微生物限度检查解读

微生物限度检查解读第1页，共31页，2023年，2月20日，星期六一、前言1.规定了微生物限度检查的定义及检查内容。2.实验的环境设施及操作的无菌要求。3.对检查中使用的助溶剂、中和剂、灭活剂的作用及对微生物生长和存活的影响应进行验证4.霉菌培养温度改为23~28℃，控制菌培养温度改为以35~37℃表示，细菌不变。5.增加检验结果的单位：10g，10ml。第2页，共31页，2023年，2月20日，星期六二、具体内容1.检验量：指明了检验量是一次试验所用的量；对贵重药、微量包装药可酌减，但不规定3g或5g；因沙门菌检查的报告单位为10g或10ml，所以检验量应另增10g或10ml（不含阳性对照用量）。第3页，共31页，2023年，2月20日，星期六2.供试液制备（与2000年版药典相比的不同点）2000年版药典2005年版药典（1）使用0.9%无菌NaCl溶液使用pH7.0无菌NaCl-蛋白胨缓冲液（2）供试液制备以加一定体积表示供试液制备以加至一定体积表示（3）供试液分三类六种供试液分三类七种，但分类更合理，函盖面更全（4）制备方法有限增加了新的制备方法，对培养基稀释作了进一步详细规定第4页，共31页，2023年，2月20日，星期六3.细菌、霉菌、酵母菌计数3.1平皿法：3.1.1平皿法两版药典比较3.1.2平皿法菌数报告规则

3.1.3平皿法其他内容，如阴性对照试验等等与2000年版相同第5页，共31页，2023年，2月20日，星期六3.细菌、霉菌、酵母菌计数（续）3.2薄膜过滤法(为2005年版药典新增内容)3.2.1操作3.2.2阴性对照试验3.2.3培养和计数3.2.4菌数报告规则

第6页，共31页，2023年，2月20日，星期六3.1.1平皿法两版药典比较2000年版药典2005年版药典（1）连续3个稀释级连续2~3个稀释级（2）培养基约15ml培养基约15~20ml（3）每稀释级应作2~3个平皿每稀释级每种培养基至少制备2个平皿（4）无培养和计数栏增加对同级的两个平板，当菌落数大于等于15个时，则两个平板的菌落数不能相差1倍或1倍以上第7页，共31页，2023年，2月20日，星期六3.1.1平皿法两版药典比较（续）2000年版药典2005年版药典（5）培养基的适用范围，规定比较乱，表达不清，不易理解营养琼脂培养基用于进行细菌计数；玫瑰红琼脂培养基用于进行霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于进行酵母菌计数,或用于特殊品种（含蜂蜜、王浆的液体制剂）进行酵母菌计数第8页，共31页，2023年，2月20日，星期六3.1.2平皿法菌数报告规则

2000年版药典存在许多不足，2005年版作了较大改动1)规定取两位有效数字报告。在计数及中间计算过程中可多保留一位。2)2005年版中：（1）与2000版相同第9页，共31页，2023年，2月20日，星期六3.1.2平皿法菌数报告规则

(续)（2）当比值≤2时，与2000年版相同，以两级均数报告当比值>2时，规则与2000年版不同，如比值为2~5时，说明两级之间存在较大差别，应以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数增加了比值大于5，或出现高稀释级菌数大于或等于低稀释级，应查明原因。如试液有较强的抑菌作用，就不能象上述一样忽略，必须调整方法第10页，共31页，2023年，2月20日，星期六3.1.2平皿法菌数报告规则(续)

（3）与2000年版相同（4）与2000年版相同第11页，共31页，2023年，2月20日，星期六3.1.2平皿法菌数报告规则(续)

3)还删除了2000年版中不合理的3条;把培养基稀释列为具抑菌活性供试品在任何情况下通用的方法，不仅仅局限于某种情况,而且方法也进行了合理的调整，取样改为2ml，每1ml所注平皿多个(不定)第12页，共31页，2023年，2月20日，星期六3.2薄膜过滤法

(为2005年版药典新增内容)3.2.1操作：1）取相当于供试品1g（ml）的供试液[如取供试品1g（ml）或1：10供试液10ml或1：100供试液100ml]，加至适量稀释剂，混匀，过滤2）冲洗方法、冲洗液、冲洗量（应验证）3）每种培养基至少制备一张膜

第13页，共31页，2023年，2月20日，星期六3.2薄膜过滤法(续)3.2.2阴性对照试验:

等同于“空白试验”，即不加供试品，按同法操作所得结果，每种培养基均需做。第14页，共31页，2023年，2月20日，星期六3.2薄膜过滤法(续)3.2.3培养和计数:

