聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分开血清蛋白

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[试验目的]

(1)学习聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳原理。(2)把握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。

(3)比较醋酸纤维薄膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分开血清蛋白的操作效果。[试验原理]

带电质点在电场作用下，会向两极移动；带正电荷的移向负极，带负电荷的移向正极，这种现象称为电泳。

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)

在加速剂N，N，N?，N?—四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE)。[试验试剂]

1、待测样品：新鲜血清

2、制备分开胶、浓缩胶有关试剂：

(1)凝胶缓冲液：称取1mol/LHCl48ml,Tris(三羟基氨基甲烷)36.6g,TEMED0.23mL,加重蒸馏水至80mL使其溶解，调pH8.9，然后加重蒸馏水定容至100mL，至棕色瓶，冰箱保存。(2)分开胶贮液，一般有两种配法：

ⅰ28％Acr-0.735％Bis贮液：丙烯酰胺28.0克，甲叉双丙烯酰胺0.735克,加重蒸馏水使其溶解然后定容至100mL.

ⅱ30％Acr-0.8％Bis贮液:Acr30.0克,Bis0.8克,加重蒸馏水使其溶解定容至100mL.以上两种溶液需用棕色试剂瓶盛放,4℃储存,一般可放置一个月左右.

(3)分析纯过硫酸铵(AP)(AR)0.14g加重蒸水100mL,棕色瓶,4℃储存仅能用一周,最好当天配置.上述三种试剂用于制备分开胶.

(4)浓缩胶缓冲液:称取1mol/LHCL48mL,Tris5.98g,TEMED0.46mL,加重蒸水至80mL,调pH6.7,用重蒸水定容至100mL,棕色瓶4℃储存.

(5)浓缩胶贮液:称取Acr10g，Bis2.5g，加重蒸水溶解定容100mL，过滤后至棕色瓶4℃贮存。

(6)40％蔗糖溶液（W/V）

(7)核黄素4.0mg,加重蒸水溶解,定容至100mL,棕色瓶4℃贮存.以上(4)-(7)4种溶液用于配置浓缩胶.

3.Tris-甘氨酸电极缓冲液(pH8.3)

称取Tris6.0g,甘氨酸28.8g,加蒸馏水至900mL,调pH之后定容至1000mL,4℃贮存,使用前稀释10倍.

4.0.1％溴酚蓝指示剂.5.染色液

染色液种类较多,染色方法也不完全一致,详细染色法如下:方法氨基黑-10B固定甲醇7％乙酸染液0.1mol/LNaOH1％氨基黑7％乙酸中0.5％-1％氨基黑考马斯亮蓝R25020％磺基水杨酸0.25％R250水液10％三氯乙酸10﹪三氯乙酸-10％中染色时间5min(室温)2h(室温)/10min(96℃)5min(室温)30min室温)7％乙酸10﹪三氯乙酸90％甲酸脱色5％乙醇7％乙酸R2501h(室温)19:1(体积比)5％磺基水杨酸和1％R25019:1(体积比)考马斯亮蓝G2506％乙酸6﹪乙酸中1％10min室温)30min室温)甲醇-水-浓氨64:63:112.5﹪三氯乙酸G25012.5﹪三氯乙酸中0.1﹪G250Ponceau3R12.5％三氯乙酸0.1mol/LNaOH0.1％3R中2min室温2h(5℃)5％乙醇固绿7％乙酸7％乙酸中1％固7％乙酸绿氨基萘酚磺酸2mol/LHCL浸几秒钟0.1mol/L磷酸盐缓冲液pH6.8中0.003％染料本试验采用0.05％考马斯亮蓝R250染色液中,含20％磺基水杨酸,其优点是染色固定同时进行,背景易脱色.

