子的强度。。

在－35区和－10区之间的碱基序列不特别重要，但是这两个序列之间的距离却十分重要，是决定启动子强度的因素之一大多为15bp～20bp。

二、真核生物启动子的结构

有三种类型的启动子，其中Ⅱ类启动子最为繁杂。

Ⅱ类启动子由核心元件（coreelement）和上游启动子元件（upstreampromoterelement，UPE）组成。核心元件包括TATA框和转录起始位点。mRNA的第一个碱基倾向A，另一侧翼由Py组成。TATA框合又称Hogness框，Goldberg-Hogness框，其一致序列是：T85A97T93A85A63A83A50，常在起始位点的上游-25左右，相当于原核的-10序列。

上游元件包括CAATbox、GCbox、等。如CAATbox一般位于上游-75bp左右，紧靠-80，其功能是控制转录起始活性。远端调控区较常见的是加强子。

启动子Ⅲ位于起始位点的下游的转录区内，因此称为下游启动子（downstreampromoter）或基因内启动子（intragenenicpromoter）。转录需要转录因子TFⅢA、B和C的参与。

三、鉴定启动子的方法

1、踪迹法：是一种测定ＤＮＡ结合蛋白在ＤＮＡ上的结合位点的试验方法，其根据是ＤＮＡ的这些区域在结合有蛋白质时可被保护而免受核酸内切酶的作用．酶切后产生片段与对照的酶切片段经凝胶电泳分开后进行比较，即找出ＤＮＡ与蛋白质结合的位点。

2、缺失分析和点突变：对以上所获得的DNA与蛋白质结合的位点进一步做缺失分析和点突变。

第三节转录的过程

一、转录起始

转录是从DNA分子的特定部位开始的，这个部位也是RNA聚合酶全酶结合的部信这就是启动子。为什么RNA聚合酶能够仅在启动子处结合呢？显然启动子处的核苷酸序列具有特别性，为了便利，人们将在DNA上开始转录的第一个碱基定为+1，沿转录方向顺流而下的核苷酸序列均用正值表示；逆流而上的核苷酸序列均用负值表示。

在原核生物中，当RNA聚合酶的δ亚基发现其识别位点时，全酶就与启动子的-35区序列结合形成一个封闭的启动子复合物。由于全酶分子较大，其另一端可在到-10区的序列，在某种作用下，整个酶分子向-10序列转移并与之稳固结合，在此处发生局部DNA12-17r的解链形成全酶和启动子的开放性复合物。在开放性启动子复合物中起始位点和延长位点被相应的核苷酸前体充满，在RNA聚合酶β亚基催化下形成RNA的第一个磷酸二酸键。RNA合成的第一个核苷酸总有GTP或ATP，以GTP常见，此时δ因子从全酶解离下来，靠核心酶在DNA链上向下游滑动，而脱落的δ因子与另一个核心酶结合成全酶反复利用。

真核生物转录起始十分繁杂，往往需要多种蛋白因子的协助，已经知道，在

所有的细胞中有一类叫做转录因子的蛋白质分子，它们与RNA聚合酶Ⅱ形成转录起始复合物，共同参与转录起始的过程。真核生物基因中，有专门为蛋白质编码的基因，这些基因由RNA聚合酶Ⅱ负责进行转录起始关键性作用。根据这些转录因子的作用特点可大致分为二类；第一类为普遍转录因子它们与RNA聚合酶Ⅱ共同组成转录起始复合物，转录才能在正确的位置上开始。普遍转录因子是由多种蛋白质分子组成的，其中包括特异结合在TATA盒上的蛋白质，叫做TATA盒结合蛋白，还有至成一组复合物叫做转录因子ⅡD。TFⅡD再与RNA聚合酶Ⅱ结合完成转录起始复合物的形成。除TFⅡD以外，在细胞核提取物中还发现TFⅡA，TFⅡF，TFⅡE，TFⅡH等，它们在转录起始复合物组装的不同阶段起作用。从中也不难看出真核细胞中基因转录的起始是基因的表达调控的关键，这么多蛋白质分子之间相互作用，以及这些蛋白质分子DNA调控无件相结合，构成控制基因转录开始的繁杂体系。其次类转录因子为组织细胞特异性转录因子或者叫可诱导性转录因子，这些TF是在特异的组织细胞或是受到一些类固醇激素，生长因子或其它刺激后，开始表达某些特异蛋白质分子时，才需要的一类转录因子。

