蛋白质与蛋白质相互作用研究方法加实例演示文稿

蛋白质与蛋白质相互作用研究方法加实例演示文稿目前一页\总数四十页\编于十七点优选蛋白质与蛋白质相互作用研究方法加实例目前二页\总数四十页\编于十七点酵母双杂交系统目前三页\总数四十页\编于十七点1.1酵母双杂交技术的原理

酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。他的产生是基于对酵母转录因子GAL4性质的研究.

基因转录不仅需要有特定的DNA顺式序列结构，而且也需要有反式转录激活因子的参与。转录激活因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中有DNA结合结构域(DNAbindingdomain,

DB)和转录激活结构域(activationdomain,

AD),它们都是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的BD或AD都不能激活基因转录，但不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。目前四页\总数四十页\编于十七点

如果要研究两个蛋白之间有无相互作用，可以把这两个蛋白分别与DB和AD形成的融合蛋白。与DB融合的蛋白称为“诱饵”(bait)，与AD融合的蛋白称为“猎物”(prey)。

如果这两个蛋白能发生相互作用,这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子,从而激活报告基因(reportergene)的转录与表达。

通过检测报告基因的表达产物,可判别“诱饵”和“猎物”这两个蛋白质之间是否存在相互作用。

目前五页\总数四十页\编于十七点1.1酵母双杂交技术的原理目前六页\总数四十页\编于十七点同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。目前七页\总数四十页\编于十七点1.2酵母双杂交操作主要流程1.

分别构建BD和AD融合蛋白载体2.

分别将重组载体转化酵母菌细胞3.

对酵母转化子进行自激活检测4.

将重组载体共转化酵母菌细胞5.

检测报告基因表达产物6.

分析酵母双杂交实验结果BDADBDADBDADxY目前八页\总数四十页\编于十七点IdentificationandCharacterizationofFAM124BasaNovelComponentofaCHD7andCHD8ContainingComplex实例Method：ForyeasttwohybridstudieswegeneratedtheconstructsFAM124B-1,3-pGADT7(transcriptvariant1)andFAM124B-1,2-pGADT7(transcriptvariant2)FAM124B-1,3-pGBKT7(transcriptvariant1,FAM124B-1,2-pGBKT7(transcriptvariant),Thesebothplasmidswereco-transformedintoY2HGoldstraincellstogetherwitheithertheCHD7-CR1-3-pGBKT7(aminoacids1591-2181)ortheCHD8-pGBKT7(aminoacids1789–2302)plasmids.TserendulamBatsukh,YvonneSchulz,et.al.IdentificationandCharacterizationofFAM124BasaNovelComponentofaCHD7andCHD8ContainingComplex.PLoSOne.2012;7(12):e52640目前九页\总数四十页\编于十七点Yeasttwohybridassay.DirectyeasttwohybridexperimentwiththeconstructsFAM124B-1,3-pGADT7(fulllengthtranscriptvariant1)andCHD7-CR1-3-pGBKT7(aminoacids1591-2181,demonstratingnodirectinteractionbetweenFAM124Btranscriptvariant1andtheCHD7part,while(B)DirectyeasttwohybridexperimentwiththeconstructsFAM124B-1,3-pGADT7(fulllengthtranscriptvariant1)andCHD8-pGBKT7(aminoacids1789–2302,showsadirectinteraction.ThesameexperimentswereperformedforFAM124Btranscriptvariant2.(C)DirectyeasttwohybridexperimentwiththeconstructsFAM124B-1,2-pGADT7(fulllengthtranscriptvariant2)andCHD7-CR1-3-pGBKT7(aminoacids1591-2181,(D)DirectyeasttwohybridexperimentwiththeconstructsFAM124B-1,2-pGADT7(fulllengthtranscriptvariant2)andCHD8-pGBKT7(aminoacids1789–2302,FAM124Btranscriptvariant2interactsdirectlywiththeCHD8part,whilenodirectinteractionwiththeCHD7partcouldbeobserved.目前十页\总数四十页\编于十七点酵母双杂交系统是一种在酵母细胞内分析蛋白质相互作用的技术。主要有二类载体:a含DNA-bindingdomain的载体;b含Transcription-activatingdomain的载体。另外还需要特殊的酵母菌株如GAL4缺陷型。1.3应用

