临床免疫检验的自动化分析专家讲座

第十四章临床免疫检验自动化分析陶志华临床免疫检验的自动化分析专家讲座第1页目录第一节免疫浊度测定自动化分析一、免疫散射比浊测定自动化分析二、免疫散射比浊测定影响原因第二节发光免疫测定自动化分析一、吖啶酯标识化学发光测定自动化分析二、酶联发光免疫测定自动化分析三、电化学发光免疫测定自动化分析四、发光氧通道免疫测定自动化分析临床免疫检验的自动化分析专家讲座第2页目录第三节荧光免疫测定自动化分析一、时间分辨荧光免疫测定自动化分析二、荧光偏振免疫测定自动化分析第四节酶联免疫测定自动化分析第五节临床免疫检验自动化分析选择与应用一、临床免疫检验自动化分析选择标准二、临床免疫检验自动化分析临床应用临床免疫检验的自动化分析专家讲座第3页重点提醒临床免疫检验自动化分析(automationofimmunoassays)是将免疫学检验过程中取样、加试剂、混合、温育、固相载体分离、信号检测、数据处理、结果汇报和检测后仪器清洗等步骤由计算机控制，仪器自动完成整个免疫检验过程。临床免疫检验的自动化分析专家讲座第4页重点提醒各种自动化免疫分析仪都使用一个或两种免疫分析技术，如酶联免疫分析技术、生物素-亲合素技术、化学发光分析技术、荧光偏振免疫测定技术、时间分辨荧光免疫测定技术、电化学发光免疫分析技术等。有些免疫检验如免疫透射比浊则可采取全自动生化分析仪进行检测，有些则整合在其它一些自动化分析系统中，如自动化血凝分析仪。临床免疫检验的自动化分析专家讲座第5页重点提醒经过本章学习，学生将全方面掌握临床上惯用全自动免疫分析仪类型、仪器检测技术关键点和影响原因。经过本章学习，学生还将了解临床试验室选择选择标准和临床应用。临床免疫检验的自动化分析专家讲座第6页第一节免疫浊度测定自动化分析临床免疫检验的自动化分析专家讲座第7页免疫浊度分析基本原理抗原、抗体在特定电解质溶液中反应，形成小分子免疫复合物（<19S），在增浊剂（如PEG等）作用下，快速形成免疫复合物微粒（>19S），使反应液出现浊度。在抗体稍微过量且固定情况下，形成免疫复合物量随抗原量增加而增加，反应液浊度亦随之增大，即待测抗原量与反应溶液浊度呈正相关。临床免疫检验的自动化分析专家讲座第8页Iθ＝I0［4π2（dn/dc)2Mc(1+cosθ)］Nγ2λ4免疫散射比浊仪粒子对光线散射作用是溶液中微粒子受到光线照射后，微粒子对光线产生反射和折射而形成散射光。悬浮微粒对光散射形成散射光强度与微粒大小、数量、入射光波长和强度、测量角度等原因亲密相关，其公式以下：式Iθ中为与入射光成θ角处散射光强度；λ和I0为入射光波长和强度；dn/dc为校正因子，反应了溶液折射指数和颗粒浓度改变；M为颗粒分子量；c为浓度；N为阿佛加德指数；γ为颗粒到检测器距离；θ为散射光与入射光夹角（散射夹角）。临床免疫检验的自动化分析专家讲座第9页定时散射比浊法（fixedtimenephelometry）

检测原理：定时散射比浊法是在确保抗体过量情况下，加入待测抗原，此时反应马上开始，在反应第一阶段，溶液中产生散射光信号波动较大，所获取信号计算出结果会产生一定误差。定时散射比浊法是避开抗原抗体反应不稳定阶段，即散射光信号在开始反应7.5s～2min内第一次读数，专门在抗原抗体反应最正确时段进行读数，将检测误差降到最低。临床免疫检验的自动化分析专家讲座第10页仪器测定技术关键点：1.抗原抗体预反应阶段2.反应阶段3.信号检测4.抗原过剩检测(1)抗体适当过量(2)反抗原过量进行阈值限定定时散射比浊法（fixedtimenephelometry）