二、转录延伸

RNA链的延长靠核心酶的催化，在起始复合物上第一个GTP的核糖3'-OH上与DNA模板能配对的其次个三磷酸核苷起反应形成磷酸二酯键。聚合进去的核苷酸又有核糖3'-OH游离，这样就可按模板DNA的指引，一个接一个地延长下去。因此RNA链的合成方面也是5'→3'。由于DNA链与合成的RNA链具有反平行关系，所以RNA聚合酶是沿着DNA链3'→5'方向移动。整个转录过程是由同一个RNA聚合酶来完成的一个连续下断的反应，转录本RNA生成后，暂时与DNA模板链形成DNA·RNA杂交体，长度约为12个碱基对，形成一个转录泡（见图）。

转录速度大允是每秒钟30-50个核苷酸，但并不是以恒定速度进行的。三、转录终止

提供终止信号的序列称为终止子（terminator）。内源性终止子的回文结构中富含GC，且回文结构的下游有连续6～8个AT碱基对；弱终止子有回文结构，但不具有强终止子的两点特征，需要依靠于ρ因子实现终止作用。

ρ因子（终止因子）：是协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子，属于ATP依靠的解旋酶家族，具有一个RNA结合域和ATP水解域。

第四节转录后加工

转录后加工是指将各种前体RNA分子加工成各种成熟RNA的过程。一、真核生物mRNA的5?Cap

真核生物细胞mRNA的5￠端加帽是在鸟苷转移酶的催化下通过5?－5?键把一个G加到转录物的末端碱基形成的，随后，进行甲基化产生Cap0，Cap1，Cap2。

5?帽子的生物学功能：在翻译过程中起识别作用以及对mRNA起稳定作用。二、真核生物mRNA的3?Tail

有这种特征的mRNA称为poly(A)+，不具有的称为poly(A)－。mRNA3?端的多聚A是由poly(A)聚合酶所催化添加的。注意：多聚A尾巴不是添加在转录终止的3?端。

三、RNA的拼接

内含子剪接和剪切（clearvage）是mRNA转录后加工中最为繁杂的一环，也是近年来发展很快的研究领域之一。不同内含子的剪切和剪接，其机制，类型和酶都不完全一致，现分述如下。

1、Ⅰ类内含子的结构特点是：①其边界序列为5′U↓??G↓3′（↓表示剪切位点）；②具有中部核心结构（Centralcorestrucature）。③具有内部引导序列（internalguidesequenceIGS）。

首先是GTP进入G结合位点，左边外显子的3′端通过和引导序列的互补配对进入底物位点。GTP的3′-OH作用左边外显子和内含子交界处的磷酸二酯键，本身结合到内含子的5′末端，被切下的5′外显子仍保持在底物位点上，并未游离。其次步内含子的G414（即3′交界序列上的G）又进入了G-结合位点，切下的外显子的3′-OH又对G-结合位点上的G与3′外显子之间的磷酸二酯键发动亲核进攻，切开磷酸二酯键，而其3′-OH和3′外显子的P重新形成磷酸二酯键而连接起来，这样就完成内含子的剪接。内含子成为线形的413nt的RNA分子。第三步，内含子5′端和引导序列相邻的序列通过引导序列互补配对，进入底物位点。依旧留在G结合位点上的G414其3′-OH再作用底物位点