与平皿法相同。但每张滤膜上菌数应不得过100个，如果超过100个，也就是每1g（ml）供试品含菌量较多，可取适宜稀释级供试品1ml检查，例如，1：10取10ml检查，菌落150个（150个/g），则改用1：10取1ml检查，菌落为15个（150个/g）第15页，共31页，2023年，2月20日，星期六3.2薄膜过滤法(续)3.2.4菌数报告规则:1)报告每1g（ml）供试品菌落数；2)若膜上无菌落生长时，如果（每张膜过滤1g(ml)供试品或1：10×10ml供试液，如每张膜过滤1：10×10ml供试液，则报告<10个，依此类推，为<1乘以稀释倍数第16页，共31页，2023年，2月20日，星期六4.控制菌检查1)大肠菌基本相同，主要修改是：当MUG和靛基质两项中有一项为阳性时，大肠菌的进一步确认通过大肠菌菌落形态特征比较进行鉴别排除，增加大肠菌形态特征，对进一步确认做什么生化试验不作硬性规定（是否妥？），所以原有的生化试验结果判断删除了。第17页，共31页，2023年，2月20日，星期六4.控制菌检查(续)2)增加大肠菌群检查。3)沙门、金葡、绿脓也和大肠菌一样作了调整，大同小异。沙门菌规定取供试品10g（ml），另加阳性对照10g（ml）。4)增加了梭菌检查（无论试管或平皿都要注意厌氧条件培养）。第18页，共31页，2023年，2月20日，星期六5.微生物限度标准（略）主要变化是由按剂型控制改为按给药途径控制。

第19页，共31页，2023年，2月20日，星期六6.方法验证6.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证：1)菌液制备（略）2)验证方法：主要分四组，测得四组数据。①供试品对照组：按拟定的菌落计数方法，准确测定规定量(与试验组的相同)的供试液中的菌落数，得供试品的已知含菌数----相当于已知供试品的含量。②菌液组：测定所加的试验菌的菌数----相当于精密称定对照品，得对照品的已知加入量。第20页，共31页，2023年，2月20日，星期六6.方法验证(续)③试验组（操作略）：取已知含菌数的供试液（试验可能用的最低稀释级供试液1ml）和一定量的试验菌，进行测定。测得试验组的总菌量，测定两份（两个平皿），求平均值计算试验组的回收率：试验组-供试品对照组（加入试验菌的测定值）菌液组（加入试验菌的已知值）

（应≥70%）第21页，共31页，2023年，2月20日，星期六6.方法验证(续)④稀释剂对照组：以相应稀释液替代供试品，按③试验组同法测定计算稀释剂对照组的回收率：稀释剂对照组（加入试验菌的测定值）菌液组（加入试验菌的已知值）

（应≥70%）第22页，共31页，2023年，2月20日，星期六

上述整个试验应至少进行3次独立的平行试验，即分别平行取来自同一批样品的三份供试品，平行操作，作三次验证测定。每次验证试验的试验组和稀释对照组回收率必须两项同时≥70%，所被验证的检查法成立，否则……第23页，共31页，2023年，2月20日，星期六6.2控制菌的验证

根据各品种项下微生物限度检查标准中规定检查的控制菌，进行相应的验证；根据检查的控制菌选择对应的验证菌，大肠菌群选大肠埃希菌。试验分二组第24页，共31页，2023年，2月20日，星期六

①试验组（操作略）：规定量一般为1：10供试液10ml（相当于1g或1ml供试品），沙门菌除外。取供试液、试验菌加入增菌培养基中。按拟定方法检查。第25页，共31页，2023年，2月20日，星期六

②阴性菌对照组：检查大肠、大肠菌群、沙门----金葡为阴性检查绿脓、金葡、梭菌----大肠为阴性进行阴性试验时，取供试液及阴性对照菌，然后按控制菌检查的方法进行试验，例如，验证控制菌大肠菌的检查方法时，应取供试液及金葡菌，按大肠菌检查方法进行增菌检查，应不得检出金葡菌。本阴性菌对照组试验的目的是为了验证大肠菌检查方法的专属性第26页，共31页，2023年，2月20日，星期六7.总结

作为研发者，需要做的工作是：(1)．建立方法；(2)．验证方法；(3)．制订质量标准

作为检验者，应该做的工作是：

--按制订的方法（质量标准）检验

第27页，共31页，2023年，2月20日，星期六10号资料（质量标准研究资料）(1)实验仪器、试药（包括培养基、稀释液、冲洗液、菌液……，包括培养基的相关试验）(2)根据什么原因、理由、依据拟定的方法第28页，共31页，2023年，2月20日，星期六

(3)按药典要求进行验证，主要实验操作(4)验证数据、结果，列表表示(5)得出结论第