转基因肿瘤动物模型的研究进展培训课件

转基因肿瘤动物模型的研究进展全世界恶性肿瘤发病率和死亡率均呈增加的趋势加快肿瘤病因和发病机制的研究以及探索有效的肿瘤治疗新方法显得尤为重要利用转基因技术建立人类肿瘤疾病的转基因动物模型，研究外源基因在整体动物中表达的调控规律，从而对揭示人类肿瘤的病因、发病机制和治疗学研究将会起到极大的促进作用。

原癌基因是细胞的正常基因，其表达产物对细胞的生理功能极其重要，只有当原癌基因发生结构改变或过度表达时，才有可能导致细胞癌变。抑癌基因，正常时起抑制细胞增殖和肿瘤发生的作用。许多肿瘤均发现抑癌基因的两个等位基因缺失或失活，失去细胞增生的阴性调节因素，从而对肿瘤细胞的转化和异常增生起作用。

原癌基因的结构改变形式与其表达激活（一）点突变C--ras：12、13、61位密码子点突变，存在于多种肿瘤．（二）染色体易位染色体易位（translocation）：是染色体的一部分因断裂脱离，并与其它染色体联结的重排过程。因染色体易位造成的原癌基因激活：1、因易位使原癌基因与另一基因形成融合基因，产生一个具有致癌活性的融合蛋白，如t（9：22）使c-abl与bcr融合，产生一个致癌的P210蛋白。2、因易位面使原癌基因表达失控，如t（8：14）易位使c-myc表达失控．（三）基因扩增基因扩增（geneamplification）即基因拷贝数增加．如HL-60和其它白血病细胞，C-myc扩增8-22倍．一.常用的转基因技术。显微注射法逆转录病毒感染法精子载体法体细胞核移植（克隆）法胞质内精子微注射介导胚胎干细胞法1.显微注射法2.逆转录病毒感染法反转录病毒（Retroviruses）作为转基因载体是目前应用较成功的一种基因转移方法。利用反转录病毒的LTRs（长末端重复序列）区域具有转录启动子活性这一特点，将外源基因连接到LTR下部进行重组后，再使之包装成为高滴度病毒颗粒，去直接感染受精卵或徽注入囊胚腔中，携带外源基因的反转录病毒DNA可以整合到宿主染色体上。

在构建重组质粒pcDNA3.1-HBx和pEGFP-N1-Kras的基础上，采用直接注射的方法，将脂质体包裹的重组质粒注入动物睾丸中，探讨利用睾丸内生精小管微注射精子载体法建立转HBx、突变Kras基因树鼩的可行性，为建立转HBx、突变Kras基因树鼩肝癌动物模型并进一步研究两种基因在肝细胞癌发生发展过程中的作用打下基础。共获得HBx基因阳性动物3只(单独注射组2只，联合注射组1只)，EGFP基因阳性动物1只(联合注射组)。对活检肝组织进行常规HE染色和免疫组化检测，显示3只树鼩(E9478、E9242、E9256)部分肝细胞有HBxAg阳性颗粒分布。两只树鼩(E9260、E9252)活检肝组织出现EGFP蛋白表达。4.体细胞核移植2007年英国宣布，批准科学家将人类与动物细胞混合起来制造胚胎并用于医学研究的计划

他们的计划是，从特殊病人的皮肤细胞中提取细胞核，植入剔除了细胞核的牛或兔子的卵细胞中，制造出一个杂交胚胎细胞。该计划的科学家表示，一旦胚胎细胞混合成功，他们会从中提取干细胞，随后立即把胚胎细胞毁灭，绝不允许其存活超过14天。从胚胎中提取未经完全发育的干细胞，能培育出各种人体组织，用于治疗白血病、帕金森氏症、阿尔茨海默病、心脏病和器官衰竭等病症。由于具有细胞提供者本人的基因特征，因此病人接受移植后不会产生异体排斥反应，具有很高的医学价值。

