交联透明质酸钠细胞支架材料中交联剂残留量的测定

交联透明质酸钠细胞支架材料中交联剂残留量的测定张治云;刘荣磊;陈建英;邢玉仁;王勤;凌沛学【摘要】建立了气相色谱法测定交联透明质酸钠细胞支架材料中交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚残留量的方法。选用安捷伦HP-5毛细管柱(30mx0.32mm,0.25pm)，氢火焰离子化检测器(FID)，载气为氮气，流速为2.0ml-min-1,柱温采用程序升温，初始温度为90°C，以15°Gmin-1升温至250°C，保持8min;采用夕卜标法定量。1,4-丁二醇二缩水甘油醚浓度在0.133~1.865pg・ml-1的范围内，峰面积和浓度呈现良好的线性关系，相关系数为0.9993;回收率为96.33%~100.57%,相对标准偏差(RSD)为1.40%(n=9)。方法专属性强、重现性好、灵敏度高，可用于交联透明质酸钠支架材料中1,4-丁二醇二缩水甘油醚残留量的测定。%Amethodfordeterminationofresidual1,4-butanedioldiglycidylether(BDDE)incrosslinkedsodiumhyaluronatecellscaffoldbyGCchromatographywasestablished.ThemethodwasprogrammedwithAgilentHP-5capillarycolumn(30mx0.32mm,0.25pm)andFIDdetector.Thecarriergaswasnitrogenandtheflowratewas2.0ml-min-1.Theovenintroducedsequentialincreasingoftemperatureprogramming.Theinitialcolumntemperaturewas90°C,thenraiseditto250Catarateof15C-min-1,andmaintaineditfor8min.TheBDDEwasquantifiedexternalstandard.Thecalibrationshowedagoodcalibrationlinearitywiththerangeof0.133~1.865pg-ml-1forBDDEandthecorrelationcoefficientwas0.9993.Therecoverieswereintherangeof96.33%~100.57%.Therelativestandarddeviations(RSD)was1.40%(n=9).Themethodhasgoodspecificity,repeatabilityandhighsensitivity.ItcanbeusedfordeterminingthecontentofresidualBDDEincross-linkedsodiumhyaluronatescaffold.【期刊名称】《生物医学工程研究》【年(卷)，期】2015(000)001【总页数】4页(P23-26)【关键词】交联透明质酸钠;细胞支架;交联剂残留量;1,4-丁二醇二缩水甘油醚;气相色谱法【作者】张治云;刘荣磊;陈建英;邢玉仁;王勤;凌沛学【作者单位】山东省药学科学院，山东省生物药物重点实验室山东济南250101;山东福瑞达医药集团公司，山东省黏膜与皮肤给药技术重点实验室，山东济南250101;山东省药学科学院，山东省生物药物重点实验室山东济南250101;山东省药学科学院，山东省生物药物重点实验室山东济南250101;山东省药学科学院，山东省生物药物重点实验室山东济南250101;山东福瑞达医药集团公司，山东省黏膜与皮肤给药技术重点实验室，山东济南250101;山东福瑞达医药集团公司，山东省黏膜与皮肤给药技术重点实验室，山东济南250101;山东省药学科学院，山东省生物药物重点实验室山东济南250101【正文语种】中文【中图分类】R3181引言透明质酸(Hyaluronicacid，HA)是由D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-氨基葡糖双糖单位重复连接组成的一种链状聚阴离子黏多糖［1］,是构成皮肤、玻璃体、关节滑液和软骨组织的重要成分，具有独特的理化性质和生物学功能［2］。HA是软骨基质组成成分之一，作为软骨细胞生长的基质，能促进软骨细胞代谢，并维持软骨细胞表型、促进软骨基质分泌［3］，是构建复合软骨细胞支架的理想材料之一。