上的序列，切下19nt的内含子5′端，并和余下内含子的5′-P形成二酯键，形成414nt的环状内含子。

2、Ⅱ型内含子在植物和低等真核生物的细胞器基因组中发现。Ⅱ类内含子的剪接和I类内含子不同。

结构特点是列为5′↓GUGCG??YnAG↓，符合GT-AG法则，在内含子的近3′端具有分支点顺序（branch-pointseguence），内部具有二级结构。II型内含子的剪切无需鸟苷的辅助，但需镁离子的存在。首先是分枝点A的2′-OH对5′端外显子和内含子交界处的磷酸二酯键发动亲核进攻（图13-28）切下外显子1，内含子5′的边界序列上的G与5′磷酸和分枝点A的2′-OH形成磷酸二酯键，从而产生了套索（lariat）结构；其次步是切下的外显子1，其3′-OH继续对内含子3′端的交界序列进行亲核进攻，切下的外显子2′的5′磷酸和外显子1的3′-OH形成磷酸二酯键，连接在一起，同时释放出套索状的内含子。

通过对以上两种内含子的研究，提出“核酶〞概念。

核酶(Ribozyme)有的译成为核糖拟酶，核酶等，目前尚无统一的译法，暂以核酶称之，既简单明确，也能反映其酶的本质。核酶是T.Cech等（1981年）在研究四膜虫rRNA时发现的，1982年T.Cech将核糖核酸（ribonucleicacid）和酶（enzyme）这两个词“重组〞成一个新的词：“Ribozyme〞,它是指本质为RNA或以RNA为主含有蛋白质辅基的一类物质，这类物质具有催化功能，但和酶又有区别，主要说明在两个方面：①一般的酶是纯的蛋白质，而核酶是RNA或带有蛋白的RNA；②核酶既是催化剂又是底物，随着反应的进行，本身也消失了。而酶却不同，仅催化反应，反应前后其本身的质和量都不发生改变。3、核mRNA的剪接

结构和Ⅱ类内含子十分相像，符合GU-AG法则，具有分支位点。但根本的不同点是核mRNA前体的剪接本身不能形成二级结构，必需依靠于snRNP（U1，U2，U4，U5，U6）的帮助才能形成剪接体，进行自我剪接。它们自己本身不能象I类及Ⅱ类内含子那样依靠核心结构，形成茎环，将5′和3′剪切点拉在一起。和snRNA的结合是相当繁杂的，但剪接反应的第一步5′位点的剪接是由U6催化的，3′位点是由5′外显子1的3′-OH对内含子3′端切点进行转酯

反应来完成。

4．相关概念

可变剪接；反式剪接；RNA编辑

第五节逆转录

逆转录：RNA指导的DNA合成，在逆转录酶的作用下完成，如AMV,MLV。主要存在于RNA病毒中。

第六章翻译

教学目的：使学生把握tRNA的结构、遗传密码的特征、核糖体的结构及肽链的合成过程。

教学重点、难点：肽链的合成过程；rRNA在肽链合成中的催化作用。课时安排：6学时教学内容：

基因的遗传信息在转录过程中从DNA转移到mRNA，再由mRNA将这种遗传信息表达为蛋白质中氨基酸顺序的过程叫做翻译。翻译的过程也就是蛋白质分子生物合成的过程，在此过程中需要200多种生物大分子参与，其中包括核糖体、mRNA、tRNA及多种蛋白质因子。

第一节tRNA和遗传密码

一、tRNA的结构

tRNA在蛋白质生物合成过程中起关键作用。mRNA推带的遗传信息被翻译成蛋白质一级结构，但是mRNA分子与氨基酸分子之间并无直接的对应关系。这就需要经过第三者“介绍〞，而tRNA分子就充当这个角色。tRNA是类小分子RNA，长度为73-94个核苷酸，tRNA分子中富含稀有碱基和修饰碱基，tRNA分子3'端均为CCA序列，氨基酸分子通过共价键与A结合，此处的结构也叫氨基酸臂。每种氨基酸都有2-6种各自特异的tRNA，它们之间的特异性是靠氨基酰tRNA合成酶来识别的。这样，携带一致氨基酸而反密码子不同的一组tRNA称为同功tRNA，它们在细胞内合成量上有多和少的区别，分别称为主要tRNA和次要tRNA。主要tRNA中反密码子识别tRNA中的高频密码子，而次要tRNA中反密码子识别mRNA中的低频密码子。每种氨基酸都只有一种氨基酰tRNA合成酶。因此细胞内有20种氨基酰tRNA合成酶。

