色谱分离过程课件最终

概述色谱分离过程的基本原理色谱的分类色谱分离过程基础理论色谱技术的应用目前一页\总数七十页\编于二十三点

1.概述-发展关于色谱分离方法的研究始于1901年，俄国植物学家Tswett（茨维特）在研究植物叶子的组成时，用碳酸钙填充竖立的玻璃管，以石油醚洗脱植物色素的提取液，经过一段时间洗脱之后，植物色素在碳酸钙柱中实现分离，由一条色带分散成三种颜色的6个色带。两年后他发表了他的研究成果“一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用”，提出了应用吸附原理分离植物色素的新方法，在这一方法中把玻璃管叫做“色谱柱”，碳酸钙叫做“固定相”，石油醚叫做“流动相”。三年后，他将这种方法命名为色谱法（Chromatography）。目前二页\总数七十页\编于二十三点色谱法于二十世纪五十年代之后飞速发展，并发展出一个独立的三级学科-色谱学。1952年英国科学家阿切尔·马丁、理查德·辛格因发明了分配色谱法而共同获得诺贝尔化学奖，此外色谱分析方法还在12项获得诺贝尔化学奖的研究工作中起到关键作用。目前三页\总数七十页\编于二十三点

1.概述-色谱分离的特点应用范围广复杂混合物，有机同系物，异构体，手性异构体。气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。分离效率高若用塔板理论数来表示色谱柱的效率，每米柱长可达几千至几十万的塔板数，特别适用于极复杂混合物的分离，且通常收率、产率、和纯度都较高。操作模式多样可通过选择不同的操作模式，以适应不同样品的分离。灵敏度高可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。目前四页\总数七十页\编于二十三点2.色谱分离过程的基本原理

色谱分离的几个概念所有的色谱分离操作均分为：装柱、上样、层析、洗脱。其中的固定不动的相，称为固定相；携带试样混合物流过此固定相的流体，称为流动相；作为流动相的液体或气体，称为洗脱剂；洗脱时从柱中流出的溶液，称为洗脱液；加入洗脱剂使各组分分层的操作，叫层析，也叫展开。目前五页\总数七十页\编于二十三点分离原理

色谱过程的本质是待分离物质分子在固定相和流动相之间分配平衡的过程，不同的物质在两相之间的分配会不同，这使其随流动相运动速度各不相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分在固定相上相互分离。不同组分在色谱分离过程中分离情况取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等的差异。目前六页\总数七十页\编于二十三点常用的固定相（色谱柱填料）硅胶活性炭离子交换树脂大孔吸附树脂氧化铝凝胶纤维素衍生物环糊精聚丙烯酰胺目前七页\总数七十页\编于二十三点硅胶：应用广泛，适合各类成分氧化铝：主要用于碱性或中性亲脂性成分，如生物碱、甾体、萜类等活性炭:用于水溶性氨基酸、糖类及苷类聚酰胺：主用于酚类、醌类如黄酮类、蒽醌类及鞣质等成分目前八页\总数七十页\编于二十三点3.色谱的分类按两相状态气固色谱、气液色谱、液固色谱、液液色谱按固定相几何形式柱色谱、纸色谱、薄层色谱按分离原理吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、排阻色谱、亲和色谱目前九页\总数七十页\编于二十三点吸附色谱凝胶过滤色谱离子交换色谱大孔树脂色谱分配色谱色谱分离法目前十页\总数七十页\编于二十三点吸附色谱物理吸附：硅胶、氧化铝、活性炭为吸附剂进行的吸附色谱；化学吸附：黄酮等酚酸性物质被氧化铝吸附、生物碱被酸性硅胶吸附等；半化学吸附：聚酰胺与黄酮类、醌类等酚性化合物之间的氢键吸附，吸附力较弱，介于物理吸附与化学吸附之间。常用的极性吸附剂：硅胶、氧化铝。常用的非极性吸附剂：活性炭。目前十一页\总数七十页\编于二十三点凝胶过滤色谱（凝胶渗透色谱、分子筛滤过色谱、排阻色谱）原理：分子筛作用葡聚糖凝胶（sephadexG）羟丙基葡聚糖凝胶(sephadexLH-20)凝胶过滤色谱目前十二页\总数七十页\编于二十三点目前十三页\总数七十页\编于二十三点离子交换树脂法原理：可交换离子与树脂上的交换基团进行离子交换，并被吸附，用适当的溶剂从柱上洗脱下来，实现物质的分离。吸附规律阳离子交换树脂—分离碱性成分阴离子交换树脂—分离酸性成分目前十四页\总数七十页\编于二十三点大孔吸附树脂吸附性和分子筛原理相结合以苯乙烯为母体，二乙烯苯为交联剂（非极性）吸附力：范德华力或氢键工艺流程：树脂预处理→树脂上柱→药液上柱→树脂的解吸→树脂的清洗、再生。目前十五页\总数七十页\编于二十三点目前十六页\总数七十页\编于二十三点分配色谱原理：被分离成分在固定相和流动相之间的分配系数不同。正相分配色谱：流动相极性<固定相极性反相分配色谱：流动相极性>固定相极性HPLC、MPLC、LPLC目前十七页\总数七十页\编于二十三点4.色谱分离过程理论基础随着色谱技术的发展，为了解释色谱分离现象，指导色谱技术的发展，许多研究者对色谱基础理论进行了不懈的研究，提出了多种色谱过程的理论。主要有速率方程理论、平衡色谱理论、