它可用于：检验蛋白质间的相互作用；分析蛋白质相互作用的结构域；发现新的作用蛋白质。目前十一页\总数四十页\编于十七点1.4酵母双杂交技术的优点：是一种细胞内蛋白质相互作用研究技术，比体外的蛋白质相互作用技术更接近生物体内的真实情况。基于基因重组技术和分子遗传学的原理，更便于观察和检测实验结果。酵母菌是一种低等真核微生物，能反映真核生物的基本生命现象和规律。4.酵母菌生长迅速、容易培养，便于进行高通量、大规模的组学研究。目前十二页\总数四十页\编于十七点1.5酵母双杂交技术的弱点：1.假阳性：自激活、多因子参与……假阴性：毒性蛋白、膜蛋白、难表达的蛋白……低等真核细胞不能完全等同于高等真核生物的情况

酵母双杂交实验的结果必须经过多方面的验证，包括：体外相互作用验证体外亲和纯化（GSTpull-down）、体外免疫共沉淀……哺乳动物细胞内验证亚细胞共定位、体内免疫共沉淀……目前十三页\总数四十页\编于十七点优点：生理条件下的结合缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用二、免疫共沉淀2.1定义及原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。目前十四页\总数四十页\编于十七点2.2方法1)收获培养的细胞（1×107－1×108）冷PBS洗涤2次2）细胞裂解液裂解细胞，冰浴30min3)12000rpm离心30min4）收集上清并加入适量抗体，4ºC摇动1h～过夜5）加入ProteinA/G-Sepharose(琼脂糖凝胶)悬液，4ºC摇动1h6）细胞裂解液洗涤ProteinA/G-Sepharose混合液7）离心弃上清8）沉淀加2×蛋白LoadingBuffer煮沸5－10min9）离心，上清液跑SDS胶10）考马氏亮兰染色、银染

WesternBlot质谱分析目前十五页\总数四十页\编于十七点3.注意事项1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或TritonX-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种蛋白酶酶抑制剂，如商品化的cocktailer。2）使用明确的抗体，有的抗体不适宜做免疫共沉淀。3)对照实验的设计。目前十六页\总数四十页\编于十七点IdentificationandCharacterizationofFAM124BasaNovelComponentofaCHD7andCHD8ContainingComplex实例(A)Usingtheanti-CHD8(abcam,ab84527)ortheanti-CHD7(abcam,ab31824)antibodyforprecipitation,wedetectedwiththeanti-HAantibody(Roche)anapproximately51kDabandcorrespondingtotheestimatedsizeofFAM124Btranscriptvariant1.Lane1:co-transfectedCo-IP,lane2:untransfectedHeLacellsasnegativecontrol.目前十七页\总数四十页\编于十七点三、GSTpull—down技术3.1定义及原理—定义：该技术是通过以适当标签和目的基因进行融合表达作为诱饵．从细胞提取物中钓出与目的蛋白相互作用的蛋白。多组分蛋白质复合物的分离主要利用固定在琼脂糖树脂的反标签系统完成。—原理：将诱饵蛋白质和用谷胱甘肽-s-转移酶(glutathione-transferase，GST）标签融合表达，一步纯化后与含有目的蛋白质的溶液进行孵育．利用谷胱甘肽琼脂糖球珠将GST-融合蛋白-目的蛋白复合物沉淀下来，然后进行聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS—PAGE)鉴定与诱饵蛋白质相互作用的蛋白质

两种应用：

1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用

2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用目前十八页\总数四十页\编于十七点3.2方法：

1）GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a,单一明确的重组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；c,体外翻译cDNA表达得到的未知蛋白）

2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应4ºC2h3）离心弃上清

4）沉淀加入2×蛋白LoadingBuffer煮沸，离心

5）取上清进行SDS电泳，

6）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做WesternBlot来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白注意：该实验设立GST对照，反应均在4ºC进行目前十九页\总数四十页\编于十七点右边为GST对照目前二十页\总数四十页\编于十七点3.3GST融合蛋白沉降实验结果CK2α′GST-TP1GST