临床免疫检验的自动化分析专家讲座第11页速率散射比浊法（ratenephelometry）速率散射比浊法是抗原抗体结合反应动力学测定法。所谓速率是指抗原抗体反应在单位时间内形成免疫复合物量（不是免疫复合物累积量），连续测定各时间复合物形成速率与其产生散射光信号联络在一起，形成动态速率散射比浊法，每项检测仅1min～2min即可完成。抗原抗体反应速率动态改变临床免疫检验的自动化分析专家讲座第12页仪器测定技术关键点：开启机器，进行校准反应阶段抗原过量检测速率散射比浊法（ratenephelometry）临床免疫检验的自动化分析专家讲座第13页BNProSpec全自动特定蛋白分析仪IMMAGE全自动特定蛋白分析仪免疫散射比浊仪临床免疫检验的自动化分析专家讲座第14页方法评价散射比浊法是当前临床应用较多一个方法，本法自动化程度高，含有快速、灵敏、准确、精密等优点。采取抗原过量检测方法，确保了结果准确性。但仪器和试剂价格比较贵,反抗体质量要求很高。临床免疫检验的自动化分析专家讲座第15页免疫比浊分析影响原因1.抗原抗体百分比2.抗体质量3.增浊剂使用4.伪浊度5.入射光光源和波长6.校准曲线制备与质量控制临床免疫检验的自动化分析专家讲座第16页第二节发光免疫测定自动化分析临床免疫检验的自动化分析专家讲座第17页发光免疫测定自动化分析发光免疫测定自动化分析是经过抗原或抗体标识技术、抗原或抗体抗原抗体反应、固相分离技术、发光技术和计算机信息技术进行有机整合，实现了加样、温育、固相载体分离清洗、发光信号检测和数据处理等过程自动化。临床免疫检验的自动化分析专家讲座第18页一、吖啶酯标识化学发光免疫分析仪吖啶酯标识化学发光免疫分析仪是一个用发光剂直接标识抗体或抗原一类免疫分析法。该仪器利用化学发光技术和磁性微粒子分离技术，以吖啶酯为化学发光剂，以细小顺磁性微粒为固相载体。其测定原理与双抗体夹心法、双抗原夹心法和竞争结正当等相同。

临床免疫检验的自动化分析专家讲座第19页磁微粒分离技术YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY顺磁性微粒示意图

磁微粒技术

磁微粒在电磁场中分离磁微粒标识抗体临床免疫检验的自动化分析专家讲座第20页发光YYY磁微粒被测抗原+抗体+带丫啶酯标识物抗体YYYYYYYYYYY冲洗后双抗体夹心法（1）加入酸性H2O2（pH<10）（2）加入碱（pH>10）仪器测定技术关键点临床免疫检验的自动化分析专家讲座第21页吖啶酯标识化学发光免疫分析仪ACS：180SEACS∶CENTAURci8200isr临床免疫检验的自动化分析专家讲座第22页酶联发光免疫分析仪酶联发光免疫分析仪是用参加催化某一化学发光或荧光反应酶来标识抗原或抗体，在抗原抗体反应后，加入底物(发光剂)，由酶催化和分解底物发光，经过光信号强弱来进行被测物定量。惯用标识酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶(ALP)，惯用发光底物有鲁米诺、AMPPD和4-MUP等。临床免疫检验的自动化分析专家讲座第23页辣根过氧化物酶标识化学发光免疫分析仪该仪器采取辣根过氧化物酶（HRP）标识抗原或抗体、以塑料锥形小管为固相载体，鲁米诺为化学发光剂，还利用增强剂使化学发光强度增加、时间延长。鲁米诺是一个还原剂，在碱性溶液中被H2O2氧化产生鲁米诺衍生物（激发态）。它以光量子辐射形式返回基态时，发出微绿色可见光。临床免疫检验的自动化分析专家讲座第24页鲁米诺增强化学发光原理临床免疫检验的自动化分析专家讲座第25页仪器测定技术关键点临床免疫检验的自动化分析专家讲座第26页全自动增强化学发光酶免分析仪临床免疫检验的自动化分析专家讲座第27页碱性磷酸酶标识化学发光免疫分析仪

