水产动物基质效应对常用渔药胶体金检测法的影响

水产动物基质效应对常用渔药胶体金检测法的影响前言水产动物中常用渔药残留免疫检测的现状及进展水产动物中渔药残留检测的现状随着人们对食品安全认识的不断提高，食品安全检测也越来越受到重视，药物残留情况也越来越受到人们关注。国际食品法典委员会（CAC）对水产品中多种渔药残留的最高残留限量做出了规定；我国制定的农业部公告的第235号文件也对20种药物的最大残留量做出规定[1]。目前药物残留的检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱-质谱法（GC-MS）、液相色谱-质谱法（LC-MS）以及免疫分析法（IA）等[2]。检测方法中的仪器检测准确精密，但其前处理过程复杂，仪器一般为大型仪器且价格昂贵，在现场检测时受到限制[3]。酶联免疫法、胶体金快速检测法等免疫检测方法的优势日益凸显，成为目前及今后的检测热点。水产动物中渔药残留免疫检测的进展免疫检测技术原理是：通过抗原抗体之间的特异性结合作用实现对目标检测物（抗原或者抗体）的检测。相对于仪器检测方法，免疫检测法具有快速、简捷、特异性强等优点，这使得免疫检测法适用于药物残留的现场检测[4]。目前，免疫检测法已经被广泛的应用到水产品的多种药物残留检测的过程中，如氯霉素[5]、孔雀石绿[6]、硝基呋喃[7]等的检测。整个检测周期包括样品前处理和目标物测定两个阶段，目前测定阶段的免疫检测可以达到简便、快速的效果，胶体金类技术甚至可以缩短到10分钟以内[8]，但是样品前处理阶段，包含组织捣碎、提取净化、高速离心等复杂过程，需要完备的设备且耗时长。除此之外，经过前处理后的样品提取物对快速检测表现出较强的干扰作用[9]，这也限制了免疫检测法在现场检测中的应用。因此，对免疫快速检测的研究，亟需找到优化样品前处理过程的方法，不仅能够使前处理的时间缩短，还要尽可能的减小样品提取物在快速检测中表现出的干扰作用。水产动物中常用渔药残留胶体金免疫检测的应用胶体金快速检测技术是利用抗原和抗体的特异性结合，进而放大实验结果，用肉眼直接观察从而判定检测结果的一种免疫检测技术[10]。目前应用于检验中的免疫胶体金检测技术操作过程简单，可以使许多不同样品的分析过程变得更加快捷，而且胶体金本身具有其特有的酒红色，不需要复杂的仪器即可辨别检测结果，因此在食品现场检测方面受到大范围的推广使用。目前已研发出的胶体金免疫层析试纸大部分只能用来定性检测，而且水产样品中复杂的基质成分对检测结果的基质干扰较大，使得胶体金检测技术在应用中受限。因此亟需简化免疫检测卡的前处理过程，使其在实际检测过程中避免繁琐操作的同时保证检测卡的有效性。免疫检测的基质效应概述基质效应是指除被测物质以外的样本特征，这些样本特征可以影响到被测物质的检测过程以及测定结果。常产生基质干扰的成分为生物样品（如:血清、血浆、尿液、组织等）中的内源性物质，也可能是药物的代谢产物。而对于免疫快速检测，尤其是水产品的免疫检测，基质效应主要来源于样品及其提取物中的蛋白质、碳水化合物、脂质、小分子和盐溶液等组分，这些组分是通过影响抗体和抗原（目标检测物）的特异性结合形成干扰，这种基质效应能降低竞争性免疫检测方法的灵敏度和可靠性，从而影响检测结果的准确性[11]。解决基质干扰的重要因素就在于研究水产样品中基质干扰的影响机理，但目前科研领域针对基质效应的研究还较少，因此对免疫检测过程中基质干扰的研究具有很大的开发潜力。实验研究的目的及意义本论文的研究目的在于：以孔雀石绿、环丙沙星等常见渔药为研究对象，分析测定鱼类样本中的基质干扰组分及其对于胶体金免疫检测法的基质干扰程度，在此基础上分析研究检测过程中的主要干扰组分及作用规律，为相关前处理技术的优化完善以及最大程度提高前处理效率提供一定的理论依据。研究探讨水产品中常见渔药胶体金免疫检测中的干扰基质及其基质影响程度，分析免疫检测过程中基质干扰的主要来源，还可以减少和避免胶体金免疫检测前处理过程的盲目性，从而开发出更有效、简便的消除基质效应的方法，为免疫检测前处理过程的简化和大规模现场检测中的应用提供借鉴。本论文的研究内容与技术路线研究内容本实验选用的孔雀石绿和盐酸环丙沙星为研究对象，对常见的五种鱼（大菱鲆、鲤鱼、鳜鱼、鳙鱼、草鱼）采用胶体金快速检测方法检测两种药物残留，判定基质效应，进一步进行基质组分分析，探索不同基质组分对这两类药物的胶体金快速检测法的影响程度，从而为优化胶体金检测法的前处理过程，为开发出较为有效、简便的消除基质效应的前处理方法提供借鉴。具体研究内容如下：（1）判断基质效应是否存在：探索经过前处理后的五种鱼样（大菱鲆、鲤鱼、鳜鱼、鳙鱼、草鱼）对孔雀石绿和盐酸环丙沙星两类胶体金免疫检测卡是否存在明显的基质干扰。（2）干扰基质组分分析：识别和分析五种鱼样中主要的基质干扰组分。分别对样液中的蛋白质、糖类、脂质和盐离子等主要组分进行定量定性分析。（3）基质干扰的程度分析：通过单因素分析实验分别进行去除蛋白质、脂质等组分的基质干扰进行对照试验，配置类似样液中糖类和离子强度等组分含量的缓冲液进行对照实验，从而分析出不同基质组分对胶体金免疫检测的基质干扰程度。