天然的HA制备的支架材料具有良好的水溶性，但存在容易分散和被肌体组织中存在的酶及自由基降解，局部存留的时间较短的缺点，且缺乏维持支架材料所必须的力学性能［4］；而通过引入交联剂使链状的HA交联形成网状结构所得到的材料，可以在一定程度上克服上述天然HA材料的缺陷，通过调节交联程度及制备工艺参数，可获得具有适宜降解速度和适宜孔隙大小的材料，有望成为一种较理想的组织工程细胞支架材料［5］。HA常用的交联剂有二乙烯基砜(divinylsulfone，DVS)和1,4-丁二醇二缩水甘油醚(1,4-butanedioldiglycidylether，BDDE)，比较而言，BDDE较DVS具有毒性小、反应性好等优点，正逐步取代DVS作为交联透明质酸(cross-linkedhyaluronicacid，CHA)的主要交联剂［6］。由于BDDE化学性质活泼，其单体有致突变和致癌的潜在风险，因此，需要严格控制CHA支架材料中BDDE残留量。本研究建立了气相色谱法测定CHA细胞支架材料中BDDE残留量的方法，通过方法学研究证明方法专属性强、重现性好、灵敏度高，可用于CHA中BDDE残留量测定。2实验材料与方法2.1实验材料气相色谱仪(Agilent7890A，美国Agilent)；自动进样器(AgilentG4513A)；氢火焰离子化检测器(FID)；电子分析天平(MettlerXS205，瑞士Mettler)。无水乙醇(天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20130514，色谱纯)；BDDE(美国Sigma—Aldrich)；CHA细胞支架材料(自制，批号：20130501、20130502、20130503)。2.2实验方法2.2.1色谱条件安捷伦HP-5(30mx0.32mm,0.25pm)毛细管柱；进样口温度为200OC,不分流模式进样；FID温度为250OC；载气为氮气，流速为2.0ml-min-1;柱温采用程序升温，初始温度为90C，以15°C・min-1升温至250C,保持8min;进样体积为1.0pl。2.2.2试样的制备精密称取BDDE16.65mg，置事先加入适量无水乙醇的50ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1.0ml置50ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为贮备液，精密量取3.0ml置25ml量瓶中，加无水乙醇-水(6:4)稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取CHA细胞支架材料80mg，精密称定，剪碎，置10ml量瓶中，加水4.0ml静置过夜，加无水乙醇稀释至刻度，强力振摇10min，用0.22pm有机微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。2.2.3专属性试验精密量取空白溶剂(无水乙醇-水=6:4)1.0pl注入气相色谱仪，记录色谱图；另精密量取BDDE对照品溶液1pl注入气相色谱仪，记录色谱图。2.2.4线性关系试验精密量取2.2.2项下BDDE对照品贮备液0.5、1、3、5、7ml，分别置25ml量瓶中，加溶剂(无水乙醇-水=6:4)稀释至刻度，摇匀，分别量取1pl注入气相色谱仪，记录色谱图，以BDDE峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。2.2.5系统精密度试验取2.2.2项下BDDE对照品溶液，按2.2.1条件连续测定6次，计算BDDE峰面积的精密度。2.2.6对照品溶液稳定性试BDDE对照品溶液配制后每隔一定时间，精密量取1pl注入气相色谱仪，记录色谱图，考察BDDE峰面积随时间的变化趋势。2.2.7定量限与检测限取2.2.2项下BDDE对照品贮备溶液，逐级稀释成不同浓度的对照品溶液，依法测定，记录BDDE峰的信噪比。以S/N=10时为定量限，S/N=3时为检出限。2.2.8重复性试验取CHA细胞支架材料(批号：20130501)6份，每份80mg，精密称定，依法测定样品中BDDE残留。2.2.9回收率试验取CHA细胞支架材料(批号：20130501)9份，每份80mg，剪碎，置10ml量瓶中，加水4.0ml使充分溶胀；精密称取BDDE13.32mg，置事先加入适量无水乙醇的100ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1.0ml置50ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。各取3份溶胀后的细胞支架材料，分别加上述对照品贮备液2.4、3.0和3.6ml，加无水乙醇稀释至刻度，强力振摇10min，用0.22pm有机微孔滤膜过滤，取续滤液依法测定，计算BDDE回收率。