蛋白质分离纯化基础技术培训

蛋白质分离纯化基础技术培训第1页，共51页，2023年，2月20日，星期二蛋白质的分离纯化是研究蛋白质结构、化学组成和生物功能的基础。蛋白质在自然界中存在于复杂的混合体系中，而且许多重要的蛋白质在细胞中的含量极低。要把蛋白质从复杂的体系中分离出来，同时又要防止其组成、结构的改变和生物活性的丧失，显然是有相当难度的。概述第2页，共51页，2023年，2月20日，星期二破碎蛋白溶解酸、碱醇去垢剂尿素……粗提沉淀相分离分子筛……精提各种色谱电泳分离差速离心……研磨超声渗透压酶……保存原材料的获取浓缩保存状态保存条件保存期限……第3页，共51页，2023年，2月20日，星期二培训内容蛋白质样品的预处理蛋白质常规层析技术FDA关于蛋白质产品的重要规定第4页，共51页，2023年，2月20日，星期二培训内容蛋白质样品的预处理蛋白质常规层析技术FDA关于蛋白质产品的重要规定第5页，共51页，2023年，2月20日，星期二预处理液体材料过滤离心固体材料洗涤材料破碎第6页，共51页，2023年，2月20日，星期二破碎方法机械破碎非机械破碎搅拌、振动研磨压滤超声匀浆干燥渗透压冻融酶第7页，共51页，2023年，2月20日，星期二超声破碎频率高于20000HZ的声波称为“超声波”。缺点：发热，剪切力强，体系中会产生自由基，它可能破坏蛋白的结构。第8页，共51页，2023年，2月20日，星期二渗透压破碎渗透冲击法破碎E.Coli表达产物的抽提以渗透冲击法为宜，没有特殊原因不要使用超声破碎法。不破坏细胞壁，改变细胞膜的通透性。0°C，20%蔗糖，10mM左右缓冲液，含2.5mMEDTA，高渗后，加入低渗液，迅速充分悬浮。如果必要，应含DTT至2mM左右；均浆液组成原则：离子强度尽量低：≤50mM，有时需DTT，不一定加EDTA，可考虑加PMSF，但此时不宜用Tris等胺类缓冲剂第9页，共51页，2023年，2月20日，星期二离心离心是利用离心力，分离液体与固体颗粒或液体与液体的混合物中各组分的方法。是根据物质颗粒的沉降系数、质量、密度及浮力等因子的不同，而使物质分离的技术。第10页，共51页，2023年，2月20日，星期二不同细胞结构分离所需的离心力结构离心力g细胞核800-1000线粒体20,000-30,000叶绿体20,000-30,000溶菌酶20,000-30,000微体20,000-30,000粗面内质网50,000-80,000质膜和光面内质网80,000-100,000cytosolic>100,000游离核糖体、病毒粒体150,000-300,000第11页，共51页，2023年，2月20日，星期二离心方法差速离心、等密度梯度离心、速率区带密度梯度离心平衡等密度梯度离心区带离心连续流离心。。。第12页，共51页，2023年，2月20日，星期二离心优点操作简单，成本较低缺点沉淀的蛋白因为挤压、变性、聚集而失活不适合大规模操作第13页，共51页，2023年，2月20日，星期二超滤分子量cutoff的含义如膜对被截留物质的截留率大于90％时，就用被截留物质的分子量表示膜的截留性能，称为膜的截留分子量。第14页，共51页，2023年，2月20日，星期二超滤超滤由于剪切力和发热的影响，易造成蛋白失活。如果用超滤分离蛋白，只有分子量相差一个数量级才可以分开在蛋白浓度低的情况下，超滤膜对蛋白的吸附比较强。可以用Tween20先钝化，能降低蛋白吸附第15页，共51页，2023年，2月20日，星期二双水相系统：因两种水溶性聚合物的水溶液，或一种水溶性聚合物水溶液与盐溶液混合时的不相容性而形成有明显界面的两相系统双水相抽提第16页，共51页，2023年，2月20日，星期二

