第四章酶的提取与分离纯化

第四章酶的提取与分离纯化（1）细胞的破碎、酶的抽提重点（2）酶的分离纯化：沉淀分离、离心分离、膜过滤、层析分离、电泳分离（3）酶液的浓缩、结晶、干燥、成型本章知识点：一、生物下游加工技术下游加工过程包括目标产物的提取、浓缩、纯化及成品化等过程。生物产物从原料（培养液或细胞）生产到产品的后处理技术（分离纯化技术）的发展，使低成本、高收率地纯化目标产物成为现实。

大多数酶的回收纯化过程成本约占70%；医用酶的生产回收过程的成本高达85%；基因工程表达产物的回收纯化过程成本一般占85-90%以上。二、分离纯化的一般流程原料液细胞分离（离心、过滤）细胞（胞内产物）清液（胞外产物）细胞破碎碎片分离粗分离纯化成品化线路2线路1首先，应对被纯化的酶的理化性质有一个比较全面的了解;其次，判断采用的方法和条件是否得当，始终以活力回收率

和纯化倍数为指标；再者，在纯化工作中，往往不宜重复采用相同的步骤和条件；最后，要严格控制操作条件。随着酶的逐步纯净，杂蛋白含量亦逐步降低，蛋白质之间的相互作用力随之下降，酶更不稳定，因此，更要防止酶变性。在实践工作中选择方法时:三、酶分离纯化的基本原则（一）酶分离纯化包括三个基本环节抽提纯化制剂（二）酶分离纯化应注意以下问题1、防止酶变性失活：热、pH、泡沫、重金属等。2、选择有效的纯化方法。3、酶活性测定应贯穿纯化过程的始终。许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。第一节细胞破碎——只对胞内酶细胞壁的主要成分：细菌：肽聚糖：N-乙酰萄糖胺，N-乙酰胞壁酸真菌和酵母：萄聚糖，甘露聚糖藻类：纤丝状多糖类细胞破碎的方法：

1）机械破碎法2）物理破碎法

3）化学破碎法4）生物法（酶解）利用机械力的搅拌，剪切或研碎细胞。组织捣碎机，细胞研磨器，匀浆器等。（一）机械破碎法通过温度，压力，声波等各种物理因素的作用，将组织细胞破碎的方法，冻融法、压差法、超声波法（二）物理破碎法1）超声波：通过剪切力和空穴作用（30mg蛋白/ml,30-60sec/次）2）渗透压变化：高渗（蔗糖，高盐等）平衡后迅速转入低渗溶液或水中。3）冻融：反复低温冰冻，室温融化。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎的方法。有机溶剂处理：破坏膜磷脂结构，常用丙酮、丁醇、氯仿等。非离子型表面活性剂处理：改变膜通透性，使之溶解，再提膜蛋白。常用TritonX-100、Tween等。（三）化学破碎法自身的酶或外加酶制剂。（1）自溶法（2）酶处理选用各种溶壁酶（如溶菌酶）等处理菌体细胞，使细胞壁破坏，酶释放出来。革兰氏阳性菌：加溶菌酶。酵母细胞：加β-葡聚糖酶，使其β-1,3葡聚糖水解。霉菌：用几丁质酶。植物细胞：用纤维素酶，半纤维素酶和果胶酶的混合物。（四）酶促破碎法第二节提取（一）抽提方法指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程，也称为酶的抽提。四稀：稀酸、稀碱、稀盐、稀有机溶剂，水。（二）抽提过程中的注意事项1、pH值：选择的pH值不超出酶的酸碱稳定范围；最好远离待抽提酶的等电点。2、温度：通常控制在0~10℃左右，尤其是采用有机溶剂提取时。3、抽提液体积（用量）

