分子生物学试验报告

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分子生物学试验

院系：生命科学与技术学院专业：班级：学号：姓名：

生物科学（基地）202301班

分子生物学基础试验

分子生物学试验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合试验室主要开设常用而基本的分子生物学试验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。

试验一质粒DNA的小量制备

一、试验原理

要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必需具备以下条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tcr），抗新霉素基因（Ner）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分开筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。

质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的大量生物学功能也是对宿主细胞的补偿。

质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringentcontrol）和松弛控制型（relaxedcontrol）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有大量拷贝，一般在20个以上。寻常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColEⅠ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本试验分开提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColEⅠ衍生的质粒。

所有分开质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细

菌；分开和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。

质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalentlyclosedcircularDNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。假使两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（opencircularDNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本试验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中浮现3条区带。

二、试验目的

1．把握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。2．了解制备原理及各种试剂的作用。

三、试验材料和试剂

材料：大肠杆菌E.coli，含pBR322质粒。试剂：

1.LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl，用NaOH调pH至

7.3左右。如固体培养基则添加15g/L琼脂。

2.溶液Ⅰ（pH8.0G.E.T缓冲液）：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L

EDTA。灭菌后存放。

3.溶液Ⅱ（0.2mol/LNaOH(内含1％SDS)）：预先配制1％SDS母液，临用前一天晚上

参与0.2mol/LNaOH，4℃保存。

4.溶液Ⅲ（pH4.8乙酸钾溶液）：5mol/L乙酸钾60mL、冰乙酸11.5mL、双蒸馏水

28.5mL。

5.酚/氯仿液(V/V＝1/1)：酚为重蒸酚，配制时，先将氯仿中参与异戊醇，使其体积比为

24:1，然后等量的参与重蒸酚，混匀，并用0.1mol/LTris-HCl(pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，于棕色瓶中存放，并在上面覆盖等体积的0.01mol/LTris-HCl(pH7.6)，4℃保存。6.无水乙醇

7.70％乙醇

8.pH8.0TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl、1mmol/LEDTA，其中含RNA酶20μg/mL。仪器：

恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、台式高速离心机、台式小型振荡器、EP管(1.5mL微量离心管)、加样器(20uL～lmL)、吸头。

四、操作步骤（一）培养细菌

将带有质粒pBR322的大肠杆菌接种在含50μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。注意：添加Amp时，须待LB培养基冷却到50℃左右方可参与。

（二）从菌落中快速提取制备质粒DNA

1．取1.4mL菌液置于1.5mLEp管中，7500rpm离心1min。

2．弃上清，参与150μLGET缓冲液，在涡旋混合器上充分混匀，在室温下放置10min。3．参与200μL新配制的0.2mol/LNaOH(内含1％SDS)，加盖，颠倒（不要振荡）2～3次，使之混匀，冰上放置4min，最多不能超过5min。

4．参与150μL冰冷的乙酸钾溶液。加盖后，颠倒数次使之混匀，冰上放置15min。5．10000rpm离心5min，上清液吸至另一清白的1.5mLEp中，如上清液浑浊则需重新离心一次。

6．于上清液中加等体积酚/氯仿液，振荡混匀，12000rpm离心2min，防备吸取上清液，转移至另一1.5mLEp管中，注意勿将两液相中间的白色蛋白薄层吸出。

7．向上清液参与2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置３min。用离心机于10000rpm离心5min。倒去上清液。

8．用0.5mL70％乙醇洗涤沉淀一次，10000rpm离心3min，除尽乙醇，室温自然枯燥(将离心管倒置于一张纸巾上)，备用。

9．用30uL含无DNA酶的胰RNase(20ug／mL)的TE重新溶解DNA，置于4℃保存，供下午电泳使用。

这里由于要检测质粒是否提取成功以及提取质粒的浓度，故在此要进行一次电泳，下面为琼脂糖凝胶电泳的原理及方法：

原理：根据DNA分子量不同，采用外加电场使其分开，用EB嵌入DNA分子后在紫外下

显荧光。而荧光强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品表2－1作为电泳对照，就可以估计出待测样品的浓度。电泳后的琼脂凝胶糖直接在紫外灯下拍照，只需要5－10ngDNA，就可以从照片上比较鉴别。

由于电泳时所用的样品量十分少，只要将浓度控制在几十纳克即可，所以在基因工程中经常被用做检测DNA样品。

表2－1λDNA/HindⅢ中DNA片断

片段碱基对数目/kb相对分子质量DNA含量/%DNA含量/(ng/mg)1234567823.1309.4196.5574.3712.3222.0280.5640.12515.0×1066.12×1064.26×1062.84×1061.51×1061.32×1060.37×1060.08×10647.719.413.594.84.21.10.3476.9194.1135.289.947.941.811.62.6总DNA含量为100%

琼脂糖凝胶板的制备1．琼脂糖凝胶的制备

称取1.0g琼脂糖，置于锥形瓶中，参与100mLTBE缓冲液，于电炉上加热，注意：防止溢出，由于琼脂糖较难溶解，假使水分损失较大，则补充一定量的蒸馏水，使其终浓度为1％。2．胶板的制备

将有机玻璃内槽洗净、晾干。取胶带纸将有机玻璃内槽的两端边缘封好，形成一个