tRNA分子中还有一个反密码环，此环上的三个反密码子的作用是与mRNA分子中的密码子靠碱基配对原则而形成氢键，达到相互识别的目的。但在密码子与反密码子结合时具有一定摇摆性，即密码子的第3位碱基与反密码子的第1位碱基酸对时并不严格。配对摇摆性完全是由tRNA反密码子的空间结构所决定的。反密码的第1位碱基常出现次黄嘌呤I，与A、C、U之间皆可形成氢键而结合，这是最常见的摇摆现象。这种摇摆现象使得一个tRNA所携带的氨基酸可

排列在2-3个不同的密码子上，因此当密码子的第3位碱基发生一定程度的突变时，并不影响tRNA带入正确的氨基酸。

在蛋白质生物合成过程中，特异识别mRNA上起始密码子的tRNA被称为起始tRNA，它们参与多肽链合成的起始，其它在多肽链延伸中运载氨基酸的tRNA，统称为延伸tRNA。

二、遗传密码的特征

mRNA分子上以5'→3'方向,从AUG开始每三个连续的核苷酸组成一个密码子,mRNA中的四种碱基可以组成64种密码子。这些密码不仅代表了20种氨基酸，还决定了翻译过程的起始与终止位置。每种氨基酸至少有一种密码子，最多的有6种密码子。

遗传密码具有以下几种特点：

1、起始密码子与终止密码子（Initiationcodonandterminationcodon）密码子AUG是起始密码，代表合成肽链的第一个氨基酸的位置，它们位mRNA5′末端，同时它也是蛋氨酸的密码子，因此原核生物和真核生物多肽链合成的第一个氨基酸都是蛋氨酸，当然少数细菌中也用GUG做为起始码。在真核生物CUG偶尔也用作起始蛋氨酸的密码。密码子UAA，UAG，UGA是肽链成的终止密码，不代表任何氨基酸，它们单独或共同存在于mRNA3'末端。因此翻译是沿着mRNA分子5′→3′方向进行的。

2、密码的简并性（Degemeracy）

一种氨基酸有几组密码子，或者几组密码子代表一种氨基酸的现象称为密码子的简并性，这种简并性主要是由于密码子的第三个碱基发生摇摆现象形成的，也就是说密码子的专一性主要由前两个碱基决定，即使第三个碱基发生突变也能翻译出正确的氨基酸，这对于保证物种的稳定性有一定意义。如：GCU，GCC，GCA，GCG都代表丙氨酸。

3、密码的通用性

大量的事实证明生命世界从低等到高等，都使用一套密码，也就是说遗传密码在很长的进化时期中保持不变。因此这张密码表是生物界通用的。然而，出乎人们预料的是，真核生物线粒体的密码子有大量不同于通用密码，例如人线粒体中，UGA不是终止码，而是色氨酸的密码子，AGA，AGG不是精氨酸的密码子，而是终止密码子，加上通用密码中的UAA和UAG，线粒体中共有四组终止码。

内部甲硫氨酸密码子有两个，即AUG和AUA；而起始甲硫氨酸密码子有四组，即AUN。

其次节肽链的合成

一、核糖体的活性部位

任何生物的核糖体都是由大、小两个亚基组成。1968年已在体外对大肠杆菌小亚基进行了自我装配研究，参与16srRNA和21种蛋白质，即可形成有自然活性的30s小亚基。通过这些研究使人们能够进一步认识小亚基和大亚基中rRNA与蛋白质的特异功能。核糖体是高度繁杂的体系，它的任何个别组分或局部组分都不能起整体的作用，因此必需研究核糖体中蛋白质和RNA的空间结构和位置，才能更完全地了解蛋白质合成的具体过程。核蛋白体作为蛋白质的合成场所具有以下结构特点和作用：

1、具有mRNA结合位点

位于30s小亚基头部，此处有几种蛋白质构成一个以上的结构域，负责与mRNA的结合，特别是16srRNA3'端与mRNAAUG之前的一段序列互补是这种结合必不可少的。