技术路线水产动物基质效应对盐酸环丙沙星胶体金检测的影响引言环丙沙星为广谱抗菌剂，属于喹诺酮类抗菌药物，杀菌效果好。但是环丙沙星具有严重的肝肾毒性，如果人类长时间摄入还会导致对喹诺酮类抗生素产生耐药性，所以2002年我国农业部将该药列为水产养殖禁用药[12]。中华人民共和国农业部公告第783号[13]利用液相色谱检测盐酸环丙沙星的残留，目前利用液相二级质谱[14]（LC-MS-MS）和间接竞争酶联免疫检测[15]的方法都可以测定水产品中环丙沙星的药物残留，能够检测环丙沙星的免疫胶体金检测卡[16]也已经研发成功。然而在水产样品的检测过程中，由于水产动物可食用组织中含有复杂的组分，这些组分在药物残留检测过程中能够产生严重的基质干扰，严重影响了检测结果的准确性。因此本章实验主要探究五种典型性鱼的蛋白质、脂质、糖类、离子强度等样液组分对环丙沙星胶体金检测卡的基质干扰作用，旨在识别和判断在水产动物药物残留胶体金免疫检测过程中主要的基质干扰组分及其干扰程度。实验材料实验仪器设备电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司自动纯水仪北京康铭泰克科技发展有限公司78-1A型磁力搅拌器金坛市双捷实验仪器厂精密pH计上海精密科学仪器0.22μm滤膜密理博生物有限公司低温冰箱青岛海尔电冰柜有限公司组织捣碎机上海标本模型厂涡旋振荡器广州仪科实验室技术有限公司冷冻离心机美国sigma公司电热鼓风干燥箱（DHG-9070A）上海精宏实验设备有限公司惠普G4050扫描仪中国惠普酶标仪芬兰Labsystems公司DYY-7C电泳仪北京六一厂电磁锅先科集团有限公司材料与试剂冰鲜的沙星类阴性鱼肉样品（大菱鲆、鲤鱼、鳜鱼、鳙鱼、草鱼）中国水产科学研究院黄海水产研究所盐酸环丙沙星标准品中国兽医药品监察所环丙沙星胶体金层析试纸卡苏州艾瑞德生物科技有限公司氯化钠 国药集团化学试剂有限公司氯化钾天津市瑞金特化学品有限公司磷酸二氢钾国药集团化学试剂有限公司十二水合磷酸氢二钠天津市瑞金特化学品有限公司十二烷基磺酸钠（SDS）北京索莱宝科技有限公司牛血清白蛋白(BSA)北京索莱宝科技有限公司考马斯亮蓝R-250Fluka公司TEMEDSigma公司标准蛋白（Marker）北京索莱宝科技有限公司丙烯酰胺国药集团化学试剂有限公司磺基水杨酸标准品国药集团化学试剂有限公司其他试剂均为分析纯溶液配制磷酸盐缓冲液（PBS）：称取1g磷酸二氢钾、14.5g十二水合磷酸氢二钠、40g氯化钠、1g氯化钾溶解于5L纯水中，充分溶解后用牛血清蛋白（BSA）标准溶液：5mg/mL蛋白溶液稀释50倍至浓度为0.1mg/mL。12%丙烯酰胺溶液：量取2.4mLA液、1.5mLB液、2.1mL纯水充分混匀，使用前用真空泵抽气30min。5%浓缩胶（蛋白质）：量取0.67mLA液、1.0mLC液、2.3mL纯水、40uLAP、10uLTEMED充分混匀。现用现配。电泳缓冲液（蛋白质）：称取1.0gSDS、3.0gTris和14.4g甘氨酸，加纯水定容至1L，用精密pH计调节pH至8.3。考马斯亮蓝染液：将1ml考马斯亮蓝R250加至50ml甲醇和100ml乙酸的有机溶剂混合液。电泳脱色液（蛋白质）：量取100mL甲醇和100mL乙酸用纯水定容至1L。葡萄糖标准溶液：称取1.0g葡萄糖标准品，用纯水定容至1L上层缓冲液（糖）：称取93g甘氨酸和24.2gTris用纯水定容至1L。外室缓冲液（糖）：称取6.183g硼酸、12.11gTris、0.372gEDTA-Na用纯水定容至1L。12%分离胶（糖）：称取11.25g丙烯酰胺、0.762g甲叉丙烯酰胺、5g蔗糖，用外室缓冲液定容至0.1L。5%浓缩胶（糖）：称取4.75g丙烯酰胺、0.25g甲叉丙烯酰胺，用外室缓冲液定容至0.1L。50%蔗糖溶液：称取1.0g蔗糖溶于1mL纯水。阿利新蓝染色液：将0.5%阿利新蓝溶于2%乙酸。电泳脱色液（糖）：配置2%（V/V）乙酸溶液。盐酸环丙沙星标准溶液：取1.0mg盐酸环丙沙星标准品溶解于10mLPBS，配置成100ug/mL的标准溶液，4℃主要方法鱼肉粗提取液的制备取大菱鲆、鲤鱼、鳜鱼、鳙鱼、草鱼五种鱼肉样本（沙星类阴性样本）的可食用部分，用高速组织捣碎机将鱼肉充分捣碎搅匀，分装至样品袋中，于-20℃称取5.0±0.1g上述组织样本于50mL离心管中，1:1(M/V)加入pH=7.4的PBS缓冲液，涡旋振荡充分混合，4132×g、4℃条件下离心10min，取上清。重复上述操作一次，将两次取得的上清液混匀。基质效应对盐酸环丙沙星胶体金免疫检测影响的确定取1.3.1中鱼肉粗提液和PBS缓冲液各100μL，分别用环丙沙星胶体金检测卡进行检测，对照粗提液与PBS缓冲液的检测结果。样液主要组分对盐酸环丙沙星胶体金检测卡的基质干扰程度分析样液中蛋白质组分对胶体金检测卡的基质干扰程度分析采用考马斯亮蓝法测定五种鱼样粗提液中蛋白质的含量，重复三次。