十三酶的浓缩干燥结晶

模块三、酶的分离纯化酶制剂生产技术生物化工学院杨芳

浓缩与干燥都是酶与溶剂（通常是水）分离的过程。在酶的分离纯化过程中是一个重要的环节。

蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发，使溶液得以浓缩的过程。由于酶在高温条件下不稳定，容易变性失活，故酶液的浓缩通常采用真空浓缩。即在一定的真空条件下，使酶液在60℃以下进行浓缩。引入学习情境十三酶的浓缩、干燥、结晶工作任务（一）酶的浓缩工作任务（二）酶的干燥工作任务（三）酶的结晶酶的浓缩、干燥与结晶

减压蒸发浓缩的简易装置1蒸馏瓶2毛细管3螺旋夹4橡皮管5温度计6出水口7冷凝器8进水口9连接管10抽气口11接收瓶蒸发浓缩

酶的浓缩工作任务（一）酶的浓缩通常采用的减压蒸发法和实验室常用的超蒸发法，都因效率低、费时等在工业上很少应用。目前，工业上应用较多的是薄膜蒸发法。薄膜蒸发法，即将待浓缩的酶溶液在高度真空下转变成极薄的液膜，液膜通过加热而急速汽化，经旋风汽液分离器，将蒸汽分离、冷凝而达到浓缩目的。薄膜蒸发器有：升膜式、降膜式、刮膜式、离心式等多种。根据物料不同而加以选择。酶的浓缩酶的浓缩、干燥与结晶

工作任务（一）酶的浓缩超滤浓缩

超滤(ultrafiltration)浓缩是在加压的条件下，将酶溶液通过一层只允许小分子物质选择透过微孔半透膜．而酶等大分子物质被截留，从而达到浓缩的目的。如果采用不同孔径的膜，同时又具有分级分离的作用酶的超滤浓缩

酶的浓缩酶的浓缩、干燥与结晶

工作任务（一）酶的浓缩优点：不需加热，更适用于热敏物浓缩；无相变化、设备简单、操作方便；能在广泛的pH条件下操作等，因此，近年来发展很快。酶的浓缩酶的浓缩、干燥与结晶

工作任务（一）酶的浓缩胶过滤浓缩：利用葡聚糖凝胶等的吸水特性。将干胶直接加入样品溶液，吸水膨润后，再过滤或离心分出浓缩的酶液。酶的浓缩酶的浓缩、干燥与结晶

工作任务（一）酶的浓缩聚乙二醇浓缩：

聚乙二醇（polyethyleneglycol），简称PEG。利用PEG的吸水特性。将PEG涂于装有酶溶液的透析袋上，置于4℃下，干PEG粉末吸收水和盐类，酶溶液即被浓缩。一般用分子量大的PEG,如PEG6,000和PEG20,000，以防止PEG进入蛋白质溶液。酶的浓缩酶的浓缩、干燥与结晶

工作任务（一）酶的浓缩反复冻融浓缩利用酶溶液相对于纯水冰点较低的原理使酶分子与小分子物质分离。酶的浓缩酶的浓缩、干燥与结晶

工作任务（一）酶的浓缩酶的干燥

酶的干燥多采用冷冻干燥法。

在较低温度下（-10℃-50℃）将酶溶液冻结成固态后抽真空，然后在高度真空条件下，将其中固态水分直接升华为气态而除去，最后酶呈干粉状。也称酶的升华干燥。采用这种方法能使多种酶活性长期保存。酶的干燥酶的浓缩、干燥与结晶

工作任务（二）酶的干燥注意几个问题：首先被冻的最好是酶的水溶液。如果混有有机溶剂，会降低水的冰点，在干燥时,样品融化而起泡导致酶变性，同时，会使真空泵失效。其次，如果混有磷酸盐，在冷冻干燥时会引起pH的变化，例如：PH7的磷酸盐在冷冻时由于磷酸二氢钠会结晶析出，在溶液完全冷冻以前，pH便变成3.5左右。因此，在冷冻前，需将酶溶液脱盐。酶的干燥酶的浓缩、干燥与结晶

工作任务（二）酶的干燥酶的结晶

结晶（Crystallization）是指物质以晶体的状态从蒸汽或溶液中析出的过程。是指分子通过氢键、离子键或分子间力按规则并且周期性排列的一种固体形式，由于各种分子间形成结晶的条件不同，也由于变性蛋白质和酶不能形成结晶，因此，结晶既是一种酶是否纯净的标志，又是一种酶和杂蛋白分离的方法。