2、具有P位点（peptidyltRNAsite）

又叫做肽酰基-tRNA位或P位。它大部分位于小亚基，小部分位于大亚基，它是结合起始tRNA并向A位给出氨基酸的位置。

3、具有A位点（Aminoacyl-tRNAsite）

又叫做氨基酰-tRNA位或受位。它大部分位于大亚基而小部分位于小亚基，它是结合一个新进入的氨基酰tRNA的位置。

5、结合参与蛋白质合成的因子

如起始因子（InitiationFactor,IF）、延长因子(ElengationFactor,EF)和终止因子或释放因子(ReleaseFactor,RF)。

二、肽链的合成过程1、起始阶段：

起始tRNA：合成的起始密码子是AUG，对应的氨基酸是Met。原核细胞中存在两种携带Met的tRNAfMettRNAmMet，真核细胞tRNAiMettRNAmMet

起始因子：IF1、IF2、IF3

过程：IF3+30S亚基16SrRNA结合SD序列，使P位点正好对准起始密码子AUG。（真核生物识别帽子结构）

在IF2的协助下起始tRNA（甲硫氨酰tRNA）进入P位点。GTP结合，50S亚基结合，GTP水解，改变亚基构象，促进70S核糖体形成，同时释放IF2和IF3。在IF1的作用下，IF2释放，因此IF1是IF2的循环因子。这时，P位点被tRNA占据，而A位点空着。

2、延伸阶段：

EF-Tu+GTP，＋氨酰基tRNA，三元复合物进入A位点（GTP是必需的）。GTP水解，EF-Tu释放，这时肽基转移酶将甲酰甲硫氨酰基转移到A位，形成第一个肽键。当肽键在A位形成之后，EF-G与GTP结合，将A位形成的肽基转移到P位，同时将原来P位的tRNA逐出核糖体。由此可见，延伸因子是交替进入核糖体的。EF-Ts使EF-Tu—GDP转变为EF-Tu+GTP。

3、终止

终止因子：RF1/2/3

经过运输、定位和翻译后处理后才能称为有功能的蛋白质。三、

rRNA在肽链合成中的作用

1、16SrRNA的作用：rRNA的3?端在起始时与mRNA直接相互作用；16SrRNA上的专一区域与A位点及P位点上tRNA反密码子区直接相互作用；与23SrRNA相互作用。

2、23SrRNA的作用：具有肽基转移酶的活性

第七章原核生物基因表达调控

教学目的：使学生把握原核生物基因表达在转录水平和翻译水平的主要方式。

教学重点、难点：操纵子；衰减子；反义RNA；RNA干扰。课时安排：4学时教学内容：

第一节转录水平的调控

一、操纵元

操纵元是原核基因表达调控的一种重要的组织形式，大肠杆菌的基因多数以操纵元的形式组成基因表达调控的单元。

操纵元中被调控的编码蛋白质的基因可称为结构基因(structuralgene,SG)。一个操纵元中含有2个以上的结构基因，多的可达十几个。每个结构基因是一个连续的开放读框(openreadingframe)，5'端有翻译起始码(DNA存储链上是ATG，转录成mRNA就是AUG)，3'端有翻译终止码(DNA存储链上是TAA、TGA或TAG，转录成mRNA就是UAA、UGA或UAG)。各结构基因头尾衔接、串连排列，组成结构基因群。至少在第一个结构基因5'侧具有核糖体结合位点(ribosomebindingsite,RBS)，因而当这段含多个结构基因的DNA被转录成多顺反子mRNA，就能被核糖体所识别结合、并起始翻译。核糖体沿mRNA移动；在合成完第一个编码的多肽后，核糖体可以不脱离mRNA而继续翻译合成下一个基因编码的多肽，直至合成完这条多顺反子mRNA