以牛血清蛋白溶液（1mg/mL）为标准蛋白溶液，具体操作参照陆[17]的做法如下：制作蛋白质标准曲线：表1-1蛋白标准曲线Tab.1-1Thestandardcurveofprotein编号123456标准蛋白溶液（uL）04080120160200蒸馏水（uL）20016012080400考马斯亮蓝G-250（uL）200200200200200200以牛血清蛋白的浓度（mg/ml）为横坐标，以吸光度值（595nm）为纵坐标，绘制标准曲线。将样本粗提液稀释至蛋白浓度约为1mg/mL，取40uL稀释液加入200uL考马斯亮蓝，与上述加入考马斯亮蓝的梯度标准蛋白溶液一同置于595nm波长下测定吸光值。从而测定粗提液中蛋白质含量。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析粗提液中蛋白质组成。1）准备待测样本：根据考马斯亮蓝法检测到的鱼样粗提液的蛋白浓度，将粗提液蛋白浓度稀释至约为1mg/mL，取20uL的粗提液稀释液，加入5uL上样缓冲液，振荡均匀，沸水浴加热7min。2）制备聚丙烯酰胺凝胶：制胶器装好1mm制胶板并用纯水检漏。将促凝剂（AP:40uL,TEMED:10uL）加入到抽气完成的12%丙烯酰胺中制成分离胶，迅速混匀后注入胶槽，加水液封；待分离胶凝好后，除去水，将5%浓缩胶迅速加入胶槽并立即插入梳子进行凝胶；待凝胶完成后，加入电泳缓冲液，拔下梳子，将Maker和处理过的待测样液加入样品槽中，完成电泳前准备。3）电泳过程：选用80V初始电压，当示踪剂到达浓缩胶时，改用120V的电压。当示踪剂到达电泳槽底端时终止电泳，回收电泳缓冲液。4）将分离胶从胶板上小心取于培养皿中，使用考马斯亮蓝染色液染色2h，再用脱色液脱色过夜至背景清晰。最后，用扫描仪扫描凝胶，记录结果。样液中蛋白质组分去除及其对胶体金检测卡检测的基质干扰程度。取样本粗提液于85℃水浴加热10min，除去粗提液中的大部分蛋白质[18]使用环丙沙星胶体金检测卡检测经加热和酸处理去除蛋白质后的样液，与原粗提液的检测结果进行对比，分析粗提液中蛋白质组分对胶体金检测卡阴性样本检测过程中的基质干扰程度。样液中脂质组分对胶体金检测卡的基质干扰程度分析使用氯仿-甲醇法检测样液中的脂质含量。参考曹等[19]的实验方法取10mL样品粗提液于烧杯中，加入60mL甲醇，搅拌2min；加入氯仿30mL搅拌均匀，静置2min；使用布氏漏斗抽滤，抽滤后的残渣再用氯仿进行抽提，搅拌均匀后再用布氏漏斗抽滤。将收集的滤液转移到分液漏斗中，加入35mLZn(AC)2（0.5％），充分振荡混合，放置24h。取下层含有提取出脂质的氯仿层，100℃样液中脂质组分的去除及其对胶体金检测卡阴样检测的基质干扰程度。利用硅藻土过滤的方法去除脂质组分：将硅藻土与纯水充分搅拌，悬浊液用布氏漏斗抽滤，形成滤饼，再将样品粗提液进行抽滤，从而除去样液中的脂肪。使用环丙沙星胶体金检测卡检测经去除脂质后的样液，与原粗提液的检测结果进行对比，分析粗提液中脂质组分对胶体金检测卡阴性样本检测过程中的基质干扰程度。样液中糖组分对胶体金检测卡的基质干扰程度分析采用硫酸-苯酚法测定鱼样粗提液中总糖的含量，重复三次。以葡萄糖溶液（1mg/mL）为标准糖溶液，具体操作参考郭等[20]的检测方法：绘制糖标准曲线：室温条件下，避光反应30min，于490nm测定吸光值。表1-2糖标准曲线Tab.1-1ThestandardcurveofSugar编号123456789标准糖溶液浓度（ug/mL）102030405060708090苯酚（mL）111111111浓硫酸（mL）555555555以葡萄糖的浓度（ug/mL）为横坐标，吸光度值（490nm）为纵坐标，绘制标准曲线。取1mL样本粗提液，加入1mL的苯酚，缓慢加入5mL浓硫酸，与上述反应后的标准糖溶液一同置于490nm波长下测定吸光值。从而测定粗提液中总糖含量。12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析糖组分。1）准备待测样本：根据氯仿-苯酚法检测到的鱼样粗提液的总糖浓度，将粗提液糖浓度浓缩至约为20mg/mL，1:1(V/V)加入50%蔗糖溶液，振荡均匀。2）制备聚丙烯酰胺凝胶：制胶器装好1mm玻璃板并用纯水检漏。将促凝剂（APS:15uL,TEMED:5uL）加入5mL12%分离胶中，迅速混匀后注射入胶槽中，加水液封，待分离胶液凝聚，除去水；将促凝剂（APS:20uL,TEMED:15uL）加入1.5mL5%浓缩胶中，迅速混匀后注入胶槽中，插入梳子。待完全凝胶后，将上层缓冲液加入胶槽内槽，外室缓冲液加入胶槽外层；拔下梳子，将处理过的待测样液加入样品槽中，完成电泳前准备。3）电泳过程：选用200V电压进行电泳。电泳约30min，终止电泳。4）将分离胶从胶板上小心取下置于培养皿中，用阿利新蓝染色液染色1h。回收染色液，加脱色液脱色过夜至背景清晰。最后，扫描仪扫描，记录结果。鱼肉中糖的总量因鱼种而异，其中主要的糖类物质是糖原和粘多糖，也含有少量的单糖和二糖，游离糖的成分主要是葡萄糖，鱼死后ATP分解还能够生成游离核糖，磷糖在磷酸戊糖循环和糖酵解途径中发挥重要作用[21]。常见鱼种可食部分肌肉主要的糖组成如下表[22]：表1-3鱼种可食用部分鱼肉的主要糖含量Tab.1-3Themain