抽提液的用量一般为含酶原料体积的2~5倍。可一次抽提，也可分几次反复抽提。4、为提高酶的稳定性，可以加入适量的保护剂。第三节酶的沉淀分离一、盐析沉淀法(saltingout)1、原理：2、硫酸铵盐析的优点优点：①在水中溶解度大，溶解的温度系数小；②价廉易得；③可保护酶。缺点：溶解过程随浓度增加的体积变化是非线性的变化。遇碱会放出NH4+，干扰蛋白质测定；对离心机等有腐蚀作用；酶制剂若用于食品，会影响口感。3、盐析操作硫酸铵的饱和度×100%（NH4）2SO4的饱和度（%）=饱和硫酸铵的体积混合溶液总体积(25℃)当溶液体积不大，要达到的盐浓度不高，可以加入饱和硫酸铵溶液；当溶液体积较大，要达到的盐浓度又较高，此时加入固体硫酸铵较好。4、为了得到较好的盐析效果，应控制下列因素（1）不同酶，盐析时所需的盐浓度各不相同。实际料液中目标酶的盐析沉淀操作前，所需的硫酸铵浓度或饱和度可通过实验确定。（2）加盐操作时，防止局部盐浓度过高，防止产生泡沫。（3）pH值和温度：等电点附近，室温或低温操作。（5）脱盐：超滤、透析或层析。（4）蛋白质浓度：样品液的蛋白质浓度一般控制在2.5~3.0%为宜，太浓时应适当稀释，以减少杂蛋白共沉淀。（二）等电点沉淀(isoelectricprecipitation)1、原理2、实际操作与其他方法一起使用（盐析、有机溶剂沉淀、复合沉淀）。单独使用时，主要是用于从粗酶中除去某些等电点相距较大的杂蛋白。3、注意加酸碱调节pH值时，防止局部酸碱过高。(三)有机溶剂沉淀在待分离的酶液中加入与水互溶的有机溶剂使溶液介电常数降低，酶蛋白分子间引力增大而相互产生聚集，从而降低溶解度而析出沉淀。实际操作中常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇和甲醇等。温度0℃下操作。有机溶剂先在-15℃～-20℃下预冷，沉淀后立即在低温下离心分离。pH值：尽可能靠近其等电点。沉淀后马上用缓冲液溶解，减少有机溶剂浓度。（四）复合物沉淀法1、原理2、常用的复合沉淀剂：单宁、聚乙二醇、聚丙烯酸（PAA）等高分子聚合物。

PAA+酶PAA-酶

PAA-酶PAA+酶

PAA+酶+Ca2+PAA-Ca2++酶

PAA-Ca2++SO4

2-CaSO4+PAApH6以上（五）选择性变性沉淀法1、热变性法：根据目的酶与杂蛋白热稳定性差异，可以在较高温度下，使杂蛋白变性沉淀，而酶则保持可溶状态。2、酸碱变性法：与热变性原理类似，目的酶与杂蛋白的酸碱稳定性不同，可以调整不同的pH使杂蛋白变性沉淀。选择一定的条件使酶液中存在的某些蛋白质等杂质变性沉淀，而不影响所需的酶。第四节膜过滤技术在酶分离纯化中的应用MembraneFiltration膜过滤技术（membranefiltration）：借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术。膜分离技术已被国际上公认为20世纪末至21世纪中期最有发展前途，甚至会导致一次工业革命的重大生产技术，所以可以称为前沿技术，是世界各国研究的热点。广泛应用于生物工程、化学、制药、饮料、电力、冶金、海水淡化、资源再生等领域。渗出液膜分离技术的地位和影响美国官方文件曾说“18世纪电器改变了整个工业进程，而20世纪膜技术将改变整个面貌”，“目前没有一种技术，能像膜技术这么广泛地被应用”日本和欧洲则把膜技术作为21世纪的基盘技术进行研究和开发。“谁掌握了膜技术，谁就掌握了化学工业的未来”-NormanN.Li，美国科学院院士，著名华裔科学家。膜分离已得到广泛应用。21世纪是工业生物技术的世纪，膜技术将扮演重要角色。一、膜分离的类型1、按推动力不同可分为：（1）加压膜分离：微滤（Microfiltration）、超滤（Ultrafiltration）、纳滤（Nanofiltration

