微生物学：第七章微生物的遗传和变异课件

第七章微生物的遗传变异遗传变异的物质基础微生物的基因突变基因重组微生物遗传变异知识的应用菌种的衰退复壮和保藏内容提要遗传和变异是生物体最本质的属性之一。在遗传性适宜的环境条件下时，子代与亲代性状相似的现象叫遗传。子代与亲代或子代之间性状不同的现状叫变异。对微生物遗传变异规律的深入研究，不仅促进了现代生物学的发展，而且还为微生物育种工作提供了丰富的理论基础。1、经典转化实验Griffith是第一个发现转化现象的，虽然当时还不知道称之为转化因子的本质是什么，但是他的工作为后来Avery等人进一步揭示转化因子的实质，确立DNA为遗传物质奠定了重要基础。（一）核酸－－遗传变异的物质基础（3个经典实验）转化实验材料方法动物实验细菌培养实验S型菌无细胞抽提液试验光滑型（S）粗糙型（R）有荚膜菌落光滑分泌毒素致病无荚膜菌落粗糙无毒不致病SⅠSⅡSⅢ三个血清型RⅠRⅡRⅢ三个血清型实验材料：肺炎双球菌活的S菌加活R菌和热死S菌抽血分离死加活S菌死加活R菌或死S菌活转化实验（1）动物实验大量R菌落活R菌S菌无细胞抽提液+活R菌+S菌DNAS菌落转化实验（3）S型菌无细胞抽提液试验S菌PrS菌多糖R菌落活R菌+噬菌体感染实验Pr只含S不含PDNA只含P不含S原理步骤1：用含同位素Ｓ35,

P32的培养基培养大肠杆菌吸附10分钟后搅动离心上清液沉淀结果：上清液中含15%放射击性；沉淀中含85%放射性2：让T2感染上述大肠杆菌使其打是S35P32标记3：TMVHRVHRVTMV原始株拆开重建感染分离纯化

植物病毒的重建实验

七个水平细胞水平细胞核水平染色体水平核酸水平基因水平密码子水平核苷酸水平三遗传物质在细胞内的存在部位和方式基因突变染色体畸变第二节、微生物的突变DNA损伤的修复突变的特点

基因突变突变的机制

突变类型微生物突变体的主要类型形态突变型菌落形态突变型菌体形态突变型生化突变型营养突变体(营养缺陷型)发酵突变体抗性突变体条件致死突变体抗原突变型产量突变型按突变实质分毒力突变型致死突变型（二）基因突变的特点(5个特点)1随机性2稀有性3独立性4稳定性5可逆性大肠杆菌稀释培养物10ml10ml(培养前先分成50小管)(在同一个大管中作整体培养)

3714435抗噬菌体菌落数抗噬菌体菌落数变量试验

涂布试验涂布敏感菌5×104个共12个平板5×104个菌落5000个细菌/菌落喷入T1保温重新涂布后喷入T1保温6个平板共353个菌落6个平板共28个菌落无药培养基含药培养基影印培养试验原始敏感菌种一对碱基被另外的一对碱基置换。转换(transition)：即DNA链中的一个嘌呤被嘌呤或嘧啶被嘧啶所置换。颠换(transversion)：即一个嘌呤被嘧啶或嘧啶被嘌呤所置换。1诱变的机制(1)碱基的置换碱基的置换直接引起置换的诱变剂HNO2CNH2腺嘌呤CO次黄嘌呤(Hk)A..THe..THk..

THk..

CA..THk..

CG..

CCOH次黄嘌呤(He)碱基的置换G..

CA..BUG..

BUA..BUG..

CA..TA..TA..TA..TG..

CA..BU酮式G..BU烯醇式烯醇式酮式移码突变ＤＮＡ分子中缺失或增加少数几个碱基对而引起造成突变点以后全部遗传密码转录与转释发生错误ABCABCABCABCABCABCABCABCAB+ABCABCCBACBACBACBACBAABCBCABCABCABCABCABCABCA增添一个碱基缺少一个碱基碱基的置换