sugarcontentofmainediblepartofaquaticproducts鱼种(mg/hg)大菱鲆鲤鱼鳜鱼鳙鱼草鱼核糖25-4026-3536-5211-1526-36葡萄糖36-5237-4852-7515-2353-67磷酸化核糖21-3425-2718-459-1029-42磷酸化葡萄糖32-4736-3832-8513-1535-56α-乳糖9-118-118-129-118-10验证糖组分的基质干扰：根据表中五种鱼肉的糖含量情况，用PBS配置类似鱼样粗提液的鱼多糖模拟液，用环丙沙星胶体金检测卡进行检测，并与原粗提液检查结果进行对比，分析粗提液中的糖组分对环丙沙星胶体金检测卡阴性样本检测过程中的基质干扰程度。样液中离子强度对胶体金检测卡的基质干扰程度分析鱼肉灰分含量约为0.12~0.18%[23]。灰分中主要的金属离子是Na+、Mg2+、Al3+、K+和Ca2+，其含量分别为0.70g/kg-0.94g/kg、0.452g/kg-0.660g/kg、0.052g/kg-0.063g/kg、0.032g/kg-0.041g/kg、0.102g/kg-0.124g/kg[19]。由于不同鱼种离子强度差别较小，配置Na+实验结果与分析胶体金检测卡判读方法：胶体金检测卡是采用竞争法原理检测。阴性：C线显红色，T线比C线显色深或一样深；阳性：C线显红色，T线比C线显色浅；无效：C线完全没有出现，表示测试无效。确定粗提液对环丙沙星检测卡的检测存在基质干扰图1-1环丙沙星胶体金检测卡检测阴性鱼样粗提液的检测结果。（左起：空白；1-5分别代表：大菱鲆；鲤鱼；鳜鱼；鳙鱼；草鱼）Figure1-1.ThecolloidalgolddetectioncardresultsforDifferentcrudefishextractsofnegativesamples.(Fromleft:blank;1-5,representdifferentkindof