该仪器是以碱性磷酸酶标识抗原或抗体，以顺磁性微粒子为固相载体，用AMPPD作为化学发光剂进行测定自动化仪器。临床免疫检验的自动化分析专家讲座第28页仪器测定技术关键点临床免疫检验的自动化分析专家讲座第29页Access全自动酶标识化学发光免疫分析仪UniCel™DxI800全自动酶标识化学发光免疫分析仪IMMULITE型全自动酶标识化学发光免疫分析系统碱性磷酸酶标识化学发光免疫分析仪临床免疫检验的自动化分析专家讲座第30页碱性磷酸酶标识微粒子荧光免疫分析仪该仪器以碱性磷酸酶标识抗原或抗体，以塑料微粒为固相载体包被抗体（或抗原），以4-甲基伞型酮磷酸盐（4-MUP）作为酶促反应荧光基质（底物），底物被酶水解后，脱磷酸根基团，形成4-甲基伞型酮(4-MU)，用360nm激发光照射，发出450nm荧光。临床免疫检验的自动化分析专家讲座第31页仪器测定技术关键点临床免疫检验的自动化分析专家讲座第32页AXSYM全自动酶标识荧光免疫分析仪碱性磷酸酶标识微粒子荧光免疫分析仪临床免疫检验的自动化分析专家讲座第33页电化学发光免疫分析仪电化学发光免疫分析（ECLIA）是一个在电极表面由电化学引发特异性化学发光反应，它包含电化学和化学发光两个过程。电化学发光免疫分析仪是采取电化学发光技术，生物素放大技术，以顺磁性微粒为固相载体，用三联吡啶钌标识抗原或抗体，三丙胺(TPA)为电子供体，而设计一个自动化分析仪器。电化学发光稳定、连续时间长，易于控制并可依据待测分子大小设计成各种反应模式如夹心法、竞争法等。临床免疫检验的自动化分析专家讲座第34页仪器测定技术关键点抗原抗体结合电化学发光反应光信号检测检测完成临床免疫检验的自动化分析专家讲座第35页全自动电化学发光免疫分析仪ModularAnalyticsE模块170型临床免疫检验的自动化分析专家讲座第36页发光氧通道免疫分析仪是一个整合了高分子纳米微粒、免疫化学、CPM单光子计数技术新型均相化学发光免疫分析仪，所采取均相化学发光技术含有快速、均相（免冲洗）、高灵敏和操作简单特点。发光氧通道免疫分析仪临床免疫检验的自动化分析专家讲座第37页以双抗体夹心法为例1.抗原抗体结合将抗体包被感光微粒、抗体包被发光微粒和待测标本加入反应杯中，经温育后，形成抗体包被感光微粒-抗原-抗体包被发光微粒复合物。2.信号检测用光子计数器计数得到相对光量子单位(RLU)值，光强度与待测抗原浓度成正比，经过校准曲线计算抗原浓度。仪器测定技术关键点临床免疫检验的自动化分析专家讲座第38页第三节荧光免疫测定自动化分析临床免疫检验的自动化分析专家讲座第39页自动化荧光免疫分析仪主要是将抗原—抗体结合反应与荧光物质发光分析和计算机技术有机结合一项自动化免疫分析仪器。依据抗原抗体反应后是否需要进行固相分离，分为均相和非均相两类。非均相荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定法；均相荧光免疫测定主要有荧光偏振免疫测定法。