塔板理论、轴向扩散理论。目前十八页\总数七十页\编于二十三点4.色谱分离过程理论基础塔板理论由马丁（Martin）和欣革（Synge）最早提出将色谱柱比作蒸馏塔，把一根连续的色谱柱设想成由许多小段组成。在每一小段内，一部分空间被固定相占据，而另一部分空间充满流动相。组分随流动相进入色谱柱后，就在两相间进行分配。在每一个塔板内组分分子在固定相和流动相之间形成平衡，随着流动相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板，并不断形成新的平衡。一个色谱柱的塔板数越多，其分离效果就越好。目前十九页\总数七十页\编于二十三点4.色谱分离过程理论基础-保留值保留时间（tR）：从进样到某个组分的色谱峰顶点之间的时间间隔死时间（tM）：不被固定相滞留的组分从进样开始、通过色谱柱、到出现峰最大值所需要的时间。调整保留时间（tR＇）：tR＇=tR－tM保留值是色谱过程的基本热力学参数之一。在相同的操作条件下，不同的物质有各自固有的保留时间，因此它也是色谱定性的基本依据。目前二十页\总数七十页\编于二十三点峰宽Wb：色谱峰拐点处的两条切线与基线的两个交点之间的距离；半峰宽Y1/2：峰高一半处对应的峰宽，为2.35

；相邻色谱峰峰顶之间的距离除以此二色谱峰的平均宽度。用R表示：分离度目前二十一页\总数七十页\编于二十三点定性时要求：R=1.0（相邻两峰分离程度98%）定量时要求：R=1.5（相邻两峰分离程度99.7%，基线分离，作为完全分离的标准）。一般将R≥1作为色谱能较好分离的判据。目前二十二页\总数七十页\编于二十三点柱效率实际工作中，塔板数的计算用下列公式：

而理论塔板数的计算公式为：

n=L/H

其中L为色谱柱的柱长；H为理论板高度。目前二十三页\总数七十页\编于二十三点

考虑到组分在死时间内不参与柱内分配，用调整保留时间代替保留时间，得有效塔板数和有效塔板高度：目前二十四页\总数七十页\编于二十三点5.色谱分离的应用色谱法的应用可以根据目的分为分析性色谱和制备性色谱两大类。分析性色谱的目的是定量或者定性测定混合物中各组分的性质和含量。定性的分析性色谱有薄层色谱、纸色谱等，定量的分析性色谱有气相色谱、高效液相色谱等。制备性色谱的目的是分离混合物，获得一定数量的纯净组分。目前二十五页\总数七十页\编于二十三点5.色谱分离的应用薄层色谱（TLC）气相色谱法（GC）高效液相色谱（HPLC）典型制备色谱目前二十六页\总数七十页\编于二十三点1938年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离一种天然药物。1965年德国化学家Stahl出版了“薄层色谱法”一书，推动了这一技术的发展。因TLC法设备简单，分析速度快，分离效率高，结果直观，很快被用作定性和半定量的方法。70年代中后期发展了高效薄层色谱。80年代以后发展了薄层色谱光密度扫描仪，和各步操作的仪器化，并实现了计算机化。薄层层析流动相的移动是依靠毛细作用。薄层色谱（TLC）目前二十七页\总数七十页\编于二十三点目前二十八页\总数七十页\编于二十三点比移值（Rf值）:用来表征斑点位置的基本参数是保留因子，通常称作比移值，用Rf表示。目前二十九页\总数七十页\编于二十三点显色方法日光下观察,划出有色物质的斑点位置在紫外灯下(254nm或365nm),观察有无荧光的产生,用硅胶G板荧光淬灭法,适用于有紫外吸收的物质，用GF254板显色剂显色,破坏性检出方法目前三十页\总数七十页\编于二十三点常用显色剂硫酸硫酸-水；硫酸-甲醇/乙醇；0.5%碘的氯仿溶液对很多化合物显黄棕色中性0.05%高锰酸钾溶液易还原性化合物在淡红色背景上显黄色碱性高锰酸钾试剂还原性化合物在淡红色背景上显黄色目前三十一页\总数七十页\编于二十三点优点：设备简单、操作方便、运行费用低；分离时间短，工作效率高；展开剂选择范围广，展开方式多样；显色方便，检测手段丰富；既可分析，又可制备；试样一般不需要经过严格预处理即可分离。