fish:Scophthalmusmaximus,Cyprinoid,Mandarinfish,Aristichthys,Grasscarp)如图1-1所示，环丙沙星胶体金检测卡对PBS缓冲溶液的检测结果与阴性鱼样粗提液的检测结果进行对比，后者的T线明显变浅，C线大菱鲆略微变浅，出现假阳性结果，从而可以判断鱼肉粗提液的组分对胶体金检测卡的检测存在明显的基质干扰，很可能是粗提液中复杂的组分影响了抗体和抗原（目标检测物）的特异性结合，因此需要对粗提液中的各个组分进行进一步的分析，并确定其各组分对胶体金检测的影响程度。鱼肉粗提液蛋白组分分析1.考马斯亮蓝法测五种鱼样粗提液的蛋白质含量（见表1-4），并用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析粗提液中蛋白质组分（见图1-2）。表1-4考马斯亮蓝法测得鱼样粗提液的蛋白质含量(n=3)Table1-4Thetotalproteincontentoffishes

extractdeterminedbytheCoomassiebrilliantbluemethod.(n=3)样液种类大菱鲆鲤鱼鳜鱼鳙鱼草鱼蛋白质浓度(mg/ml)21.5±0.718.4±1.023.5±0.924.6±1.030.3±0.4图1-2鱼样粗提液蛋白电泳图谱（蛋白条带分别代表：M：标准蛋白，1-5分别代表不同的鱼样粗提液中蛋白条带：大菱鲆、鲤鱼、鳜鱼、鳙鱼、草鱼。）Figure1-2SDSoffishextracts.（ImagesofSDSlanesshowingM:marker,1-5,representfivedifferentkindsof

fishincrudeextractof

proteinbands:Scophthalmusmaximus,Cyprinoid,Mandarinfish,Aristichthys,Grasscarp.）由表1-4和图1-2所示，蛋白质含量较高，种类较多。在免疫检测过程中，鱼样粗提液中的蛋白质组分能与免疫球蛋白之间发生非特异性相互作用，引起空间位阻效应、失去活性位点，降低抗体与抗原的结合能力[18]。从而，蛋白质对于抗原抗体反应影响比较大，所以推断蛋白可能也是影响胶体金免疫反应的主要因素。2．粗提液85度水浴加热10min去除蛋白质组分，用考马斯亮蓝法检测加热处理后的样液中蛋白质含量（见表1-5）以及聚丙烯酰胺凝胶电泳分析其蛋白组分（见图1-3）。表1-5考马斯亮蓝法测粗提液加热后的蛋白含量Table1-5Thetotalproteincontentof

theheattreatedsamplesolution

determinedbytheCoomassiebrilliantbluemethod.样液种类大菱鲆鲤鱼鳜鱼鳙鱼草鱼蛋白浓度（mg/mL）6.9±0.33.3±0.37.2±0.74.9±0.55.1±0.4图1-3加热处理后不同样本中蛋白质的电泳图谱（蛋白条带分别代表：M：标准蛋白，1-5分别代表不同的鱼样粗提液经加热后的蛋白条带：大菱鲆、鲤鱼、鳜鱼、鳙鱼、草鱼）Figure1-3SDSoffishextractsafterheating.（ImagesofSDSlanesshowingM:marker,1-5,representfivedifferentkindsof

fishincrudeextractof

proteinbandsafterheating:Scophthalmusmaximus,Cyprinoid,Mandarinfish,Aristichthys,Grasscarp.）图1-4加热处理后的样液的检测结果（左起：空白；1-5分别代表：大菱鲆；鲤鱼；鳜鱼；鳙鱼；草鱼）Figure1-4.Thecolloidalgolddetectioncardresultsforheattreatedcrudefishextracts.(Fromleft:blank;1-5,representdifferentkindof

fish:Scophthalmusmaximus,Cyprinoid,Mandarinfish,Aristichthys,Grasscarp)据表1-5以及1-3电泳图可知，85度处理后粗提液中蛋白质含量明显下降，蛋白条带明显减少，因此说明：在经过85度水浴加热10min的加热处理后，粗提液中的大部分蛋白质已经去除，仅有少量残留。大菱鲆样液中的蛋白质在116.0kD和35.0kD附近有少量残留，其他鱼种样液中的蛋白质在35.0kD附近均有少量残留。由图1-4所示，用胶体金检测卡对经加热处理去除大部分蛋白质之后的样液进行检测，与PBS缓冲液的检测结果相比仍有严重的基质干扰。由此分析基质效应可能为残留的少量蛋白质产生，或者由样液中的其他组分产生。需进行进一步的蛋白质去除实验验证分析。3．利用2%磺基水杨酸溶液进一步去除经热处理后样液中的蛋白质，用考马斯亮蓝法检测酸处理后样液中蛋白质含量（见表1-6）以及聚丙烯酰胺凝胶电泳分析其蛋白组分（见图1-5）。表1-6考马斯亮蓝法测粗提液经加热和酸处理后的蛋白含量Table1-5Thetotalproteincontentof

theheatandacidtreatedsamplesolution

determinedbytheCoomassiebrilliantbluemethod.样液种类大菱鲆鲤鱼鳜鱼鳙鱼草鱼蛋白浓度（mg/mL）0.06±0.010.05±0.030.06±0.010.06±0.010.06±0.03图1-5酸处理后样液中蛋白质的电泳图谱（蛋白条带分别代表：M：标准蛋白，1-5分别代表不同的鱼样粗提液经酸处理后的蛋白条带：大菱鲆、鲤鱼、鳜鱼、鳙鱼、草鱼。）Figure1-5SDSofacidtreatedsamplesolution.（ImagesofSDSlanesshowingM:marker,1-5,representfivedifferentkindsof

fishincrudeextractof

proteinbandsafteracidtreating:Scophthalmusmaximus,Cyprinoid,Mandarinfish,Aristichthys,Grasscarp.）图1-6磺基水杨酸对胶体金检测卡的影响图1-7蛋白质去除前后对照图左起：空白；（1）2%磺基水杨酸（调pH=7.0）；（左起为去蛋白前；空白；去蛋白；（2）2%磺基水杨酸（未调pH）1-3分别代表：大菱鲆；鲤鱼；鳜鱼）Figure1-6.Effectof