）、反渗透（ReverseOsmosis）（2）电场膜分离：电渗析（Electrodialysis）（3）扩散膜分离：渗透（Osmosis）、透析（Dialysis）2、按膜孔径或截留物质的大小：微滤——超滤——纳滤、电渗析、透析——反渗透膜孔径大小类别截留颗粒大小截留的主要物质过滤介质粗滤>2μm酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等微滤0.2～2μm细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷超滤20Å～0.2μm病毒、生物大分子等超滤膜反渗透<20Å生物小分子、盐、离子(留下来的是超纯水）反渗透膜（海水的淡化处理）（一）微滤(MF)又称微孔过滤，是以微滤膜作为过滤介质的膜分离技术。（1）截留颗粒直径：0.2~2um。（2）操作压力：低于0.1MPa。（3）应用：实验室和生产中通常利用微滤技术除去或收集酶发酵液中的细胞。无菌水、矿泉水、纯生啤酒的生产。热敏性药物和营养物质的过滤除菌等.二、酶分离纯化中几种常见的膜分离技术细胞水盐大分子小分子（二）超滤(UF)可截留溶液中溶解的大分子物质，而透过小分子物质。（1）截留颗粒直径：10~200nm。（2）操作压力：0.1~0.7MPa。（3）应用：一是分离纯化，从高分子物质与低分子物质的溶液中，使低分子物质透过膜；二是溶液的浓缩。大分子水盐小分子纳滤膜主要用于截留粒径在2～10nm，分子量为1000左右的物质，可以使盐和小分子物质透过，操作压（0.5～1MPa）。其被分离物质的尺寸介于反渗透膜和超滤膜之间，但与上述两种膜有所交叉。（三）纳滤(NF)水盐小分子大分子（四）反渗透(RO)在压力作用下，溶剂（通常是水）透过膜，而溶质被阻挡于膜壁外。（1）截留颗粒直径：小于2nm。（2）操作压力：0.7~13MPa。（3）应用：主要用于分离各种离子和小分子物质。在酶液的浓缩、无离子水的制备、海水淡化等方面广泛应用。溶质水水膜溶质水水膜渗透反渗透水盐小分子大分子反渗透（RO）（五）电渗析在电场作用下，带电离子透过膜向两极移动，而达到分离的目的。酶液膜膜+-+-应用：电渗析主要用于酶液或其他溶液的脱盐、海水淡化、纯水制备等透析袋酶溶液蒸馏水应用：在生物分离方面，主要用于生物大分子溶液的脱盐。由于透析过程以浓差为传质推动力，膜的透过通量很小，不适于大规模生物分离过程，而在实验室中应用较多。（六）透析盐类水膜透析水膜渗透1、若除去酶溶液中的盐分，可采用下面哪种分离方式？（）

A、板框过滤B、微滤C、超滤D、反渗透2、若除去酶溶液中的生物小分子，可采用下面哪种分离方式？（）

A、板框过滤B、微滤C、超滤D、反渗透3、在采用微生物发酵生产壳聚糖酶时，若采用膜过滤的方法除去发酵液中的菌体细胞，可采用哪种膜分离方式？用生产所得的壳聚糖酶来降解壳聚糖生产壳寡糖时，反应完成后，可采用哪种膜分离方法除去反应液中的壳聚糖酶？练习：三、膜分离技术的基本流程渗出液膜组件料液罐浓缩液（回流液）泵中空纤维超滤器

中空纤维膜分离装置是将成束的中空纤维装入一筒内，两端封闭。当轴流通过管腔时，造成高剪切力，在截留溶质分子的同时，将浓度降至最低限度。每根中空纤维内腔直径为0.2mm,中空纤维由惰性的非离子聚合物制成．具有各向异性、抗堵塞性，运用成束纤维表面积大，流量大、阻留溶质的浓度范围(4％一20％左右)如右图。四、生产中常用的膜分离装置中空纤维超滤膜组件清洗液清洗液出口渗出液渗出液（c）五、膜及膜的使用性能（一）膜的结构膜表层：孔径各异，厚度为0.1~5um基层：起支持作用，厚度为50~250um主要有：陶瓷、微孔玻璃、不锈钢和碳素等。适用：微滤膜。特点：是机械强度高，耐高温、耐化学试剂和耐有机溶剂，但缺点是不易加工，造价较高。1、无机材料（二）制膜材料目前，实用的有机高分子膜材料有：纤维素酯类、聚砜类、聚酰胺类及其他材料。可用作反渗透膜、微滤膜和超滤膜。2、有机高分子材料（1）透水率（透水通量、流率）：是指在一定温度和压力条件下单位膜面积在单位时间内透过的水量。处理蛋白质（酶）溶液时，透水率常为纯水的10%。（2）截留率：是指溶液中某一溶质被膜截留量的百分数。酶超滤浓缩通常选用90%以上截留率的膜。（3）截留物相对分子质量：是指某种大分子如酶，在截留率达到某一指标情况下的被截留物的分子量。（三）膜的使用性能第五节离心技术（centrifugation）在酶分离纯化中的应用

离心是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分开的技术。（一）离心机分类低速离心机：＜8000r/min