Fig10GSTpulldownassayM:proteinmolecularweightstandardLane1:GSTLane2:GST-TP1+CK2α′Lane3:CK2α＇目前二十一页\总数四十页\编于十七点3.4GSTpull-down技术优缺点优点：融合蛋白亲具有高通量性、高选择性的特点，由于融合蛋白的多样性以及表达系统的多样性(如细菌、果蝇、哺乳动物)，该方法能够研究蛋白质在复杂体系中的相互作用。缺点：该方法的成功应用取决于是否能够得到足够多，并且保持蛋白质活性的重组融合蛋白，以及如何避免内源性诱饵蛋白的干扰。目前二十二页\总数四十页\编于十七点四、荧光共振能量转移（FRET）

Fluorescenceresonanceenergytransfer4.1荧光信号的产生

荧光基团在某波长的激发光刺激下，产生一个更长波长的发射光。目前二十三页\总数四十页\编于十七点4.2什么是FRET?

荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。目前二十四页\总数四十页\编于十七点4.3绿色荧光蛋白

60年代，Shimomura等首先从水母（AequoriaVictoria

）中分离出一种水母发光蛋白(aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母中提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白GFP,

后经研究表明，在水母体内Ca2+和肠腔素与水母发光蛋白结合后，水母发光蛋白产生蓝色荧光，GFP在蓝光的激发下，产生绿色荧光。目前二十五页\总数四十页\编于十七点目前二十六页\总数四十页\编于十七点

人们在GFP基因的基础上已经制造出蓝色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，青色荧光蛋白，又发现了红色荧光蛋白。其中兰色荧光蛋白和绿色荧光蛋白，青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白之间可以发生荧光共振能量转移目前二十七页\总数四十页\编于十七点Tsien&Miyawaki采用FRET技术检测细胞内Ca2+的浓度变化。他们将CFP和YFP分别于钙调蛋白和钙调蛋白结合肽融合表达于同一个细胞内。当细胞内具有高的Ca2+浓度时，钙调蛋白和钙调蛋白结合肽结合，可诱发FRET，使受体蛋白YFP发出黄色荧光，因此细胞呈黄色。当细胞内Ca2+浓度低时，FRET几乎不发生，因此检测时CFP被激发，发出绿色荧光，细胞呈绿色。目前二十八页\总数四十页\编于十七点4.4应用在生命科学领域，FRET技术是检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。正如前述，当供体发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重叠，并且两个探针的距离在10nm范围以内时，就会产生FRET现象。而在生物体内，如果两个蛋白质分子的距离在10nm之内，一般认为这两个蛋白质分子存在直接相互作用。目前二十九页\总数四十页\编于十七点五、双分子荧光互补技术（BiFC）

(BimolecularFluorescenceComplementation)基本原理：方法利用绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)及其突变体的特性作为报告基因，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接.如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光.在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱等情况。目前三十页\总数四十页\编于十七点将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段分别与目标蛋白连接.如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光目前三十一页\总数四十页\编于十七点IdentificationoftheSIRTUIN1(SIRT1)-bindingdomainofBMAL1.

BindingofSIRT1toBMAL1deletionmutantswasanalyzedbybimolecularfluorescencecomplementation(BiFC).COS7cellsweretransfectedwithplasmidsencodingSIRT1-N-terminalofVenus(VN)andBMAL1-C-terminalofVenus(VC)wildtype(WT)oritsvariousmutants(Δnuclearlocalizationsequence[NLS],BMAL1withoutafunctionalnuclearlocalizationsignal;Δbasic-helix-loop-helix[bHLH],encodingBMAL1Δ71to140;ΔPer-Arnt-Sim[PAS]-A,BMAL1Δ210to320;ΔPAS-B,BMAL1Δ350to480;Δtranscriptionalactivationdomain[TAD],BMAL1Δ553to625).Theimageswerecapturedbyfluorescenceimagingmicroscopyusingspecificfiltersetsforyellowfluorescentproteinandredfluorescentprotein.目前三十二页\总数四十页\编于十七点六、蛋白质芯片技术

蛋白质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的相互作用。将荧光标记的探针蛋白与蛋白质芯片孵育，洗脱非特异性结合的蛋白后，可以通过扫描芯片上的荧光点检测到稳定的相互作用蛋白点。目前三十三页\总数四十页\编于十七点GongW.etal.(2008)MolecularPlant1:27-41.目前三十四页\总数四十页\编于十七