二、

基因转录的翻译调控－衰减子

色氨酸是构成蛋白质的组分，一般的环境难以给细菌提供足够的色氨酸，细菌要生存繁殖寻常需要自己经过大量步骤合成色氨酸，但是一旦环境能够提供色氨酸时，细菌就会充分利用外界的色氨酸、减少或中止合成色氨酸，以减轻自己的负担。细菌所以能做到这点是由于有色氨酸操纵元(trpoperon)的调控。

合成色氨酸所需要酶类的基因E、D、C、B、A等头尾相接串连排列组成结构基因群，受其上游的启动子Ptrp和操纵子o的调控，调控基因trpR的位置远离P-O-结构基因群，在其自身的启动子作用下，以组成性方式低水平表达分子量为47000的调控蛋白R。R并没有与o结合的活性，当环境能提供足够浓度的

色氨酸时，R与色氨酸结合后构象变化而活化，就能够与o特异性亲和结合，阻遏结构基因的转录，因此这是属于一种负性调控的、可阻遏的操纵元(repressibleoperon)，即这操纵元寻常是开放转录的，当有效应物(色氨酸为阻遏剂)作用时，则阻遏关闭转录。细菌不少生物合成系统的操纵元都属于这种类型，其调控可使细菌处在生存繁殖最经济最节省的状态。

试验观测说明：当色氨酸达到一定浓度，但还没有高到能够活化R使其起阻遏作用的程度时，产生色氨酸合成酶类的量已经明显降低，而且产生的酶量与色氨酸浓度呈负相关。细心研究发现这种调控现象与色氨酸操纵元特别的结构有关。

在色氨酸操纵元Ptrp-O与第一个结构基因trpE之间有162bp的一段先导序列(leadingsequence,L)。试验证明当色氨酸达一定浓度时，RNA聚合酶的转录会终止在这里。这段序列中含有编码由14个氨基酸组成的短肽的开放读框，其序列中有2个色氨酸相连，在此开放读框前有核糖体识别结合位点(RBS)序列，提醒这段短开放读框在转录后是能被翻译的。在先导序列的后半段含有3对反向重复序列(见图)，在被转录生成mRNA时都能够形成发夹式结构，但由于B的序列分别与A和C重叠，所以假使B形成发夹结构，A和C都不能再形成发夹结构；相反，当A形成发夹结构时，B就不能形成发夹结构，却有利于C生成发夹结构。C后面紧跟一串A(转录成RNA就是一串U)，C实际上是一个终止子，假使转录mRNA时它形成发夹结构，就能使RNA聚合酶中止转录而从mRNA上脱离下来

在色氨酸未达到能起阻遏作用的浓度时，从Ptrp起始转录，RNA聚合酶沿DNA转录合成mRNA，同时核糖体就结合到新生成的mRNA核糖体结合位点上开始翻译。当色氨酸浓度低时，生成的tRNAtrp色氨酸量就少，能扩散到核糖体mRNA形成的翻译复合体中供给合成短肽的几率低，使核糖体沿mRNA翻译移动的速度慢，赶不上RNA聚合酶沿DNA移动转录的速度，这时核糖体占据短开放读框的机遇较多，使A不能生成发夹结构，于是B就形成发夹结构，阻止了C生成终止信号的结构，RNA聚合酶得以沿DNA前进，继续去转录其后trpE等基因，trp操纵元就处于开放状态。当色氨酸浓度增高时，tRNAtrp色氨酸浓度随之升高，核糖体沿mRNA翻译移动的速度加快，占据到B段的机遇增加，B生

成发夹结构的机遇减少，C形成终止结构的机遇增多，RNA聚合酶终止转录的的几率增加，于是转录减弱。假使当其他氨基酸短缺(注意：短开放读框编码的14肽中多数氨基酸能由环境充分供应的机遇是不多的)或所有的氨基酸都不足时，核糖体翻译移动的速度就更慢，甚至不能占据A的序列，结果有利于A和C发夹结构的形成，于是RNA聚合酶中止转录，等于告诉细菌：“整个氨基酸都不足，即使合成色氨酸也不能合成蛋白质，不如不合成以节省能量〞。