酶的结晶酶的浓缩、干燥与结晶

工作任务（三）酶的结晶结晶的基本原理结晶形成的过程是自由能降至最小的过程。当自由能降至最小并逐渐达到平衡状态时，溶质分子开始结晶作用。当溶液处于过饱和状态时，分子间的分散或排斥作用小于分子间的相互吸引作用，便开始形成沉淀或结晶，由于溶液的过饱和，维持水合物的水分子相对减少而且不足，溶质分子相互接触机会增加而聚集.但是,当溶液过饱和的速度过快时，溶质分子聚集太快，便会产生无定形的沉淀。如果控制溶液缓慢地达到过饱和点．溶质分子就可能排列到晶格中，形成结晶。酶的结晶酶的浓缩、干燥与结晶

工作任务（三）酶的结晶注意：第一，要调整溶液，使之缓慢地趋向于过饱和点；第二，调整溶液的性质和环境条件．使尽可能多的溶质分子相互接触，形成结晶。酶的结晶酶的浓缩、干燥与结晶

工作任务（三）酶的结晶结晶条件酶蛋白分子形状和理化性质较复杂，使之在溶液中的特性也变得复杂,影响其最小溶解度的因素也很多，如电解质的浓度、酶蛋白的浓度、pH、温度等因素；(1)酶的纯度一般来说，酶越纯，越容易获得结晶，长成单晶的可能性也越大。除个别情况外，一般酶纯度应达到50％以上.(2)酶蛋白的浓度对大多数酶来说，蛋白质浓度在3—50mg/ml较好。一般来说,酶蛋白浓度越高，有利于分子间相互碰撞而聚合，但是酶蛋白浓度过高,往往形成沉淀;酶蛋白浓度过低，不易形成晶核。酶的结晶酶的浓缩、干燥与结晶

工作任务（三）酶的结晶(3)晶种有些不易结晶的酶，需加入微量的晶种才能形成结晶.在加入晶种前，要将溶液调整到适于结晶条件下，加入的晶种开始溶解，还要追加沉淀剂．直到晶种不溶解为止.当达到晶种不溶解又没有无定形物形成时，静置，促进晶体生长。酶的结晶酶的浓缩、干燥与结晶

工作任务（三）酶的结晶(4)温度结晶温度，一方面要有利于结晶的生成；另一方面要不超过酶的热稳定性。有些酶对温度很敏感，因此要防止酶失活.从现有资料来看，一般控制在0-4℃范围内，通常在4℃下。低温条件对酶不仅溶解度降低，而且酶不易变性。(5)pHpH是酶结晶的一个重要条件．有时只相差0.2pH单位时，只能得到沉淀，而得不到结晶，所选择pH应在酶的稳定范围内，一般选择在被结晶酶的pI值附近。酶的结晶酶的浓缩、干燥与结晶

工作任务（三）酶的结晶(6)金属离子许多金属能引起或有助于酶的结品。不同酶选用不同金属离子.在酶结晶过程中常用Ca2+、Zn2+、Co2+、Ni2+、Cd2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+等金属离子。在许多情况下，这些离子是酶表现活力所必需的，它们能保持酶分子结构上的一些特点.酶的结晶酶的浓缩、干燥与结晶

工作任务（三）酶的结晶结晶的方法

1.盐析结晶法;2.有机溶剂结晶法；

3.等电点结晶法

透析平衡等电点结晶气相扩散等电点结晶酶的结晶酶的浓缩、干燥与结晶

工作任务（三）酶的结晶4透析平衡结晶法将酶液装进透析袋，对一定浓度的盐溶液进行透析，使酶液逐步达到过饱和状态而析出结晶的过程。前提：酶液要达到一定纯度（经过纯化）。酶液要浓缩到一定浓度。5温度差结晶法、金属离子复合结晶法酶的结晶酶的浓缩、干燥与结晶

工作任务（三）酶的结晶酶制剂通常有下列四种剂型：1、液体配制剂包括稀酶液和浓缩酶液。一般除去固体杂质后．不再纯化而直接制成．或加以浓缩而成。这种酶制剂不稳定，且成分复杂，只用于某些工业。2、固体配制剂发酵液经杀菌后直接浓缩或喷雾干燥制成。有的加入淀粉等填充料，用于工业生产。有的经初步纯化后制成，如用于洗涤剂、药物生产。用于加工或生产某种产品时，务须除去起干扰作用的杂酶，才不会影响质量。固体酶制剂适于运输和短期保存，成本也不高.酶的浓缩、干燥与结晶

工作任务（三）酶的结晶3、纯配制剂包括结晶酶，通常用作分析试剂和医疗药物。要求较高的纯度和一定的活力单位数。医疗注射酶，