0.05％考马斯亮蓝R250的20％磺基水杨酸染液:考马斯亮蓝0.05g,磺基水杨酸20g,加蒸馏水至100mL,过滤后至试剂瓶内保存.6.脱色液

0.1mol/lNaCl溶液7.保存液

甘油10mL,冰乙酸7mL,加蒸馏水至100mL8.1％琼脂糖溶液

琼脂1g,加已稀释10倍的电极缓冲液,加热溶解,4℃贮存备用，使用时取出加热成液体，待稍微冷却后用胶头滴管吸取使用，胶头滴管使用完后马上清洗清白.[试验仪器]

夹心式垂直板电泳槽，样品槽模板，直流稳压电源（电压300—600V，电流50—100mA），吸量管（1mL，5mL，10mL），烧杯，修长头滴管，1mL注射器及6号长针头，微量注射器，水泵或油泵，真空枯燥器，培养皿（直径120mm），玻璃板，日光灯一台

[试验步骤]一、

安装夹心式垂直板电泳槽

3min夹心式垂直板电泳槽操作简单，不易渗漏，其装置如图

1.导线接头2.下贮槽3.凹形橡胶框1.样品槽模板2.长玻璃板4.样品槽模板5.固定螺丝6.上贮槽3.短玻璃板4.凹形橡胶框7.冷凝系统各部件依以下顺序组装:(1)(2)

装上贮槽和固定螺丝，勿使上下贮槽在外连通，使用橡皮管时用夹子夹住.玻璃板洗净后用吹风机吹干，清洗玻璃板时不得用刷子刷，可用纱布或海绵擦洗，以免在玻璃表面上留下刮痕，清洗后不得用纸或布擦干，将长短玻璃板分别插在硅相框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。

(3)(4)(5)

将已插好玻璃板的橡胶框平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。

将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线方式旋紧螺丝帽。竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅模框交界的缝隙内参与已溶化的1％琼脂，其目的是封住空隙，凝固后的琼脂应避免里面有气泡。

二、配胶

目前用于PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）凝胶贮液有30％Acr-0.8％Bis及28％Acr-0.735％Bis2种，以它们为母液可以配置不同浓度的分开胶。不同浓度的分开胶及浓缩胶配置方法见下表：试剂名称用量/mL20mLPAA终浓度5.5％2.507.0％2.5010.0％2.5020mLPAA终浓度5.0％2.507.5％2.5010.0％2.50(1)分开胶缓冲液pH8.9Tris-HCl(TEMED)(2)凝胶贮液A.28％Acr-0.735％Bis分B.30％Acr-0.8％Bis离重蒸馏水胶3.935.007.14————————3.57——2.50——0.363.334.175.002.507.140.83充分混匀后，置于真空枯燥器中，抽气10分钟（3）0.14％AP(4)浓缩胶缓冲液pH6.7Tris-HCl(TEMED)10102.5％PAA121010103.75％PAA1310浓（5）浓缩胶贮液缩10％Acr-2.5％Bis胶（6）40％蔗糖4充分混匀后，置于真空枯燥器中，抽气10分钟3（7）0.004％核黄素

三、制备凝胶板

11PAGE有连续体系和不连续体系，其灌胶方式不完全一致，分别表达如下：

a)连续体系

本试验采用28％Acr-0.735％Bis凝胶贮液，从冰箱取出各种贮液，平衡至室温后，按上表的配比配制20mL7.0％凝胶。前三种溶液混合在一小烧杯内，（3）号液单独放置一小烧杯。二者抽气后混合均匀，马上用修长头滴管将分开胶溶液加到凝胶膜长、短玻璃板间的夹缝内，当加至距离短玻璃板上缘约0.5cm时，中止加胶，轻轻将样品槽模板（梳子）插入。在上、下贮槽中倒入蒸馏水，液面不能超过上贮槽的短玻璃板，防止蒸馏水进入凝胶之中。作用是增加压力，防止凝胶渗漏。凝胶液在混合后15min开始聚合，约30min-1h完成聚合作用。聚合后，在样品槽模板梳齿下缘与凝胶界面间有折射率不同的透明带。看到透明带后继续放置半小时，再用双手取出样品槽模板，动作要轻，用力均匀，以防弄破加样凹槽。凹槽中残留液体可用窄滤纸条轻轻吸取，切勿插进凝胶中，应保持加样槽凹面平整。放掉上、下贮槽中的蒸馏水，在上下两个电极槽倒入电极缓冲液，液面应没过短玻璃板上方约0.5cm。

b)不连续体系

不连续体系采用不同孔径及pH的分开胶与浓缩胶，凝胶制备分