sulfosalicylicacid

Figure1-7.Thecontrol

chart

of

proteinon

colloidalgolddetection

card.removingbefore-and-after.(Fromleft:blanksampleaddingsulfosalicylic(Fromleft:sampleextractionsolution,acidadjusts

pHto7,sampleaddingsulfosalicylicblank,samplewithoutprotein.1-3,acidwithoutadjustingpH)representdifferentkindsof

fish:Scophthalmusmaximus,Cyprinoid,Mandarinfish)据表1-6和图1-5所示，用2%磺基水杨酸处理加热过程后的样液，样液中蛋白质含量极少，可以证明原有蛋白基本已经被除去（即由样液中的蛋白质组分对胶体金检测卡的检测产生基质干扰的可能性基本去除）。用环丙沙星胶体金检测卡检测蛋白质基本去除的样液，检测结果如下（见图1-7）。由图1-6所示，2%磺基水杨酸（pH=0.65）对环丙沙星胶体金检测卡的正常检测有严重干扰，甚至导致胶体金滞留现象，T线、C线均不显示，试剂卡无效。但将其pH调至7.0左右时，不再存有滞留现象，说明pH值过低对胶体金检测卡的正常检测具有显著影响。因此，用磺基水杨酸处理去除样液中的蛋白后，需将样液的pH调至7.0左右，再用胶体金检测卡检测。由图1-7所示，在蛋白质组分基本去除的情况下（右）T线仍明显变浅，但与未去除蛋白粗提液的检测结果（左）进行对照，T线已有所加深，即假阳性减弱，样液对胶体金检测的基质干扰有所减弱，但仍然存在显著的基质干扰。综上：粗提液中的蛋白质组分是环丙沙星胶体金检测卡阴性样品检测过程中的基质干扰因素，但非最主要的基质干扰因素。鱼肉粗提液中脂质组分分析采用氯仿-甲醇法对粗提液中的脂质含量进行检测，检测结果如下（见表1-7）。由表1-7所示，粗提液中的脂质含量较少，采用硅藻土过滤的方法去除粗提液中的脂质组分后，再采用氯仿-甲醇法检测验证样液中脂质组分的去除情况（见表1-8）。用胶体金检测卡检测去除脂质后的样液，检测结果(见图1-8)。表1-7氯仿-甲醇法检测粗提液中的脂质含量Table1-7Thetotallipidcontentof

thefishes

extracttestedbytheChloroform-MethanolMethod.样液大菱鲆鲤鱼鳜鱼鳙鱼草鱼脂质含量(mg/mL)1.42±0.052.39±0.050.84±0.050.52±0.050.76±0.05表1-8氯仿-甲醇法检测去除脂质后的样液中脂质含量Table1-7Thetotallipidcontentof

samplesolution

thathaveremovalof

lipidtestedbytheChloroform-MethanolMethod.样液大菱鲆鲤鱼鳜鱼鳙鱼草鱼脂质含量(mg/mL)0.23±0.050.14±0.050.10±0.050.31±0.050.12±0.05图1-8胶体金检测卡检测去脂肪后样液检测结果（左起：空白；1-5分别代表：大菱鲆；鲤鱼；鳜鱼；鳙鱼；草鱼）Figure1-8.Thecolloidalgolddetectioncardresultsforsamplesolution

thathaveremovalof

lipid.(Fromleft:blank;1-5,representdifferentkindof

fishincrudeextractof

proteinbandsafterremovinglipid:Scophthalmusmaximus,Cyprinoid,Mandarinfish,Aristichthys,Grasscarp)由表1-8可得，鱼样粗提液经硅藻土过滤后，提取液中的脂质含量很少，可以证明脂质组分基本去除。由图1-8所示，C线显色正常，而T线显色较浅，即假阳性现象显著。由此可知，环丙沙星胶体金检测卡对去除脂质后的样液的检测结果和未去除脂质的样品粗提液的检测结果（图1-1）差别不大，即样液中的脂质组分并不是造成胶体金检测卡假阳性现象出现的主要因素。综上：鱼样粗提液中的脂质组分并非环丙沙星胶体金检测卡检测过程中引起基质干扰的主要因素。鱼肉粗提液中糖组分分析采用硫酸-苯酚法检测五种鱼样粗提液的总糖含量（见表1-7），并用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析糖组分（见图1-8）。表1-9硫酸-苯酚法检测粗提液的糖含量Table1-9Thetotalsugarcontentof

thefishes

extracttestedbytheSulfuricacid-PhenolMethod样液大菱鲆鲤鱼鳜鱼鳙鱼草鱼糖含量(mg/mL)0.98±0.160.82±0.271.59±0.180.72±0.401.39±0.50图1-9鱼样粗提液糖电泳图谱（糖电泳条带1-5分别代表不同的鱼样粗提液中糖条带：大菱鲆、鲤鱼、鳜鱼、鳙鱼、草鱼。）Figure1-9SDSoffishextracts.（ImagesofSDSlanesshowing:1-5,representfivedifferentkindsof