葡聚糖（Dextran）与聚乙二醇（PEG）按一定比例与水混合，溶液混浊，静置平衡后，分成互不相溶的两相，上相富含PEG、下相富含葡聚糖第17页，共51页，2023年，2月20日，星期二各种类型的双水相体系类型形成上相的聚合物形成下相的聚合物非离子型聚合物/非离子型聚合物聚乙二醇葡聚糖聚乙烯醇聚丙二醇聚乙二醇聚乙烯吡咯烷酮高分子电解质/非离子型聚合物羧甲基纤维素钠聚乙二醇高分子电解质/高分子电解质葡聚糖硫酸钠羧甲基纤维素钠聚合物/低分子量化合物葡聚糖丙醇聚合物/无机盐聚乙二醇磷酸钾硫酸铵第18页，共51页，2023年，2月20日，星期二特点：两相均含有大量的水（高达80%以上），界面张力小，一般只有0.5-10-4mN/m，萃取环境和条件温和，生物相容性好，有时有稳定作用；分配系数可控：聚合物修饰、相系统组成

操作条件容易放大几百倍。第19页，共51页，2023年，2月20日，星期二选择双水相的原则能够获得高的产物回收和生物活性回收，高的分离纯化倍数；系统的物理化学性质有利于大规模的应用，有良好的工艺性能，系统黏度低，相分离快，达到相平衡时间短，工艺参数容易控制，工艺条件可调性范围大；系统经济，成本低，无毒，适合大规模应用。第20页，共51页，2023年，2月20日，星期二第21页，共51页，2023年，2月20日，星期二第22页，共51页，2023年，2月20日，星期二优点直接从cell碎片匀浆中萃取prot、而无需将细胞碎片分离双水相系统平衡时间短，含水量高，界面张力低，成相聚合物对蛋白质有稳定作用，为生物活性物质提供了温和的分离环境操作简便，经济省时，易于放大.由于很容易达到平衡，用商业上的离心机能使相分离完全，分配系数的值重演性很好，故可直接放大改变体系的pH和电解质浓度可进行反萃取通常将蛋白质分配在上相，而细胞碎片分配在下相（盐）第23页，共51页，2023年，2月20日，星期二缺点双水相技术虽然在生物物质分离中有其独特的优点，但双水相萃取技术体系并不完善，有很多需要解决的问题，其中很主要的一个是萃取剂的回收。在生物分子回收和纯化以后，怎样从含有目标产物残留物水溶液中回收聚合物和盐就成为重要问题。目前聚合物的回收采用的一些方法是：超滤、渗析膜过滤离子交换吸附，但这些方法都存在自身缺点，不能使聚合物很完全的回收，仍然使成本较高。双水相萃取技术虽然有技术的优势，但其原料成本较高，使其产业化成了问题。另外，双水相萃取技术至今还没有一套完善的理论体系，不能很好的解释大分子在体系中分配的机理。第24页，共51页，2023年，2月20日，星期二培训内容蛋白质样品的预处理蛋白质常规层析技术FDA关于蛋白质产品的重要规定第25页，共51页，2023年，2月20日，星期二层析的概念流动相流出组分固定相洗脱峰例如葡聚糖凝胶、纤维素、树脂等第26页，共51页，2023年，2月20日，星期二层析介质生物兼容性：亲水性，大孔径，不会使生物大分子失活，没有生物化学毒性—过强吸附、泄露。化学稳定性：在生物大分子存在的化学条件下是稳定的。必要的机械性能：流体中的耐压性、弹性。第27页，共51页，2023年，2月20日，星期二层析前需要了解蛋白质纯化表蛋白质含量、目标活性的含量、比活性、纯化倍数、活性回收率、产率等需要关注过程相关杂质或污染物明确关键杂质，哪一步去除了哪些杂质，体现质量源于设计综合考虑样品的各种性质稳定性、等电点、分子量、疏水性、产品浓度纯化经济学一般3步到4步纯化，步骤如果再多，可能不经济第28页，共51页，2023年，2月20日，星期二常用层析技术亲和层析离子交换层析疏水层析凝胶过滤层析第29页，共51页，2023年，2月20日，星期二亲和层析原理：

亲和层析是利用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。常用的生物亲和关系有酶-底物、抗体-抗原、外源凝集素-糖蛋白等。

第30页，共51页，2023年，2月20日，星期二第31页，共51页，2023年，2月20日，星期二亲和层析纯化过程简单、迅速，且分离效率高。对分离含量极少又不稳定的活性物质尤为有效。但本法必须针对某一分离对象，制备专一的配基和寻求层析的稳定条件，因此亲和层析的应用范围受到了一定的限制。第32页，共51页，2023年，2月20日，星期二原理：

以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离。通过静电相互作用而使带正电荷的样品结合到阳离子交换介质上，而带负电荷的介质则可结合到阴离子交换介质上，再采用改变盐浓度或者缓冲液的pH值的方法进行洗脱。