染色体畸变

某些理化因子，如Ｘ射线，紫外线，亚硝酸等，除能引起点突变外，还会引起DNA分子大损伤，包括染色体易位，倒位，缺失，重复等，即为染色体畸变。染色体畸变紫外线诱变作用机理可使ＤＮＡ链裂断，破坏核糖和磷酸间的键联引起胞嘧啶和尿嘧啶产生水合作用造成氢键断裂能使胸腺嘧啶成二聚体，使ＤＮＡ结构发生改变转座因子(transposibleelement),跳跃基因(jumpinggene)在染色体组中或染色体组间能改变自身位置的一段DNA顺序。染色体畸变插入序列(insertionsequence)：分子量小，0.7~1.4kb，只能引起转座效应而不含其它任何基因。转座子(Tn,transposon)：分子量为2~25kb，含有几个到十几个基因。能插到受体DNA分子的许多位点上。Mu噬菌体(mutatorphage)：是E.Coli的一种温和噬菌体，分子量大，约37kb，含20多个基因，可以引起插入突变。DNA的损伤修复♦DNA的损伤：DNA在复制时产生错配、病毒基因整合，某些物化因子如紫外光、电离辐射和化学诱变等，破坏DNA的双螺旋结构，从而影响DNA的复制，并使DNA的转录和翻译也跟着变化，因而表现出异常的特征（生物突变）。♦若DNA的损伤或错配得不到修复，会导致DNA突变。其主要形式：一个或几个碱基被置换插入一个或几个碱基一个或多个碱基对缺失♦DNA的损伤修复——5种修复途径:错配修复、光复活修复、切除修复、重组修复和诱导修复（亦称暗修复）。光复活修复：400nm左右的光激活光复活酶，专一分解紫外光照射引起的同一条链上的TT（或CC，CT）二聚体。（包括从单细胞生物到鸟类，而高等哺乳动物无）切除修复：将DNA分子中的受损伤部分切除，以完整的那条链为模板再重新合成。特异内切酶、DNA聚合酶、DNA外切酶、DNA连接酶均参与。（发生在DNA复制前）重组修复（发生在复制后）：复制时，跳过损伤部位，新链产生的缺口由母链弥补，原损伤部位并没有切除但在后代逐渐稀释。诱导修复：造成DNA损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应,称为应急反应(SOS

response)。此过程诱导产生切除修复和重组修复中的关键蛋白和酶，同时产生无校对功能的DNA聚合酶。所以会有2种结果：修复或变异（进化）。细菌的基因重组原核微生物通过转化、接合、转导、原生质体融合等形式进行一部分物质转移和基因重组。转化(transformation)

几个概念：转化、转化因子、感受态转化过程转化的特点转化(transformation)

受体细胞直接吸收了来自供体细胞的DNA片断，并把它整合到自己的基因组中，细胞部分遗传性状发生变化的现象叫转化。转化因子转化是游离的ＤＮＡ片断的转移和重组游离的ＤＡＮ片断叫转化因子转化因子由供体提供自然情况下可由细菌细胞自行裂解产生，实验室里通过提取获得双链ＤＮＡ有转化能力，单链没有.受体细胞能接受转化的生理状态称为感受态，只有处于感受态的细菌才能接受转化因子，从出现到消失约为４０分钟(对数期的中期)感受态感觉态出现原因细菌失去部分细胞壁的结果细菌在细胞表面产生某种Ｅ引起感受态的决定决定因素细胞遗传性决定和菌龄有关环腺苷酸CAMP可提高1000倍Ca2+能促使细胞进入感受态感受态因子是受体细胞表面上的一种蛋白质功能使转化因子结合在受体细胞表面每个受体细胞表面约有30

-80个转化因子结合点，当转化因子结合到受体表面结合点上时，DNA一条链被受体细胞膜上的核酸酶分解，另一条链进入受体细胞，通过整合与受体细胞进行基因重组，有人发现DNA也可通过双链形式进入受体细胞形成双倍体的转化子。转化过程转化过程转化的特点

不需两个细胞直接接触，供体DNA提取出来，注入受体即可。转导的种类完全普遍转导流产普遍转导局限转导溶源转变遗传物质通过噬菌体的携带而转移的基因重组转导的发现

转导(transduction)转导的特点

供体A-B+完全普遍性转导(compietetransduction)A-B+A+B-少数受体A+B+经重组形成转导子鼠伤寒沙门氏菌A-B+色氨酸缺陷型A+B-组氨酸缺陷型galbiogalbio宿主基因组整合不正常切离（10-4—10-6）正常切离λ正常λλdgalλdbio低频转导（LFT）裂解物的形成局限转导转导的特点

需要噬菌体做媒介，不需要细胞间直接接触噬菌体DNA不接合到寄主染色体噬菌体蛋白质包裹寄主任何一部分DNA片段噬菌体DNA整合到寄主染色体上噬菌体DNA与寄主染色体特定基因发生交换普遍性转导局限性转导接合及其发现Ｆ因子和接合接合(conjugation)雄性菌株与雌性菌株接合结果+A+B+C-D-维甲缺陷型A-B-C+D+苏缺赖陷型接合及其发现A+B+C+D+通过细胞间的直接接触能进行大段ＤＮＡ的转移的过程，叫接合雄性菌株

Hfr菌株

F́́菌株Ｆ－菌株（雌株）Ｆ因子和接合

F+菌株F-×F+F+F++F-×+F’F’F’×+HfrHfrF+（多数情况下）F-×+HfrHfrHfr（少数情况下）雄性菌株与雌性菌株接合结果F-三者根本区别在于DNA转移的方式不同转化：供体DNA片断→注入受体细胞，通过细胞膜接合：供体进入受体通过性纤毛转导：供体DNA片断通过媒介－噬菌体携带进入受体(四)原生质体融合