fishincrudeextractof

sugarbands:Scophthalmusmaximus,Cyprinoid,Mandarinfish,Aristichthys,Grasscarp.）由表1-7所示，粗提液中总糖含量较小。对糖电泳图谱进行分析：电泳图未能完全将电泳条带显现出来的原因可能有两个，一是提取液中的部分分子量较小的糖分子已经跑出，未在条带上显示出来；二是原粗提液浓缩程度仍不够，糖浓度含量太低。根据表1-3中鱼种可食用部分鱼肉的主要糖含量，用PBS配置类似鱼样粗提液中糖含量的鱼多糖模拟液，用胶体金检测卡检测，检测结果如下（见图1-10）。由图1-10所示，T线显色明显，按照胶体金检测卡的判读方法，该检测结果表示检测样本为阴性，由此证明：鱼多糖模拟液中的糖组分并未在胶体金检测卡检测过程中引起明显的基质干扰，由此推及到样品粗提液中的糖组分并非引起环丙沙星胶体金检测卡检测阴性样品过程中基质干扰的主要因素。综上:鱼样粗提液中的糖组分并非环丙沙星胶体金检测卡检测阴性样品过程中引起基质干扰的主要因素。图1-10鱼多糖模拟液胶体金快速检测卡检测结果（左起：空白；1-5分别代表：大菱鲆；鲤鱼；鳜鱼；鳙鱼；草鱼）Figure1-10.Thecolloidalgolddetectioncardresultsforfish

polysaccharide

solution.(Fromleft:blank;1-5,representdifferentfivekindsof

kindof

sugar

solution:Scophthalmusmaximus,Cyprinoid,Mandarinfish,Aristichthys,Grasscarp)鱼样粗提液中离子强度分析由于不同鱼种离子强度差别较小，配置Na+、Mg2+、Al3+、K+和Ca2+五种离子含量分别为0.8g/kg、0.5g/kg、0.06g图1-11离子强度模拟液胶体金检测卡检测结果Figure1-11.Thecolloidalgolddetectioncardresultsforfishionicstrength

solution.由图1-11所示，C线显色正常，T线明显变浅，假阳性明显，即粗提液的离子强度模拟液在胶体金检测卡检测过程中能够引起明显的基质干扰，由此推及到样品粗提液中的离子强度可能是引起环丙沙星胶体金检测卡检测阴性样品过程中基质干扰的主要因素。进一步验证离子强度是主要基质干扰因素（见图1-12）。图1-12梯度盐溶液对胶体金检测卡检测结果的影响（左起：空白；1-5分别代表离子强度模拟液的不同稀释倍数：0、5、10、50、100）Figure1-12.The

colloidalgolddetectioncardresultsforThegradientof

saltsolution.(Fromleft:blank;1-5,representdifferenttheionicstrength

simulation:0,5,10,50,100)由图1-12所示，对离子强度模拟液进行5、10、50、100的梯度稀释，检测结果中T线显色逐渐加深，假阳性现象逐渐减弱，胶体金检测卡的检测结果与样液中盐离子含量的变化线性相关性较强。可证离子强度是主要基质干扰因素。图1-13单一盐离子缓冲液对胶体金检测卡检测结果的影响（左起：空白；1-5分别代表不同种类盐离子模拟液：钾、钠、镁、铝、钙）Figure1-13.The

colloidalgolddetectioncardresultsforsingle

saltsolution.(Fromleft:blank;1-5,representthe

differentkindsof

salt

simulation:K,Na,Mg,Al,Ca)图1-14梯度镁溶液对胶体金检测卡检测结果的影响（左起：空白；1-5分别代表镁离子模拟液的不同稀释倍数：0、3、6、30、100）Figure1-14.The