用途：分离细胞、细胞碎片、培养基残渣及粗结晶等较大颗粒。高速离心机：8000~25000r/min

用途：分离各种沉淀物、细胞碎片及较大的细胞器等。超速离心机：＞25000r/min

用途：制备用超速离心机：分离纯化生物大分子、细胞器和病毒等。分析用超速离心机：测定样品纯度、沉降系数、相对分子量。实验室离心机温度类型：常温及冷冻超速离心机均为冷冻型。使用冷冻离心机时提前降温，预冷离心头，开盖关机。使用超速离心机时先抽真空。离心的形式

角式及外摆式：外摆式一般为低速，角式由低速到超速均有。角式离心机和离心头（转子）

角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作注意稳、盖、旋紧。离心机的大小：台式离心机的大小：落地式离心管材质：玻璃，塑料强度：和离心速度相配大小：和转子配套高速超速管要加盖离心机操作

平衡、定温、定速、定时。离心机其它类型

超速冷冻离心机

立式螺旋过滤离心机活塞推料离心机

碟片式离心机外形管式离心机三足离心机中小大1、差速离心采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒先后分离的方法。应用范围:大小和密度有较大差别的颗粒。2、密度梯度离心在离心管中用5~60%的蔗糖溶液，形成由管底到液面逐渐降低的梯度，将样品放在密度梯度溶液的表面，经过离心，不同大小、具有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成若干条不连续的区带。梯度介质：蔗糖密度梯度系统密度梯度的制备：密度梯度混合器3、等密度梯度离心当欲分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围时，在离心力的作用下，不同浮力密度的颗粒一直移动到与他们各自的浮力密度恰好相等的位置，形成区带。常用的离心介质：铯盐，如CsCl，Cs2SO4，CsBr先把一定浓度的铯盐溶液与样品液混合均匀，也可将一定量的铯盐加到样品液中使之溶解。在选定的离心力作用下，经过足够时间的离心分离。铯盐在离心力的作用下，在离心力场中沉降，自动形成密度梯度。样品中不同浮力密度的颗粒在其各自的等密度点位置上形成区带。（二）离心法测定蛋白质相对分子质量Mr—相对分子质量；R—气体常数，常取8.314J﹒mol-1﹒K-1；T—温度（K）；D—粒子在介质中的扩散系数（m2﹒s-1）；V—偏微比容（m3﹒kg-1）；ρo—介质密度。第六节层析技术（chromatography）在酶分离纯化中的应用一、色谱分离法色谱法是1905年俄国植物学家茨维特发明的。他将植物色素的石油醚提取液倒入一根装有碳酸钙的玻璃管顶端，用石油醚淋洗玻璃管，使色素出现分离，在管内显示出不同的色带，色谱一词由此得名。碳酸钙（固定相）石油醚（流动相）色谱柱二、基本操作过程层析柱的准备固定相材料的准备装柱平衡上样（洗涤和）洗脱收集洗脱液洗脱液检测，绘制洗脱曲线三、几种层析分离方法（一）吸附层析（adsorptionchromatography）利用物理吸附剂对不同物质吸附能力的不同而使混合液中各组分分离的方法。1、原理2、吸附剂的种类和特点（1）种类：活性氧化铝、硅胶、硅藻土、碳酸盐、活性碳、陶土、纤维素等。（2）特点：①来源丰富、价廉、可再生、吸附设备简单。②有些吸附剂使用前要预处理，以除去杂质，提高吸附力，增强分离效果。③上样时低pH值和低离子强度，半小时后提高pH值和离子强度洗脱。3、吸附的三个基本环节：加样、吸附、洗涤和洗脱。（二）离子交换层析（ionexchangechromatography）1、原理利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子亲和力不同而达到分离目的的一种分离方法。（1）根据母体不同可分为离子交换树脂：交换容量不大，易使酶失活离子交换纤维素：最广泛的一类离子交换凝胶：不耐高流速洗脱2、什么是离子交换剂?+++---母体可解离基团可解离基团母体（2）根据活性基团性质不同可分为阳离子交换剂：能吸附带“+”的离子或酶