临床免疫检验的自动化分析专家讲座第40页时间分辨荧光免疫分析仪是采取镧系元素标识抗原或抗体作为示踪物，并与时间分辨测定技术相结合，而建立起来一个荧光免疫分析仪器，所采取时间分辨荧光免疫分析技术含有灵敏度高，镧系元素发光稳定，荧光寿命长，不受样品自然荧光干扰，校准曲线范围宽等特点。临床免疫检验的自动化分析专家讲座第41页仪器测定技术关键点⒈抗原抗体结合⒉加入Eu3+螯合抗体⒊加入酸性增强液4.信号检测临床免疫检验的自动化分析专家讲座第42页时间分辨荧光免疫分析仪autoDELFIA全自动时间分辨荧光免疫检测系统临床免疫检验的自动化分析专家讲座第43页荧光偏振免疫分析仪是采取均相荧光免疫测定原理设计一台荧光免疫分析仪。该仪器利用荧光物质在溶液中被单一平面偏振光（波长485nm）照射后，可吸收光能而产生另一单一平面偏振发射荧光（波长525nm）。该荧光强度与荧光标识物质在溶液中旋转速度与分子大小呈反比。常采取抗原抗体竞争反应原理，适合用于小分子半抗原（如药品浓度）检测。临床免疫检验的自动化分析专家讲座第44页仪器测定技术关键点1.抗原抗体反应2.偏振荧光强度测定临床免疫检验的自动化分析专家讲座第45页注意事项1.FPIA结果好坏取决于荧光素标识好坏、激发态荧光平均寿命、抗原相对分子量和复合物特征等原因。2.为提升FPIA灵敏度，可用除蛋白剂对标本进行预处理，除去干扰成份。临床免疫检验的自动化分析专家讲座第46页第四节酶联免疫测定自动化分析临床免疫检验的自动化分析专家讲座第47页酶联免疫测定自动化分析酶联免疫测定自动化分析是将酶联免疫吸附试验（ELISA）各种操作步骤（加样—温育—洗涤—加酶结合物—温育—洗涤—加底物—温育—比色等）进行自动机器操作，实现自动化分析免疫检测系统。依据自动化酶联免疫分析系统处理模式不一样，通常将全自动酶免分析仪分成二类：分体机和连体机。分体机是由“前处理系统”即全自动样本处理工作站和“后处理系统”即全自动酶免分析仪两个独立部分组成。连体机是由多个模块组成，使用一台计算机、一套操作系统实现了从标本稀释、加样到酶标板孵育、洗涤、加试剂、再孵育、洗涤、读数和结果打印全自动过程。临床免疫检验的自动化分析专家讲座第48页仪器组成和性能1.条形码识别系统2.样本架和加样系统3.试剂架4.温育系统5.液路系统6.洗板系统7.酶标板读数仪8.自动装载传递系统9.计算机管理和信息系统临床免疫检验的自动化分析专家讲座第49页加样仪器组成和性能临床免疫检验的自动化分析专家讲座第50页洗板仪器组成和性能临床免疫检验的自动化分析专家讲座第51页全自动酶免分析仪中连体机是将样本处理工作站和全自动酶免分析仪联合起来，工作速度快，自动化程度高，适合大批量样本处理，如血站系统。分体机，因为它有一个独立全自动样本处理站，加样速度快，适合试验项目改变多、样本批量不等临床试验室。仪器评价临床免疫检验的自动化分析专家讲座第52页第五节

临床免疫检验自动化分析选择与应用临床免疫检验的自动化分析专家讲座第53页选择标准1.资质要求：《企业法人营业执照》、《医疗器械注册证》和《医疗器械生产/经营企业许可证》2.性能要求：性能指标（正确度、精密度、最低检测限、线性范围和临床可汇报区间、分析干扰等）；还应考虑检验科内部仪器所组成检测系统一致性和测定结果可比性。3.仪器放置地设施和环境条件4.试验室项目检测速度要求和设备配置5.信息要求6.试验室检测项目标经济效益原因临床免疫检验的自动化分析专家讲座第54页临床应用1.血浆、体液中特定蛋白检测2.甲状腺激素及相关指标检测3.生殖激素检测4.肾上腺和垂体激素检测5.贫血因子检测6.肿瘤标识物检测如AFP、CEA、PSA、fPSA、CA19-9、CA125、CA15-3等。7.感染性疾病免疫学指标检测8.糖尿病免疫学指标检测9.治疗药品浓度检测如茶碱、地高辛、环孢素、苯巴比妥血药浓度测定等临床免疫检验的自动化分析专家讲座第55页

思索题1.什么是免疫检验自动化？应用哪些技术？优点是什么？2.免疫浊度分析原理是什么？有哪些临床应用？3.定时散射比浊法和速率散射比浊法测定原理，其抗原过量检测有什么不一样点？4.免疫比浊分析影响原因有哪些？5.吖啶酯标识化学发光免疫分析仪技术关键点是什么？6.酶联发光免疫分析仪原理是什么？有哪几个类型？各有什么特点？7.电化学发光免疫分析仪测定技术关键点是什么？8.光致发光化学免疫分析仪测定原理和技术关键点是什么？9.时间分辨荧光免疫分析仪测定技术关键点是什么？注意事项有哪些？10.全自动酶免分析仪组成成份有哪些？优点是什么？临床免疫检验的自动化分析专家讲座第56页小结临床免疫检验自动化分析是将免疫学检验过程中取样、加试剂、混合、温育、固相载体分离、信号检测、数据处理、结果汇报和检测后仪器清洗等步骤由计算机控制，仪器自动完成整个免疫检验过程。临床免疫检验自动化分