由此可见，先导序列起到随色氨酸浓度升高降低转录的作用，这段序列就称为衰减子attenuator)。在trp操纵元中，对结构基因的转录阻遏蛋白的负调控起到粗调的作用，而衰减子起到细调的作用。细菌其他氨基酸合成系统的大量操纵元(如组氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸等操纵元)中也有类似的衰减子存在。

其次节翻译水平的调控

一、

反义RNA的调控作用

反义RNA通过与特定的mRNA结合，结合位点寻常是mRNA上的SD序列及N端的密码子，从而抑制mRNA的翻译。

二、

mRNA自身的二级结构影响翻译过程

终止子、衰减子和反义RNA都是mRNA通过二级结构的改变在不同水平上对基因表达进行调控。除此之外，mRNA自身的二级结构还能影响核糖体的结合以及mRNA的寿命从而影响翻译。

三、四、

蛋白质合成的自体调控严谨反应

细菌处于极差的生长条件下，由于缺乏足够的氨基酸，蛋白质合成受到抑制，因而会关闭大量的代谢过程，这就是应急反应(Stringentresponse)或应急调控。

第八章真核生物基因表达调控

教学目的：让学生理解真核生物基因表达调控的繁杂性，并把握在各水平上的调控机制。

教学重点、难点：染色质结构对基因转录的影响；转录水平的调控。课时安排：4学时教学内容：

尽管我们现在对真核基因表达调控知道还不多，但与原核生物比较它具有一些明显的特点。

第一节真核生物基因调控的特点

一、真核基因表达调控的环节更多

如前所述，基因表达是基因经过转录、翻译、产生有生物活性的蛋白质的整个过程。同原核生物一样，转录仍旧是真核生物基因表达调控的主要环节。但真核基因转录发生在细胞核(线粒体基因的转录在线粒体内)，翻译则多在胞浆，两个过程是分开的，因此其调控增加了更多的环节和繁杂性，转录后的调控占有了更多的分量。

真核细胞在分化过程中会发生基因重排(generearrangement)，即胚原性基因组中某些基因会再组合变化形成其次级基因。例如编码完整抗体蛋白的基因是在淋巴细胞分化发育过程中，由原来分开的几百个不同的可变区基因经选择、组合、变化，与恒定区基因一起构成稳定的、为特定的完整抗体蛋白编码的可表达的基因。这种基因重排使细胞可能利用几百个抗体基因的片段，组合变化而产生能编码达108种不同抗体的基因，其中就有繁杂的基因表达调控机理。

此外，真核细胞中还会发生基因扩增(geneamplification)，即基因组中的特定段落在某些状况下会复制产生大量拷贝。最早发现的是蛙的成熟卵细胞在受精后的发育过程中其rRNA基因(可称为rDNA)可扩增2000倍，以后发现其他动物的卵细胞也有同样的状况，这很显然适合了受精后迅速发育分裂要合成大量蛋白质，需要有大量核糖体。又如MTX(methotrexate)是叶酸的结构类似物，一些哺乳类细胞会对含有利用叶酸所必需的二氢叶酸还原酶(dihydrofolatereductase,DHFR)基因的DNA区段扩增40-100倍，使DHFR的表达量显著增加，从而提高对MTX的抗性。基因的扩增无疑能够大幅度提高基因表达产物的量，但这种调控机理至今还不明白。

真核基因组DNA绝大部分都在细胞核内与组蛋白等结合成染色质，染色质的结构、染色质中NA

1、染色质结构影响基因转录

细胞分裂时染色体的大部分到间期时松开分散在核内，称为常染色质(euchromatin)，松散的染色质中的基因可以转录。染色体中的某些区段到分裂期后不像其他部分解旋松开，仍保持紧凑折叠的结构，在间期核中可以看到其浓集的斑块，称为异染色质(heterochromatin)，其中从未见有基因转录表达；原本在常染色质中表达的基因如移到异染色质内也会中止表达；哺乳类雌体细胞2条X染色体，到间期一条变成异染色质者，这条X染色体上的基因就全部失活。可

2、组蛋白的作用

早期体外试验观测到组蛋白与DNA结合阻止DNA上基因的转