colloidalgolddetectioncardresultsforthegradientof

Magnesiumsolution.(Fromleft:blank;1-5,representdifferentthesimulationofliquid

magnesium:0,3,6,30,100)由图1-13所示，对钾、钙、钠、镁、铝五种盐离子做单因素检测，其中钾、钙、钠、铝盐离子的检测结果与空白相近，T线与C线均显色，且显色程度相同；而镁离子检测结果出现明显假阳性，T线显色明显变浅，因此可推出在样液离子强度模拟液中镁离子对胶体金检测卡有较明显的基质干扰，并通过图1-14进一步验证了镁离子在环丙沙星胶体金检测卡检测过程中的基质干扰作用。综上:鱼样粗提液中的离子强度是环丙沙星胶体金检测卡检测阴性样品过程中引起基质干扰的主要因素，并且在五种大量盐离子中镁离子在环丙沙星胶体金检测卡检测过程中的基质干扰作用明显。水产动物基质效应对孔雀石绿胶体金检测的影响引言孔雀石绿是一种有毒的三苯甲烷类有机化学物，既可以作染料，也可以作为一种高效杀虫剂[24]，曾在水产养殖中得到广泛应用，但长期超量使用可致癌[25]，国家明令在无公害水产养殖领域禁止添加。作为一种抗菌、杀虫剂，孔雀石绿在水产动物体内能够通过一系列新陈代谢等生化过程，使其绝大部分转化为隐色孔雀石绿，这种无色孔雀石绿是脂溶性的，能够在生物体内积累，所以在鱼组织药残检测时我们所检测到的残留物是隐色孔雀石绿。由于孔雀石绿及其代谢产物的药物残留危害很大，我国政府部门对孔雀石绿和无色孔雀石绿的最高残留限量做出严格规定，其残留限量不能超过1ug/kg。目前检测孔雀石绿的胶体金已经研制出来并已投入现场检测中，然而利用胶体金免疫检测阴性样本时检测结果常出现假阳性[26]。因此本章实验主要探究五种典型鱼种待测液对孔雀石绿胶体金检测卡的基质干扰作用。实验材料实验仪器设备氮吹仪Autoscience公司其他仪器设备见前一章材料与试剂冰鲜的孔雀石绿阴性鱼肉样品（大菱鲆、鲤鱼、鳜鱼、鳙鱼、草鱼）中国水产科学研究院黄海水产研究所隐色孔雀石绿标准品Sigma公司孔雀石绿胶体金层析试纸卡深圳市三方圆生物科技有限公司其他试剂均为化学纯溶液配制隐色孔雀石绿标准溶液：取1.0mg隐色孔雀石绿标准品用纯水定容至10mL，配置成100ug/mL的标准溶液。主要方法鱼样待测液的制备取大菱鲆、鲤鱼、鳜鱼、鳙鱼、草鱼五种鱼肉样本（孔雀石绿阴性样本）的可食用部分，用高速组织捣碎机将鱼肉充分捣碎搅匀，分装至样品袋中，于-20℃参照三方圆生物科技有限公司孔雀石绿（组织）快速检测卡使用说明书，对鱼肉样品进行以下处理：称取3±0.05g阴性鱼肉样本于15mL离心管中。加6mL提取剂A，振荡均匀后再加入2g提取剂B，振荡5min使其充分混匀，在20℃取4mL上层有机相至15mL离心管中，加入20uL氧化剂，振荡均匀后再加入4mL净化剂，振荡均匀，静置1min。取3mL下层的紫红色溶液于5mL离心管中，在55℃确定待测液对孔雀石绿检测卡的检测存在基质干扰取2.3.1中阴性样本待测液和PBST溶液各100μL，分别用孔雀石绿胶体金检测卡进行检测，对比待测液与PBST溶液的检测结果。样液中蛋白质组分对胶体金检测卡的基质干扰程度分析采用考马斯亮蓝法测定五种鱼样待测液中蛋白质的含量，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析待测液中蛋白质组成。具体操作方法同样液中离子强度对胶体金检测卡的基质干扰程度分析孔雀石绿阴性鱼肉样本经前处理过程所得的待测液中的盐离子种类及含量需进一步开展实验研究分析，验证1.4所得结果：离子强度是胶体金检测卡的检测过程中主要的基质干扰因素。实验结果与分析确定待测液对环丙沙星检测卡的检测不存在明显的基质干扰图2-1孔雀石绿胶体金检测卡检测阴性待测液的检测结果（左起：0代表空白；1-5分别代表：大菱鲆；鲤鱼；鳜鱼；鳙鱼；草鱼）Figure2-1.Thecolloidalgolddetectioncardresultsfornegativesamplesthattobechecked.(Fromleft:blank;1-5,representdifferentkindof

fish:Scophthalmusmaximus,Cyprinoid,Mandarinfish,Aristichthys,Grasscarp)图2-2待测液加标0.2ppb检测结果。（左起：0代表空白；1-5分别代表：大菱鲆；鲤鱼；鳜鱼；鳙鱼；草鱼）Figure2-2.Thecolloidalgolddetectioncardresultsfornegativesamplesthattobecheckedwithstandard

to0.2ppb.(Fromleft:blank;1-5,representdifferentkindof

fish:Scophthalmusmaximus,Cyprinoid,Mandarinfish,Aristichthys,Grasscarp)图2-3待测液加标0.5ppb检测结果（左起：0代表空白；1-5分别代表：大菱鲆；鲤鱼；鳜鱼；鳙鱼；草鱼）Figure2-3.Thecolloidalgolddetectioncardresultsfornegativesamplesthattobecheckedwithstandard

to0.5ppb.(Fromleft:blank;1-5,representdifferentkindof

fish:Scophthalmusmaximus,Cyprinoid,Mandarinfish,Aristichthys,Grasscarp)如图2-1所示，孔雀石绿胶体金检测卡对阴性鱼样待测液的检测结果和PBST缓冲溶液的检测结果进行对比，T线均显色明显，其检测结果为样本阴性，未出现明显的基质干扰现象，可以判断鱼肉待测液的组分对胶体金检测卡的检测并不存在明显的基质干扰。加标实验进一步验证待测液对孔雀石绿胶体金检测卡的检测不存在明显基质干扰。如图2-2、图2-3所示，在规定的孔雀石绿检出最高限量1ug/kg（1ppb）内，进行0.2ppb、0.5ppb加标实验，孔雀石绿胶体金检测卡对加标待测液的检测结果为：T线显色情况与空白T线相近（孔雀石绿胶体金免疫层析检测卡的检出限为0.2ppb），即与隐性孔雀石绿标准溶液检测结果无明显区别，可以验证待测液组分对孔雀石绿胶体金检测卡的检测不存在明显的基质干扰。根据1.4的实验结果分析，待测液对胶体金检测卡的检测没有明显基质干扰的原因有可能是待测液中的蛋白质、离子强度等基质干扰的因素在孔雀石绿阴性样本待测液中含量较少，因此需对待测液中蛋白质组分、离子强度等因素进行验证分