离子交换层析(ionexchangechromatography)第33页，共51页，2023年，2月20日，星期二第34页，共51页，2023年，2月20日，星期二

影响因素：缓冲液的盐浓度和pH值。在进行pH梯度洗脱时，尽量避免跨越蛋白质的等电点。流速高的情况下，分辨率低第35页，共51页，2023年，2月20日，星期二经验离子交换后，采用疏水层析，可省去缓冲液交换步骤（BufferExchange）；电导率更能反映影响离子交换的强度。离子交换平衡液应采用尽量低的离子强度，上样体积不限。第36页，共51页，2023年，2月20日，星期二吸附层析造成的失活所有的吸附都是动态的，吸附时间越长，失活的比例越大高密度的配基造成蛋白质溶液在洗脱时形成聚集体，造成失活通常蛋白质在PH8-10的弱碱性条件下比在pH6-4的弱酸性条件下要更稳定一些，因此蛋白质在阴离子交换的变性情况要比阳离子交换要少得多第37页，共51页，2023年，2月20日，星期二

原理：

根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。疏水层析hydrophobicinteractionchromatography，HIC第38页，共51页，2023年，2月20日，星期二第39页，共51页，2023年，2月20日，星期二影响因素：盐类，盐可增加水相的极性，提高界面的表面张力，同时可使蛋白质暴露出临近界面的非极性基团，容易形成疏水作用。所以盐浓度越高，促疏水作用越强。有机溶剂，同盐作用相反，减少疏水作用。表面活性剂也能减少疏水作用。不同盐增强疏水配基和蛋白质之间的相互作用第40页，共51页，2023年，2月20日，星期二洗脱策略：在吸附时应适当增强盐浓度以增强蛋白质与层析剂之间的疏水作用力，洗脱可采用低浓度的盐溶液洗脱。对于结合较强的蛋白质可以在洗脱剂中添加一些温和的有机溶剂如多元醇或表面活性剂来洗脱。疏水层析不适合在高流速下运行第41页，共51页，2023年，2月20日，星期二去除内毒素和DNA：核酸在高盐条件下会和蛋白解离,利用疏水层析介质结合目标蛋白,去除核酸。热原含脂肪A、糖类和蛋白，其脂肪A部份有很强的疏水性，但在高盐下会凝集，无法上疏水层析。因此可利用疏水层析结合目标蛋白而去除热原。第42页，共51页，2023年，2月20日，星期二原理：

凝胶过滤层析是根据被分离物分子大小和形状的差异进行分离。填料含有许多不同大小的孔，体积大的分子不能进入体积小的孔，而体积小的物质可进入大孔，也可进入小孔，因此在柱中保留的时间比体积大的物质长。整个样品按分子量的大小顺序分开，体积最大的物质最先出峰，体积最小的物质最后出峰。因此，凝胶过滤层析又被形象地称为分子筛层析。凝胶过滤层析gelchromatography

第43页，共51页，2023年，2月20日，星期二第44页，共51页，2023年，2月20日，星期二影响因素与洗脱策略：对于凝胶过滤层析，其主要影响因素有上样体积和流动相的盐浓度。盐浓度过低，会引起生物分子和介质之间的产生非特异性结合，可以适量的提高流动相的盐浓度，一般大于0.05mol/L。脱盐/换液常用SephadexG-25，其最大上样量为30%。上样体积太大，会导致样品脱盐/换液不彻底；除多聚体或降解产物，根据分子量不同选择，其最大上样量仅为2%-5%。超过上样量会降低分辨率，导致目的蛋白和聚体等不能彻底分开。经验：具有3000个理论塔板的凝胶过滤可近似的将分子量相差2倍的蛋白质完全分开，而具有6000个理论塔板的凝胶过滤可近似的将分子量相差1.5倍的蛋白质完全分开常压的分子筛从下往上走比较好第45页，共51页，2023年，2月20日，星期二优点

1.凝胶是一种不带电荷的惰性载体。其结构稳定，所以凝胶本身不与样品发生化学反应。

2.凝胶层析的操作条件较温和，不易引起生物物质的变性，即使用来分离一些理化性质不稳定的物质也很少被破坏。

3.样品得率高，重复性好。如果按比例扩大柱的体积和高度，可进行大量样品的分离纯化。第46页，共51页，2023年，2月20日，星期二缺点1.要求样品和洗脱液的粘度很低。2.凝胶颗粒网络孔径大小非常有限，所以可被纯化的物质的分子量范围受到限制。3.凝胶结构对某些溶质分子具有吸附作用，如芳香族化合物与