缺点：

分离效率较低；不适用挥发性试样分离；定性定量不便。目前三十二页\总数七十页\编于二十三点

TLC的应用1.用于柱层析后相同组分的合并2.有机合成监控反应，摸索最佳条件3.制备有机化合物4.中药材的鉴定在中华人民共和国药典中，共有超过约600种化学合成药和超过约400种中药的质量控制应用了高效液相色谱的方法。

目前三十三页\总数七十页\编于二十三点5.色谱分离的应用薄层色谱（TLC）气相色谱法（GC）高效液相色谱（HPLC）典型制备色谱目前三十四页\总数七十页\编于二十三点1953年阿切尔·马丁和A.T.詹姆斯发明了气相色谱法。目前三十五页\总数七十页\编于二十三点GC：以气体（即载气）为流动相的柱色谱分离技术。GC中常用作的载气的气体有N2、He、H2、Ar，均为惰性气体。GC载气的功能仅仅是携带试样、洗脱组分。GC的选择性主要取决于固定相和组分分子间的作用，所以可通过改变固定相来改变GC的选择性。气相色谱仪-GC目前三十六页\总数七十页\编于二十三点气相色谱仪流程（图）气路系统进样系统分离系统（色谱柱系统）检测系统数据处理和控制系统（含温控系统）目前三十七页\总数七十页\编于二十三点样品进样汽化色谱柱分离检测器信号记录载气目前三十八页\总数七十页\编于二十三点进样系统由进样器和气化室构成。液体样品—微量注射器气体样品—六通阀、微量注射器气化室温度：要保证样品瞬间、完全气化，一般高于沸点50℃以上，但也不宜太高，以防分解目前三十九页\总数七十页\编于二十三点柱温的选择柱温应低于固定液的最高使用温度；柱温过高，易造成固定液流失、检测器噪声变大、基线漂移。柱温一般选择接近或略高于组分的平均沸点。降低柱温可在一定程度内改善分离；升高柱温可加快分析速度。组分复杂，沸程宽（80-100℃）的试样，采用程序升温。目前四十页\总数七十页\编于二十三点对检测器的要求稳定性好、噪声低；灵敏度高；线性范围宽；死体积小，响应快目前四十一页\总数七十页\编于二十三点噪声和漂移噪声（N）：在没有样品进入检测器时，基线在短期内发生的波动。噪声的来源：固定液的流失、载气的不纯，电子元件不稳定、温度变化、外磁场干扰等。基线漂移：基线在一定时间内产生的单向、缓慢移动。良好的检测器其噪声与漂移都应很小。目前四十二页\总数七十页\编于二十三点GC的特点1.优点分离效率高（填充柱上千块塔板）分析速度快样品用量少（检测限低，高灵敏检测器）2.缺点：（约20%样品适用）样品须能气化（350℃下有一定的挥发性）热稳定性要好定性困难目前四十三页\总数七十页\编于二十三点5.色谱分离的应用薄层色谱（TLC）气相色谱法（GC）高效液相色谱（HPLC）典型制备色谱目前四十四页\总数七十页\编于二十三点高效液相色谱仪高效液相色谱是20世纪60年代末发展的一种以液体为流动相的色谱技术。特点如下：高压一般可达（150~350）×105Pa高速一般可达1~10mL/min高效高灵敏度分析时使用样品少一般仅几毫升目前四十五页\总数七十页\编于二十三点高效液相色谱仪流程（图）1．贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）2．高压泵（输液泵）3．进样装置4．色谱柱——分离5．检测器——分析6．废液出口或组分收集器7．记录装置目前四十六页\总数七十页\编于二十三点贮液器高压泵梯度洗脱装置进样器色谱柱记录仪数据处理机检测器组分收集器试样压力表输液系统目前四十七页\总数七十页\编于二十三点流动相脱气的方法超声波振荡脱气惰性气体鼓泡吹扫脱气在线（真空）脱气目前四十八页\总数七十页\编于二十三点HPLC用水专门的纯水机或超纯水机；二次或三次重蒸水；市场上瓶装的纯净水或蒸馏水；其它途径；目前四十九页\总数七十页\编于二十三点流动相溶剂的要求溶剂对于待测样品必须具有合适的极性和良好的选择性。溶剂要与检测器匹配对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。高纯度由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。化学稳定性好低粘度若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙睛等。目前五十页\总数七十页\编于二十三点洗脱方式等度洗脱用恒定配比的溶剂系统洗脱梯度洗脱在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相的浓度配比。优点：缩短分析周期；提高分离效果；改善峰形；增加检测灵敏度。缺点：有时引起基线漂移；重复性不佳。目前五十一页\总数七十页\编于二十三点HPLC色谱柱类型类型内径D(cm)柱长(cm)粒径(µm)分析柱0.3–0.463-253-10半制备柱0.8–1.010-255-20制备柱2.0–5.010-255-20目前五十二页\总数七十页\编于二十三点化学键合相利用化学反应将不同的有机官能团通过共价键键合到载体硅胶表面的游离羟基上而形成的固定相。种类非极性键合相：如键合C18、C8、苯基等，其中十八烷（ODS或C18）键合相是常用的代表，可完成HPLC分析任务的80%。中等极性键合相：如键合醚基，可分离能形成氢键的化合物（如酚类）目前五十三页\总数七十页\编于二十三点评价色谱柱好坏的标准1）理论塔板数n2）拖尾因子Tf3)色谱柱批与批之间的重现性4）pH值的适用范围5）使用寿命目前五十四页\总数七十页\编于二十三点拖尾因子Tf不对称因子(As)=BAA拖尾因子(Tf)=A+B2A10%峰高5%峰高目前五十五页\总数七十页\编于二十三点对理想检测器的要求高灵敏度；适用范围广，对所有组分都有响应；温度、流动相流速的变化对响应没有影响；可梯度洗脱，响应与流动相的组成无关；死体积小；使用方便、可靠、耐用；线性范围宽；响应时间快；目前五十六页\总数七十页\编于二十三点常用检测器紫外检测器（UV）荧光检测器（FD）示差折光检测器（RID）蒸发光散射检测器（ELSD）目前五十七页\总数七十页\编于二十三点紫外检测器（UV）配置最普遍；主要用于检测具有π-π、p–π共轭结构的化合物，如芳烃、稠环芳烃等；灵敏度高；可用于梯度洗脱