-CM-（羧甲基）、-PO32-（磷酸基）、-SO3-（磺酸基）阴离子交换剂：能吸附带“-”的离子或酶

-DEAE（二乙基氨基乙基）、-TEAE（三乙基氨基乙基）3、离子交换反应蛋白质/酶在不同的pH条件下，将发生不同的离解作用，而带不同的电荷，选择相应的离子交换剂，同时要考虑被分离酶的稳定性。离子交换层析中常用的功能基团4、操作要点（1）离子交换剂的预处理：浸泡吸胀，再用HCl或NaOH交换处理，离子交换树脂和凝胶用2~3倍于树脂体积的2mol/L，离子交换纤维素用0.5mol/L酸、碱处理。（2）装柱：湿法装柱，离子交换剂上样前抽气泡。（3）平衡、加样：1%~5%上样量。（4）洗脱、收集：

梯级洗脱（分时段改变洗脱液的pH或盐离子强度）梯度洗脱（连续改变pH或盐离子强度）（5）再生：离子交换剂要再生，和预处理程序相同。练习1、下面哪一种不能作为离子交换剂用于分离纯化酶？（）A、DEAE-SephadexB、CM-CelluloseC、TEAE-SepharoseD、SephadexG502、某酶的等电点为6.8，若采用DEAE-纤维素进行离子交换分离，可选择下面哪种pH的缓冲液上柱？（）A、pH为5.0的缓冲液B、pH为6.8的缓冲液C、pH为8.0的缓冲液D、都不行（三)凝胶过滤层析（gelfiltrationchromatography）1、原理利用各组分分子量大小不同，从而在凝胶网孔中流速不同达到分离的目的。（1）混合物上柱;（2）洗脱开始，小分子进入凝胶内，大分子则被排阻于外;（3）小分子滞留，大分子向下移动，大小分子开始分开;（4）大小分子完全分开;（5）大分子行程较短，已洗脱出，小分子尚在行进中。2、常用的凝胶种类（1）葡聚糖凝胶SephadexG-X

X—表示每克干胶的吸水值的10倍吸水值越大，分离范围(分子量)越大近年来，有一些新产品推出，如Sephacryl-S和Sephadex-LH等交联型凝胶，具有很好的耐压性能。（2）琼脂糖糖凝胶

Sepharose

2B、4B、6B

2B、4B、6B表示琼脂糖含量为2%、4%、6%，浓度越高，凝胶网眼孔径越小，分部的大分子相对分子质量越小，范围越窄。琼脂糖分部的相对分子质量范围较葡聚糖宽广，上限达108，故适用于分离相对分子质量大的蛋白质（酶）。（3）聚丙烯酰胺糖凝胶（PAG）

Bio-GelP-2、4、6、…….、200、300，共10种型号。

P后的数字表示分离的最大相对分子质量（×103）。3、操作要点（1）装柱：装柱前要吸胀和抽气。常温吸胀需较长时间，可加热溶胀。（2）上样：加样量不超过3%。（3）洗脱：洗脱液应与平衡时的溶液一致。（4）再生：无须经过再生处理。（5）长期不用时，可加0.02%的NaN3保存。（四)亲和层析（affinitychromatography）1、原理

生物分子对间的专一而又可逆的结合力，称为亲和力，利用这种亲和专一性的特点，而制备专门的亲和吸附剂，用其进行蛋白质等生物分子的层析纯化，就是亲和层析，效率特别高。

酶—底物（包括酶的竞争性抑制剂和辅因子）特异性抗原—抗体激素—受体

DNA—互补的DNA或RNA

凝集素和糖蛋白载体配体臂待分离组分亲和吸附洗涤洗脱再生杂蛋白目的酶

亲和分离原理示意图2、亲和吸附剂由母体与配基偶联而成。配基：作为固定相的分子对的一方。母体：又称载体，如各种凝胶、纤维素均是惰性物，须先活化后再与配基反应。臂：如果载体与配基间的距离太近，往往需要加臂。载体配体臂亲和吸附剂3、操作要点(1)要先洗涤后洗脱,用含有与亲和吸附剂相同的高浓度配基或另一种配基洗脱。（2）柱床要再生