通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程，称为原生质体融合或细胞融合。原生质体融合的一般原理和主要过程先准备两个有选择性遗传标记的突变株，在高渗溶液中，用适当的脱壁酶(如细菌可用溶菌酶或青霉素处理，入线菌可用溶菌酶或相应的脱壁权衡利弊，真菌可用蜗牛酶或相应的脱壁酶等)去除细胞壁，再将形成的原生质体离心聚集，并加入促融合剂PEG(聚乙二醇)促进融合，然后在高渗溶液中稀释，涂在能使其再生细胞壁或进行分裂的培养基上，待形成菌落后，通过影印接种法，将其接种到各种选择性培养基上，最后鉴定它们是否是重组子溶源转变温和噬菌体的基因整合到宿主核基因组上的现象温和噬菌体并不携带外源供体菌的基因这种温和噬菌体是完整的，而不是缺陷的获得新性状的是溶源化的宿主细胞，而不是转导子获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失染色体外遗传因子的转移与重组一、质粒转移性质粒、非转移性质粒二、细菌转座因子插入序列：只含有编码转座所必需的基因转座子：含有编码转座所必需的基因和其他抗性基因转座噬菌体：温和噬菌体（一）有性杂交（二）准性杂交菌丝联结异核体的形成形成双倍体分离子的产生第四节、真核微生物的杂交育种遗传变异知识的应用自发突变与育种从生产中选育定向培育优良品种诱变育种从青霉素产量看诱变育种诱变育种的基本环节诱变育种的原则诱变育种的定义诱变育种

诱变育种就是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变频率大幅度提高，然后设法采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的突变株，以供生产实践或科学实验之用。诱变育种除提高产量外，还可改进产品质量、扩大品种和简化工艺等目的。它具有方法简便、工作速度快和收效显著等优点，仍是目前最广泛使用的育种手段。效价：指有效成分的浓度。1ug/ul称为1单位1945时间1943194319431947195519711977目前发酵单位(u/ml)100250500～850～850～8000～2万～5万5～10万从青霉素产量看诱变育种诱变育种的基本环节大多死亡少数存活存活率多数未变少数突变突变率多数负变少数正变正变率多数幅度小少数幅度大高产率投产率多数不宜投产少数适宜投产出发菌株计算出诱变诱变育种工作中应考虑的几个原则选优良的出发菌株处理单孢子（或单细胞）悬液选用最适剂量设计或采用高效筛选方案或方法利用复合处理的协同效应利用和创造形态，生理与产量间的相关指标选择简便有效的诱变剂挑选优良的出发菌株生产中用过的自发变异菌株采用具有有力性状的菌株采用已发生其他变异的菌株采用前体或最终产物代谢高的菌株采用增变菌株处理单孢子（或单细胞）悬液芽孢杆菌应处理芽孢放线菌，霉菌应处理孢子细菌指数期，放线菌霉菌要稍加萌发后使用出发菌株应制成均匀悬夜选择简便有效的诱变剂出发菌株含诱变剂的液体培养基接种培养培养接种分离紫外线选择优良突变株选用最适剂量剂量以诱变剂浓度和处理时间来表示合适剂量：能扩大变异幅度又能促使变异移向正变范围的剂量充分利用复合处理的协同效应两种或多种诱变剂先后使用同种诱变剂重复使用两种或多种诱变剂同时使用利用和创造形态，生理与产量间的相关指标淀粉酶变色圈试验变色圈大的为淀粉酶高产菌落1、初筛：以量为主2、复筛：以质为主2、诱变育种的步骤

设计或采用高效筛选方案或方法一个出发菌株诱变剂处理选出200个单孢子菌菌株初筛（每株1瓶）选出50株复筛（每株4瓶）选出5株第一轮第二轮五个出发菌株初筛（每株1瓶）选出50株复筛（每株4瓶）选出5株40株40株40株40株40株诱变剂处理突变株的筛选方法

高产突变菌株的筛选方法

抗性突变体的筛选方法

营养缺陷型的的筛选方法

与突变株的筛选相关的几个概念与突变株的筛选相关的几个概念相关培养基基本培养基完全培养基补充培养基三类遗传型野生型[A+B+]营养缺陷型型[A+B-]原养型[A+B+]突变春日霉素产生菌的孢子悬液·高产突变株的筛选

琼脂块培养法筛选春日霉素高产菌种含供试菌种（拮抗对象）的琼脂平板营养缺陷型的筛选办法诱变剂处理淘汰野生型：青霉素浓缩法、菌丝过滤法、梯度培养法、差别杀菌法检出缺陷型：夹层培养法、限量补充培养法、逐个检出法、影印接种法鉴定缺陷型中间培养淘汰野生型（青霉素浓缩法）培养基(含青霉素)

接入敏感菌液（含抗性突变株）涂布抗青霉素菌落培养淘汰野生型（菌丝过滤法）基本培养基

接入微生物孢子（含营养突变株）涂布均匀后培养长出菌丝体（野生型）菌丝过滤得营养突变株梯度培养皿法强抗性中抗性弱抗性含异烟肼接敏感菌含突变株淘汰野生型（差别杀菌法）1.适用于细菌的芽孢2.原理：将诱变处理的芽孢接种到基本培养基上，野生型的芽孢生长成营养细胞，而缺陷型的不能生长成营养细胞。检出缺陷型（夹层培养法）小菌落是第二次长