缺点：只能检测有紫外吸收的样品；（衍生化解决）对流动相的选择有一定的限制；（截止波长）目前五十八页\总数七十页\编于二十三点荧光检测器（FD）适用于能产生荧光的化合物；主要用于氨基酸、多环芳烃等样品；灵敏度极高（比紫外高1~3个数量级），适用于痕量分析；可梯度洗脱

缺点：许多化合物不产生荧光（可衍生化解决）；目前五十九页\总数七十页\编于二十三点示差折光检测器（RID）通用性好；对糖类分析灵敏度尚可；缺点：灵敏度低（比紫外低3个数量级）；不能梯度洗脱（否则，基线会漂移）目前六十页\总数七十页\编于二十三点蒸发光散射检测器（ELSD）20世纪90年代新开发；是示差折光检测器的理想替代品，对葡萄糖最小检出量5ng；高灵敏；可梯度洗脱；缺点：对有紫外吸收的样品，检测灵敏度较低；目前六十一页\总数七十页\编于二十三点检测器比较

紫外

荧光示差折光蒸发光散射测量参数吸光度荧光强度折射率质量类型选择型选择型通用型通用型梯度洗脱可以可以不可以可以最小检出量约1ng约1pg约1μg0.1~10ng目前六十二页\总数七十页\编于二十三点HPLC定性、定量分析定性分析利用保留值定性；色谱-光谱联用定性；

利用馏分收集器收集后，再用光谱定性；定量分析归一化少用外标法内标法目前六十三页\总数七十页\编于二十三点HPLC与GC比较GC：适于能气化、热稳定性好的样品；约占有机物的20%；HPLC：不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的样品均可检测，约占有机物的80%。目前六十四页\总数七十页\编于二十三点5.色谱分离的应用薄层色谱（TLC）气相色谱法（GC）高效液相色谱（HPLC）典型制备色谱目前六十五页\总数七十页\编于二十三点典型制备色谱制备色谱是适应科技和生产需要发展起来的一种新型、高效、节能的分离技术，目前在