10倍于柱床体积的0.1mol/LNaCl-0.1mol/LTris-HCl

洗至pH8.5,改用0.5mol/LNaCl-0.1mol/LHAC洗至pH4.5,然后用纯水洗至中性.亲和层析法纯化胰蛋白酶

鸡蛋清

Sepharose4B

猪胰脏

↓↓↓提取↓活化

提取分离纯化↓↓↓纯卵粘蛋白(CHOM)→←活化Spharose4B

胰蛋白酶原粗提液↓↓

偶联

激活↓↓

CHOM-Spharose4B→←胰蛋白酶提取液↓

亲和层析↓纯胰蛋白酶↓环氧氯丙烷活化载体活化偶联亲和结合洗脱吸附层析离子交换层析凝胶层析亲和层析固定相物理吸附剂，如活性氧化铝磷酸钙胶体等离子交换凝胶离子交换纤维素离子交换树脂葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶（凝胶网孔内水为固定相）用琼脂糖或纤维素为载体共价结合适当的配基而成亲和吸附剂操作步骤特殊点无纤维素和凝胶类交换剂装柱时先抽气，柱床要再生后再上样湿凝胶抽气后湿法装柱上样后先洗涤除杂质然后洗脱，柱床要再生洗脱特点洗脱液离子强度比样品液高常用pH梯度或盐浓度梯度洗脱用样品和平衡缓冲液洗脱洗脱液含酶的配基或其他物质应用酶分离纯化成本较低离子交换纤维素洗脱条件较温和，酶分离纯化多用广泛用于酶分离纯化、脱盐、测定相对分子质量酶纯化效率高，但制备亲和吸附剂较麻烦，贵第七节电泳技术（electrophoresis）在酶分离纯化中的应用电泳的定义：

带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，这种现象称之为电泳(electrophoresis，简称EP)。电泳技术就是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的一类实验技术。1、聚丙烯酰胺凝胶（PAG）

PAG由丙烯酰胺（arc，单体）和甲叉双丙烯酰胺（bis，双体，交联剂）在催化剂作用下聚合而成。arc浓度：凝胶的孔径大小arc和bis的比例：凝胶的强度催化剂用量：聚合时间一、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）2、PAGE的应用类型常规PAGE浓度梯度PAGESDS不连续PAGE（用于一般分析分离纯化）连续PAGE（同上）（用于测定Pr相对分子质量和分离纯化）（用于测定Pr单体相对分子质量和双向电泳）√√√3、不连续PAGE的特性和分离Pr的效应（1）三个不连续凝胶浓度不连续；pH值不连续；缓冲液不连续。（2）三种效应浓缩效应；电荷效应；分子筛效应。4、浓度梯度PAGE

配制4%和30%的分离胶，用梯度混合仪制成从上至下4%~30%的均匀浓度梯度凝胶，其网眼孔径从上至下越来越小，电泳时，不同Pr主要依r大小而分离，即分子筛效应>电荷效应，可用于测定蛋白质的相对分子质量。5、SDSSDS：十二烷基硫酸钠

CH3（CH2）11SO4Na2

在配制凝胶时加入SDS，同时加巯基乙醇，Pr在电泳时，其中的寡聚体Pr解聚为单体（亚基），SDS分子就将每个单体分子表面覆盖起来，使其形成短轴为1.8nm，而长轴各异的SDS—亚基复合物，电泳时，他们的表面电荷基本相同，故可因分子长轴大小（即亚基分子大小）差别而分离，换言之，亚基的大小是彼此分离的依据，所以此法可用于测定单体的相对分子质量。6、PAGE的一般操作程序配制各种制胶的贮存液准备制胶模具配制铸胶混合液灌注胶液并聚合成凝胶上槽点样通电电泳取出凝胶Pr染色漂洗显带记录计算绘制电泳图谱

SDS测定蛋白质（亚基）的相对分子质量（Mr）与它们的电泳迁移率（U）之间，存在如下关系：

lgMr=lgK

-bU

用lgMr

对U作图，只要实验测得，就可用标准曲线法求得未知蛋白质（亚基）的相对分子质量。实际工作中，常用相对迁移率（用mR

表示）代替U作图。mR=蛋白质移动的距离溴酚蓝移动的距离二、等电点聚焦电泳（IsoelectricFocusing，IEF）

等电点聚焦电泳是在电泳介质中加入两性离子载体，电泳时形成由阳极到阴极的连续递增的pH梯度，蛋白质按其电荷性质不同各自向着与其等电点相等的pH处移动聚焦，从而彼此分离的电泳技术，无论Pr从正极出发或是从负极出发，都会聚焦在等电点处。高pH等电聚焦电泳进行过程中低pH（＋）（＋）高pH等电聚焦电泳结束后低pH（－）（－）1、等电点聚焦电泳分离Pr原理2、两性电解质载体

