生物化学技术补充吸收光谱分析法

生物化学技术补充吸收光谱分析法第1页，共23页，2023年，2月20日，星期一概念及分类概念利用各种化学物质具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征，来确定物质性质、结构或含量的技术分类（根据物质对光谱响应特征的不同，可将其分为）发射光谱分析技术吸收光谱分析技术散射光谱分析技术在生化技术方面，光谱分析是一类十分重要的技术，应用极为广泛；它既可以研究物质的结构，也可以对特定物质进行定性或定量分析

第2页，共23页，2023年，2月20日，星期一一、吸收光谱分析法

吸收光谱是指波长连续分布的光透过物质时，某些波长的光被物质吸收而产生暗线或暗带组成的光谱吸收光谱分析法

利用吸收光谱对物质进行定量的技术称为吸收光谱分析法，是实验室最常用的分析技术之一特点它操作简便、快速，线性范围较宽，应用广泛分类目前最常应用的技术有可见—紫外分光光度法和原子吸收分光光度法

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(一)可见-紫外分光光度法

1.原理

L-B尔定律

（可见-紫外光区波长为200~760nm，其中200~400nm为紫外光）2.方法

①对比法

②标准曲线法第4页，共23页，2023年，2月20日，星期一第5页，共23页，2023年，2月20日，星期一3.排除干扰的方法

当两种或两种以上的组分共存时，可出现吸收光谱重叠的情况；测定某一组分时，其他组分对它会有不同程度的干扰，此时可采用双波长法排除杂质的干扰吸收光谱相互重叠的a、b两组分。选择各自的测得波长λ1和λ2，使干扰组分在这两个波长处的吸光系数相同，而欲测组分在两波长处的吸光系数有显著的区别。用这样两个波长测得混合物溶液的吸光度差值ΔA，只与欲测组分的浓度成正比，而不受共存组分的影响第6页，共23页，2023年，2月20日，星期一第7页，共23页，2023年，2月20日，星期一

在测得波长λ1和λ2处测得混合物的吸光度分别是A1a+b和A2a+b，则ΔAa+b=A1a+b-A2a+b=A1a+A1b–A2a–A2b=ΔAa+ΔAb

因组分a在λ1和λ2处的吸光系数相等，即

欲测组分b在两波长处的吸光系数相差愈大，则灵敏度愈高。用双波长法还能消除样品溶液背景吸收的干扰和混浊的干扰，提高测定的准确性。近年来由于新的、灵敏度高、选择性好的显色剂和掩蔽剂不断出现，一般不经分离过程即可直接比色测定；还可采用联立方程法、等吸收点法等解决定量中的干扰问题第8页，共23页，2023年，2月20日，星期一

3.分光光度计的光源检查和波长校正

(1)光源检查即波长的初步检查不论何种分光光度计在校正之前都要先检查光源。检查方法是将波长选定在580nm处，将狭缝开到最大(或打开光门)，打开钨灯，在比色皿内插一白纸片。光源正常时，应看到均匀的黄色光斑，边缘清晰整齐；如果明暗不匀，形状异常，则应调节光源灯的位置第9页，共23页，2023年，2月20日，星期一常用的方法有①用含某些特定元素的玻璃来较正最常用的有镨钕玻璃、钬玻璃等。校正时将这种玻璃放在比色皿座上，以空气调0，测定几个吸收峰值的波长是否相符。如最常用的测定镨钕滤光片在585nm的杂光水平应在5%以内②可利用某些标准溶液进行校正如标准重铬酸钾溶液(在1000ml的0.05mol／L的KOH溶液中溶解0.0400g纯重铬酸钾．(K2CrO4))，在25℃以1cm比色皿在各波长测定其标准吸光度，如表2~1。重铬酸钾溶液的优点是在紫外区270nm及370nm处有两个最大吸收(2)波长校正第10页，共23页，2023年，2月20日，星期一第11页，共23页，2023年，2月20日，星期一(二)原子吸收分光光度法1.原理基于光源辐射出具有待测元素特征谱线的光，通过原子化器被其中待测元素的基态原子所吸收，根据吸收而导致辐射特征谱线光被减弱的程度来测定待测元素的含量2.方法标准曲线法、直接比较法和标准加入法主要用于钙、镁、铜、铅、锌等微量元素的测定3.原子吸收分光光度计结构特点有单光束型和双光束型两类。主要由光源、原子化器、单色器和检测系统组成第12页，共23页，2023年，2月20日，星期一

在微量元素测定中，首先根据有关资料了解仪器待测元素的灵敏度和检出限

①对灵敏度达不到要求的可以选择最灵敏的吸收线，选用小的狭缝宽度，采用较小的灯电流和最佳火焰类型及状态等来提高灵敏度

②测定物质溶解后干扰要小，易于喷雾和原子化，稀释后测定结果应在线性范围内

③仪器通电后要预热30min，使光源的发射稳定。狭缝的宽度影响光的谱带宽度与检测器的接受能量，使用较宽的狭缝可以增加光强度，提高信噪比，改善检出限

④当吸收线附近有干扰谱线与非吸收光存在时，使用较宽的狭缝会降低灵敏度。在火焰化法中，火焰的类型是影响原子化效率的主要因素。因此，需通过调节燃气与助燃气的流量获得最佳原子化条件，以达到最高的测定灵敏度总之，一种元素的原子吸收法测定需要考虑仪器工作的各种条件，以期达到实验的最佳结果