2.2.10样品测定精密称取CHA细胞支架材料(批号：20130501、20130502、20130503)，各约80mg,置10ml量瓶中，依法测定样品中BDDE残留。3实验结果3.1专属性试验空白溶剂进样，在BDDE出峰处无干扰峰，见图1。图1空白溶剂(A)及BDDE对照品溶液色谱图(B)Fig1Chromatographyofblanksolution(A)andBDDEstandardsolution(B)3.2线性关系试验在0.133-1.865pg-ml-1范围内BDDE的浓度与峰面积的线性关系良好，相关系数为0.9993。3.3系统精密度试验对照品溶液连续测定6次，BDDE峰面积RSD为1.86%(n=6)，方法精密度良好。3.4对照品溶液稳定性试验72h内BDDE峰面积无明显变化趋势，RSD为2.42%(n=8)，表明BDDE对照品溶液配制后至少在72h内稳定。3.5定量限与检测限BDDE定量限为0.104pg-ml-1，检出限为0.036pg-ml-1o3.6重复性试验同一批次样品测定6次，均未检测到BDDE残留。3.7回收率试验BDDE回收率见表1。表1BDDE回收率试验结果Table1ResultsofBDDErecoverytest加入量/pg测得量/四回收率,％平均回收率,％RSD,%6.3946.32698.946.3946.24997.746.3946.409100.247.9927.90198.867.9927.77997.3398.411.407.9927.69896.339.5909.41198.139.5909.35697.559.5909.645100.573.8样品测定CHA细胞支架材料(批号：20130501、20130502、20130503),均未检出BDDE。4讨论细胞支架材料是组织工程领域的重要组成部分，理想的细胞支架材料应具有良好的生物相容性，适当的生物可降解性，易加工成形，并可在一定时间内保持外观和结构的完整性，具有一定机械强度能维持细胞形态和表型，并促进细胞粘附与增殖，诱导组织再生［7］。HA作为软骨细胞生长的基质，能促进软骨细胞代谢，是构建复合软骨细胞支架的理想材料之一，通过引入交联剂，使链状的HA交联形成网状结构，可延长材料在组织局部的存留的时间。HA常用的交联剂有DVS和BDDE，由于交联剂化学性质活泼，单体有致突变和致癌的潜在风险，因此，需严格控制CHA中游离交联剂的残留量。朱彬等［8］、王悦等［9］采用气相色谱法测定DVS交联透明质酸钠凝胶中交联剂残留，样品处理采用乙醇萃取，使HA形成白色沉淀而DVS溶于乙醇中，直接进样测定。冯海等［6］采用荧光分光光度法和气相色谱法分别测定CHA凝胶中BDDE残留，两种方法定量限分别为0.53pg-ml-1和1.85pg-ml-1ml-1。自制CHA细胞支架材料为厚度1.5~2.0mm的多孔状膜片，直接加乙醇，支架材料部分漂浮于乙醇中，不溶胀，不利于游离BDDE的提取。将支架材料剪碎后加适量水使其充分溶胀成凝胶，再加乙醇使CHA形成均匀絮状沉淀，可充分提取游离的BDDE，本试验通过色谱条件优化，采用不分流模式溶液直接进样，BDDE定量限为0.104pg-ml-1ml-1,方法的检测灵敏度高于已报道的荧光分光光度法及气相色谱法。FDA批准的RestylaneSilkInjectableGel为采用BDDE交联的透明质酸钠凝胶，用于皮肤植入矫正口周皱纹，其浓度为20mg・ml-1ml-1，产品中BDDE残留限值为2pg-ml-1mg-1,折合成CHA中BDDE残留限值为0.1pg-ml-1mg-1，参照该产品将CHA支架材料中BDDE残留限值暂定为0.1pg-mg-1o参考文献：【相关文献】LaurentTC,FraserJR,Hyalurona[J].FASERJ,1992,6(7):2397-2404.HoffmanAS.Hydrogelsforbiomedicalapplications[J].AdvDrugDeliveryRev,2002,54(1):3-12.ResponteDJ,NatoliRM,AthanasiouKA.Identificationofpotentialbiophysicalandmolecularsignallingmechanismsunderlyinghyaluronicacidenhancementofcartilageformation[J].JRSocInterf,2012,9(77):3564-3573.NarinsRS,BowmanPH.Injectableskinfillers[J].ClinPlastSurg,2005,32(2):151-162.陈倩倩，陈建英，张建强，