各组分的pI值十分接近，在电泳中可以形成连续的pH梯度，常用的商品名为Ampholine，规格有pH3.5~9.0和精细分级的pH3.5~5、5~9、9~11的多种商品可供不同的要求使用。由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。

液体介质3、支持pH梯度的介质两性电解质载体在蔗糖密度梯度柱中形成pH梯度。凝胶介质两性电解质载体在凝胶内形成pH梯度。凝胶中加有两性电解质溶液（pH9-3）

加电场后在凝胶内形成一个稳定pH梯度

加样品，然后继续电泳凝胶染色表明样品按照各自pI值沿着pH梯度分布第八节萃取分离（extraction）双水相萃取超临界萃取反胶束萃取内容：一、液-液双水相萃取(AqueousTwoPhaseExtraction)

液-液双水相法萃取酶，是近年来兴起的一项新型分离技术，特别适用于从含有菌体等杂质的酶液中直接萃取目的酶。此法可以除去大部分多糖、核酸等可溶性杂质，具有一定的纯化效果。

液-液双水相法的两相分别为互不相溶的两个水相。利用溶质在两个互不相溶的水相中的溶解度不同而达到分离。（一）双水相系统的形成(aqueoustwo-phasesystem,ATPS)

由于两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用（不相容性），一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。除双聚合物系统外，聚合物与无机盐的混合溶液也可形成双水相。PEG=聚已二醇(polyethyleneglycol)Kpi=磷酸钾DX=葡聚糖(dextran)（二）双水相系统的选择两种高聚物一种高聚物和一种无机盐两种非离子型高聚物：一种离子型和一种非离子型高聚物两种聚电解质聚乙二醇/葡聚糖羧甲基葡聚糖钠盐/羧甲基纤维素钠PEG/磷酸钾、PEG/硫酸铵（三）双水相系统萃取酶的优点1、用于直接从胞内酶的细胞匀浆液中分离纯化酶，较方便，无需除去细胞碎片。2、大规模双水相萃取操作一般在室温下进行，无需低温操作。3、可从实验室直接放大到产业化规模。双水相分离细胞碎片和酶的流程：双水相法分离酶的过程示意图1－细胞悬浮液；2－细胞破碎机；3－萃取器；4－PEG；

5－无机盐；6－离心机；7－含目标产物的上清液；8－含细胞碎片的下相二、超临界萃取(SupercriticalFluidExtraction

)

超临界萃取，是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术。超临界流体是指超过临界温度与临界压力状态的流体。1、什么是超临界流体（SupercriticalFluid，SCF）?CO2的临界温度（Tc）：31.1℃，临界压力（Tc）：7.38MPa。2、超临界流体的性质（1）密度接近于液体，这使它具有与液体溶剂相当的萃取能力。（2）黏度和扩散系数与气体相近似，而溶剂的低黏度和高扩散系数的性质是有利于传质的，具有很高的传质速度。（3）该流体随着温度与压力的连续变化，对物质的萃取具有选择性。气体、超临界流体和液体性质的比较性质相态气体超临界流体液体密度/g·cm-310-30.71.0黏度/cP10-3~10-210-210-1扩散系数/cm2·S-110-110-310-5超临界流体是指在31.1℃和13.78MPa时的CO2。3、超临界流体萃取（Supercriticalfluidextraction，SFE）（1）超临界流体萃取技术（SFE）是利用超临界流体（SCF）作为萃取剂，从液体或固体中萃取出特定成分，以达到某种分离目的的技术。

CO2由于具有合适的临界条件，对健康无害，不燃烧，不腐蚀，价格便宜和易于处理等优点，是最常用的超临界萃取剂。①可以在接近室温下进行提取，有效地防止了热敏性物质的氧化和逸散。②CO2是一种不活泼的气体，萃取过程中不发生化学反应，且属不燃性气体，无味，无毒，安全性非常好。③CO2气体价格便宜，纯度高，容易制取，且在生产中可以重复循环使用，从而有效地降低了成本。④分离工艺流程简单。⑤萃取效率高，过程易于调节。（2）超临界CO2萃取的优点（3）超临界流体萃取的应用医药工业化学工业食品工业化妆品香料中草药提取酶，纤维素精制金属离子萃取烃类分离共沸物分离高分子化合物分离植物油脂萃取酒花萃取植物色素提取天然香料萃取化妆品原料提取精制4、超临界流体萃取流程萃取阶段:在超临界状态下，超临界流体与原料接触进行萃取获得萃