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二、发射光谱分析法基本概念荧光

某些物质吸收了一定波长的光能后，独自从基态跃迁到激发态，此类分子经与同类或其他类分子相互碰撞，消耗相当，而下降至第一电子激发态的最低振动能阶。最低能阶下降到基态，同时发射出较原来所吸收的频率低、波长长的光能，称为荧光荧光分析法

对荧光物质进行定量测定的方法发射光谱分析法分类荧光分析法火焰光谱法第14页，共23页，2023年，2月20日，星期一(一)荧光分析的基本原理

1.原理

利用元素的原子所发射的共振荧光波长的差异，可确定元素的种类或物质分子中某种结构，据荧光的强弱可以测定物质的含量2.方法

荧光分析定量是基于荧光物质的稀溶液，在一定的温度下，当激发光的波长、强度、荧光测定波长以及液层厚度一定时，所测得的荧光强度F与该溶液中荧光物质的浓度C成正比，即F=kC。采用标准曲线法或标准对照法，对荧光物质进行定量。在一定条件下，荧光物质的浓度愈大，发射的荧光强度也愈强（荧光分析的灵敏度比分光度法高，通常可达10-13g／L，对特定物质甚至可达到10-15g／L）第15页，共23页，2023年，2月20日，星期一(二)影响荧光分析的因素1.溶剂配制溶液的溶剂除水外，常用的乙醇、环己烷、四氯化碳、氯仿、丙酮等溶剂中常含有荧光杂质，影响测定，必须经过重蒸馏等净化处理才能使用2.荧光物质的浓度

荧光强度与溶液的线性关系只限于很稀的溶液，符合下列方程：F=kCI0，式中F为荧光强度，C为溶液的浓度，I0为激发光强度，k为荧光效率。对于较浓的溶液，荧光强度并不随浓度增大而增加，相反，却随溶液浓度增大而下降。①当荧光物质浓度高时，分子间碰撞增加，使荧光强度减弱；另外，②浓度较大时，激发光被表面的荧光物质所吸收，产生强烈的荧光，以致使后面的溶液不易受照射而不发光3.温度大多数情况下，温度升高，分子间碰撞次数便增加，消耗分子的内部能量而产生自熄灭现象；温度降低时，则荧光强度增大

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(三)荧光分析技术的应用

荧光分析法灵敏度高、取样量少，广泛应用于各领域，在生化技术领域主要用于糖类、胺类、甾族化合物、DNA与RNA、酶与辅酶、维生素等物质的分析

测定荧光强度常用荧光分光光度计，它主要包括激发光源、一对单色器、比色杯和检测器等部件

第17页，共23页，2023年，2月20日，星期一荧光物质的激发光谱和荧光光谱

第18页，共23页，2023年，2月20日，星期一激发光谱与荧光光谱激发光谱（吸收光谱）

荧光物质吸收紫外光后被激发出荧光，如果将激发光的光源用单色器使其分光后，测定在每一波长的激发光照射下，物质发射的荧光，以荧光强度对激发光波长作图，得到荧光物质的激发光谱荧光光谱（发射光谱）

如果使激发光的波长和强度保持不变，而让物质所发生的荧光通过单色器色散，依次将不同波长的荧光照射到单色器上，并依次测定其荧光强度，然后以荧光强度对相应的荧光作图，得到该物质的荧光发射光谱第19页，共23页，2023年，2月20日，星期一三、散射光谱分析法散射光谱分析法

测定光通过溶液混悬颗粒后的吸光度或光散射程度的一类定量方法散射比浊法

是指一定波长的光沿水平轴照射，通过溶液时遇到抗原抗体复合物粒子，光线被粒子颗粒折射，发生偏转，光线偏转的角度与发射光的波长以及抗原抗体复合物颗粒大小、数目密切相关。散射光的强度与复合物的含量成正比透射比浊法

是测定一定体积的溶液通过的光线量(光通量)，当光线通过时，由于溶液中存在抗原—抗体复合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光的减少，测得的光通量和抗原抗体复合物的量成反比第20页，共23页，2023年，2月20日，星期一发射光谱分析法

(一)散射免疫比浊分析1．散射颗粒与散射光的关系

悬浮在反应溶液中的分子，无论是固体还是胶体粒子都可以是散射中心。当入射光通过时，如果颗粒直径比入射光的波长小很多，则散射光比较均匀的分布于颗粒的四周，称为Rayleigh散射；如果颗粒直径远远地大于入射光的波长，则散射光的分布呈明显不匀称为Mie散射第21页，共23页，2023年，2月20日，星期一2.反应物含量与散射浊度抗原—抗体结合反应中，遵守典型的Heidelberger曲线第22页，共23页，2023年，2月20日，星期一(二)免疫透射比浊分析原理