5.胞质内精子微注射介导的转基因Anthony等（1999）尝试预先将小鼠精子进行破膜处理，与编码绿色荧光蛋白GFP或B－半乳糖苷酶报道分子的外源DNA短时间（1min）共孵育，然后徽注射入减数分裂II期的卵母细胞质中，取得64%——94%转基因表达胚胎，并揭示精子与外源DNA在注射前已结合。将转GFP的胚胎移植，20%的后代表现为基因整合，此项研究揭示，精子膜经冷冻干燥或解冻处理后，外源DNA可穿过外膜，吸附于内膜。因此外源DNA能通过精子的徽注射有效转入卵母细胞。经膜处理精子胞浆微注射法结合了原核显微注射和精子载体法各自的长处。6.胚胎干细胞法胚胎干细胞（ES细胞）是指囊胚期的内细胞团中尚未进行分化的细胞，具有类似癌细胞无限繁殖和高度分化的潜能。通过段显微注射、逆转录病毒感染或电穿孔把外源基因导人细胞,再筛选出基因转化的细胞,注射人宿主囊胚,它们可整合到宿主胚胎,参与胚胎发育,最后嵌合到宿主动物体内的各组织器官中,形成转基因嵌合动物。ES细胞介导法是和基因定位整合相结合的方法，可克服外源基因随机整合带来的弊端，而且可在体外条件下对外源基因的表达进行筛选。二.可用于建立肿瘤动物模型的动物品系。理想的肿瘤动物模型应具备以下条件：1.动物模型与人类肿瘤的生物学行为相同或相似。2.动物易得易养且价格低廉，动物大小、体型、寿命、繁殖周期等适合所做的实验研究。3.动物模型构建技术方法简单可行，实验周期适合。4.动物模型成熟稳定且可重复性好，转基因效率高且死亡率低。目前用于研究的实验动物分为以下几类：1.啮齿类：大鼠、小鼠、豚鼠、土拨鼠等2.畜类哺乳动物：兔、狗、牛、羊、猪等3.禽类：鸡、鸭、鹌鹑等4.鱼类：斑马鱼、新月鱼、金鱼、罗非鱼等5.非人灵长类：猩猩、狒狒、猴子、类人猿等6.其它：树鼩等三.已建立的人类肿瘤转基因动物模型。目前构建转基因肿瘤动物模型主要采取以下途径：1.直接将癌基因及促进肿瘤发生发展的基因转入到动物体内，使目的基因在特定组织表达或非特异性表达。2.转入肿瘤血管生成调控基因，从基因水平调控肿瘤血管生成。3.转入肿瘤转移促进基因，主要是金属基质蛋白酶类基因。4.转入肿瘤细胞耐药相关基因。1980年Gordon等首次用显微注射法将外源基因注入小鼠受精卵，成功获得了转基因小鼠。目前已有多种转基因鼠模型应用于肿瘤形成的研究。转HBx基因小鼠动物模型，已有研究证实HBx转基因的单独表达能诱导小鼠肝癌的形成。转HBV超长序列小鼠动物模型，将HBV基因组全长的HBVDNA导入小鼠受精卵，能建立复制出完整HBV并产生病毒血症的复制型HBV转基因小鼠，转移的HBV基因能稳定穿代。转ras基因小鼠动物模型，K-ras突变是胰腺癌发生的起始事件，但单一的K-ras作用下发生瘤变的潜伏期很长且极少发展为PDAC,说明肿瘤进展仍需其他的加速基因。Ijichi等将K-ras突变与Ⅱ型TGFB受体的敲除结合起来，导致小鼠肿瘤的外显率为100%，且肿瘤病理特征非常接近人类胰腺导管腺癌转基因家兔肿瘤模型已有报道，Knight等制作了携带EJ-ras基因和兔乳头瘤病毒DNA的转基因家兔。表达人类原癌基因的转基因家兔模型已被应用于研究人类肿瘤发生机制、寻找预防和治疗措施。转基因树鼩肿瘤模型，在构建重组质粒pcDNA3.1-HBx和pEGFP-N1-Kras的基础上，采用直接注射的方法，将脂质体包裹的重组质粒注入动物睾丸中，探讨利用睾丸内生精小管微注射精子载体法建立转HBx、突变Kras基因树鼩的可行性，为建立转HBx、突变Kras基因树鼩肝癌动物模型并进一步研究两种基因在肝细胞癌发生发展过程中的作用打下基础。

4.发展方向及展望。众多新技术在肿瘤动物模型中的应用为肿瘤研究带来了革命性的变化，大量肿瘤动物模型的建立使我们可以深入研究肿瘤的生物学行为。一个